专利名称：一种复合益生菌喷施剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及的是微生物领域，具体的说是一种复合益生菌喷施剂的制备方法。
背景技术：
微生物叶面肥是微生物肥料的一种，是喷施于植物表面的含有活微生物的特定制品，使用的目的在于增加肥料来源、调节植物体环境微生物平衡、改善植物体营养代谢水平，促进植物的生长，提高抗病虫害的能力。随着人们对可用作微生物肥料的微生物种类的逐渐探明，固氮菌、芽孢杆菌、光合细菌以及纤维分解菌、乳酸菌、酵母菌、放线菌等多种微生物均可用作开发微生物肥料。并且，不同微生物种类在作为微生物肥料的促生长机理不同，功能也有所差异，因此，探讨复合菌群用作微生物肥料是有效的解决途径。但是，在复合微生物的生产过程中，由于菌种复杂，条件限制因素多，因此，开发安全有效的生产方法是解决复合微生物生产的重要研究课题。本发明针对上述问题，基于目前有关生物肥料的有效微生物研究结果，开发了多种功能性微生物复合组合的针对性生产方法，解决复合微生物肥料生产困难的问题。其产品具有功能效果稳定、全面的特性，生产方法具有成本低、效果好、可操作性强的特定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种复合益生菌喷施剂的制备方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种复合益生菌喷施剂的制备方法1)复合菌种的增值培养将产朊假丝酵母、乳酸链球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、慢生大豆根瘤菌、生脂固氮螺菌、沼泽红假单孢菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和圆褐固氮菌分别按重量百分比-4%的接种量分别在各自的培养基中进行增殖培养，直至对数生长期。2)复合微生物的发酵物将上述分别增殖培养的产朊假丝酵母、乳酸链球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌混合，而后将混合后菌种按照重量百分比3% -4%接种于液体发酵培养基中，在25-37°C下，发酵培养48-7池，所得发酵物再与分别上述培养至对数生长期的慢生大豆根瘤菌、生脂固氮螺菌、沼泽红假单孢菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和圆褐固氮菌混合得复合微生物的发酵物，混合比例为共同发酵物占40%，每单一培养细菌分别占 10% ；3)喷施剂将上述所得复合微生物的发酵物稀释后即为喷施剂。所述步骤1)中各菌种的培养基分别为产朊假丝酵母的培养基马铃薯浸粉3g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，蒸馏水加至 IOOOmL, 121 °C高压灭菌20分钟；乳酸链球菌的培养基葡萄糖2%，蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母膏0.5%，磷酸氢二钾0. 2 %，乙酸钠0. 5 %，柠檬酸铵0. 2 %，硫酸镁0. 058 %，硫酸锰0. 025 %，琼脂1. 5-2%, pH6. 5ο 121°C高压灭菌 20 分钟;嗜酸乳杆菌的培养基葡萄糖2%，蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母膏0.5%，磷酸氢二钾0. 2 %，乙酸钠0. 5 %，柠檬酸铵0. 2 %，硫酸镁0. 058 %，硫酸锰0. 025 %，琼脂 1. 5-2%, pH6. 5ο 121°C高压灭菌 20 分钟;枯草芽孢杆菌的培养基蛋白胨10g，琼脂20g，氯化钠5g，肉浸粉10g，水加至 IOOOmL, pH7. 2。121°C 高压灭菌 20 分钟；生脂固氮螺菌的培养基甘露醇10g，酵母膏lg, K2HPO4 0. 15g，NaClO. llg, Rh溶液 4ml，琼脂 20g,蒸馏水 IOOOmL, ρΗ6· 8 7. 0 ；巨大芽孢杆菌的培养基牛肉膏5g，蛋白胨5g，氯化钠(NaCl) 5g，蒸馏水IOOOmL, ρΗ6· 8 7· 2 ；慢生大豆根瘤菌培养基甘露醇10g、K2HP04 0. 5g、酵母粉0. 4g、MgS04 ·7Η20 0. 2g、 NaCl 0. lg、CaCl2 · 6H20 0. lg、蒸溜水 1000mL、pH6. 8-7. 0。121°C高压灭菌 20 分钟。沼泽红假单孢菌培养基酵母粉0. 3%，蛋白胨0. 3%，硫酸镁0. 05%，氯化钙 0. 03%，蒸馏水 IOOOmL, pH6. 8-7.0 ；121°C高压灭菌 20 分钟。胶质芽孢杆菌培养基蔗糖10g，酵母膏0. 2g，(NH4) SO4 0. 5g，MgSO4 0. lg, KC10. lg, Na2HPO4 0. lg, CaCO3 1. 0g，蒸馏水 IOOOmL, ρΗ7· 0。121°C 高压灭菌 20 分钟；圆褐固氮菌培养基葡萄糖10g, KH2PO4 0. 2g，MgSO4 · 7H20 0. 2g，NaCl 0. 2g， CaSO4 · 7H20 0. 2g, CaCO3 5. 0g，蒸溜水 lOOOmL，pH7. 0-7. 2，113°C灭菌 30 分钟。所述1 溶液为NaMo045g，H3B045g,蒸馏水lOOOmL，pH3. 0。所述步骤2~)中的液体发酵培养基为葡萄糖？^，蛋白胨丨^，牛肉膏丨^，酵母膏0.5%。上述菌株均购自中国农业微生物菌种保藏中心，其产朊假丝酵母于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC20060 ；乳酸链球菌于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC10653 ；嗜酸乳杆菌于中国工业微生物菌种保藏中心的编号为CICC6005 ；枯草芽孢杆菌于中国工业微生物菌种保藏中心的编号为CICC20037 ；慢生大豆根瘤菌于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC15402 ；生脂固氮螺菌于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC10481 ；沼泽红假单孢菌于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC10649 ； 巨大芽孢杆菌于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC(^991 ；胶质芽孢杆菌于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC02983 ；圆褐固氮菌于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC10098。本发明所具有的优点1.本发明叶面喷施剂采用复合微生物肥料的菌种复合组合，该组合可协调发挥促生长作用，具有功能互补性；2.本发明叶面喷施剂有利于发酵，pH值在4. 5-7. 5之间，活微生物数量在30亿/ mL以上，微生物活力稳定；3.本发明叶面喷施剂的效果良好，效果试验表明，可提高蔬菜的品味、产量，其产量可以提高5. 0% -10. 0% ；同时可延长花卉的观赏期和草坪绿期8-10天。
具体实施例方式实施例1
1)复合菌种的增值培养将产朊假丝酵母、乳酸链球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、慢生大豆根瘤菌、生脂固氮螺菌、沼泽红假单孢菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和圆褐固氮菌分别按重量百分比3%的接种量分别在各自的培养基中进行增殖培养，直至对数生长期。2)复合微生物的发酵物将上述分别增殖培养的产朊假丝酵母、乳酸链球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌按体积比1 :1:1: 1混合，而后将混合后菌种按照重量百分比 4%接种于液体发酵培养基中，在30°C下，发酵培养70h，发酵物pH值为4. 5-7. 5，每毫升培养基中的有益菌总量达到30亿以上，其中液体发酵培养基为葡萄糖2 %，蛋白胨1 %，牛肉膏1%，酵母膏0. 5%，余量为蒸馏水，然后将发酵产物分别与慢生大豆根瘤菌、生脂固氮螺菌、沼泽红假单孢菌和巨大芽孢杆菌混合，发酵产物占40%、慢生大豆根瘤菌占10%、生脂固氮螺菌占10%、沼泽红假单孢菌占10%、巨大芽孢杆菌占10%、胶质芽孢杆菌占10%和圆褐固氮菌占10%，混合后得到复合微生物的发酵物。上述菌株均可分别按照常规方法培养，本实施例给出的知识众多培养条件中的一种，分别为产朊假丝酵母的培养基马铃薯浸粉3g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，蒸馏水加至 IOOOmL, 121°C高压灭菌20分钟。产朊假丝酵母增殖培养条件培养Μ_4 ι。乳酸链球菌的培养基葡萄糖2%，蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母膏0.5%，磷酸氢二钾0. 2 %，乙酸钠0. 5 %，柠檬酸铵0. 2 %，硫酸镁0. 058 %，硫酸锰0. 025 %，琼脂 1. 5-2%, pH6. 5。121°C高压灭菌20分钟。乳酸链球菌增殖培养条件30°C培养48-7 。嗜酸乳杆菌的培养基葡萄糖2%，蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母膏0.5%，磷酸氢二钾0. 2 %，乙酸钠0. 5 %，柠檬酸铵0. 2 %，硫酸镁0. 058 %，硫酸锰0. 025 %，琼脂 1. 5-2%, pH6. 5。121°C高压灭菌20分钟。嗜酸乳杆菌增殖培养条件37°C培养48-72h0枯草芽孢杆菌的培养基蛋白胨10g，琼脂20g，氯化钠5g，肉浸粉10g，水加至 IOOOmL, ρΗ7· 2。121°C高压灭菌20分钟。枯草芽孢杆菌增殖培养条件30°C培养48-72h0慢生大豆根瘤菌的培养基甘露醇10g、K2HPO4 0. 5g、酵母粉0. 4g、 MgSO4 · 7Η200· 2g、NaC10. lg、CaCl2 · 6H200. lg、蒸馏水 1000mL、pH6. 8-7. 0。121°C 高压灭菌 20分钟。慢生大豆根瘤菌增殖培养条件培养48-7 。生脂固氮螺菌的培养基蔗糖10g，K2HPO4 0. 5g，NaClO. lg,酵母膏lg，柠檬酸铁 (1% ) ImLjCaSO4O. 2g, MgSO4 ·7Η20 0. 2g, MnSO4 (1 % ) ImL，NaMoO4 (1 % ) lmL，硼酸(1% ) ImL, 蒸馏水1000mL，pH6. 8-7. 0 ； 121°C高压灭菌20分钟。生脂固氮螺菌增殖培养条件在25_30°C 条件下，培养48-7 。嗜沼泽红假单孢菌的培养基酵母粉0. 3%，蛋白胨0. 3%，硫酸镁0. 05%，氯化钙 0. 03%，蒸馏水lOOOmL，pH6. 8-7. 0 ；121°C高压灭菌20分钟。嗜沼泽红假单孢菌增殖培养条件在30°C条件下，培养72-%h。巨大芽孢杆菌的培养基蛋白胨0. 5 %，牛肉膏0. 3 %，氯化钠0. 5 %，蒸馏水 IOOOmL, pH7. 0 ；121°C高压灭菌20分钟。巨大芽孢杆菌增殖培养条件在30°C条件下，培养 24-48h0胶质芽孢杆菌培养基蔗糖IOg,酵母膏0. 2g，(NH4) SO4 0. 5g，MgSO4 0. lg, KC10. lg, Na2HPO4 0. lg, CaCO3 1. 0g，蒸馏水 IOOOmL, ρΗ7· 0。121°C 高压灭菌 20 分钟；增殖培养条件在32-36 °C条件下，培养20-40h。圆褐固氮菌培养基葡萄糖10g, KH2PO4 0. 2g，MgSO4 · 7Η200· 2g，NaClO. 2g， CaSO4 · 7H200. 2g, CaCO3 5. Og,蒸馏水 lOOOmL，pH7. 0-7. 2，113°C灭菌 30 分钟。增殖培养条件在条件下，培养Μ-4 ι。上述菌株均购自中国农业微生物菌种保藏中心，其产朊假丝酵母于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC20060 ；乳酸链球菌于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC10653 ；嗜酸乳杆菌于中国工业微生物菌种保藏中心的编号为CICC6005 ；枯草芽孢杆菌于中国工业微生物菌种保藏中心的编号为CICC20037 ；慢生大豆根瘤菌于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC15402 ；生脂固氮螺菌于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC10481 ；沼泽红假单孢菌于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC10649 ； 巨大芽孢杆菌于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC(^991 ；胶质芽孢杆菌于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC02983 ；圆褐固氮菌于中国农业微生物菌种保藏中心的编号为ACCC10098。3)喷施剂将上述所得复合微生物的发酵物稀释后即为喷施剂。使用方法将所述喷施剂按1 1000水稀释后，喷施于植物叶片上。试验材料温室内栽培的番茄，按照常规管理。试验设计试验设计对照组和微生物叶面喷施剂施用组(用量为1. 5mL/m2，水稀释1000倍)，每个处理组4个重复，每个重复15m2。产量测定测定试验期内采收的可上市番茄总重量。试验结果对照组的番茄产量为5. 3kg/m2，喷施组为6. 2kg/m2，产量提高了 16. 9%。实施例21)复合菌种的增值培养将产朊假丝酵母、乳酸链球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、慢生大豆根瘤菌、生脂固氮螺菌、沼泽红假单孢菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和圆褐固氮菌分别按重量百分比的接种量分别在各自的培养基中进行增殖培养，直至对数生长期。2)复合微生物的发酵物将上述分别增殖培养的产朊假丝酵母、乳酸链球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌混合，而后将混合后菌种按照重量百分比3%接种于液体发酵培养基中，在25°C下，发酵培养72h，所得发酵物再与分别上述培养至对数生长期的慢生大豆根瘤菌、生脂固氮螺菌、沼泽红假单孢菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和圆褐固氮菌混合得复合微生物的发酵物，混合比例为共同发酵物占40%，每单一培养细菌分别占10% ；3)喷施剂将上述所得复合微生物的发酵物稀释后即为喷施剂。实施例21)复合菌种的增值培养将产朊假丝酵母、乳酸链球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、慢生大豆根瘤菌、生脂固氮螺菌、沼泽红假单孢菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和圆褐固氮菌分别按重量百分比2%的接种量分别在各自的培养基中进行增殖培养，直至对数生长期。2)复合微生物的发酵物将上述分别增殖培养的产朊假丝酵母、乳酸链球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌混合，而后将混合后菌种按照重量百分比3%接种于液体发酵培养基中，在37°C下，发酵培养48h，所得发酵物再与分别上述培养至对数生长期的慢生大豆根瘤菌、生脂固氮螺菌、沼泽红假单孢菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和圆褐固氮菌混合得复合微生物的发酵物，混合比例为共同发酵物占40%，每单一培养细菌分别占10% ；
3)喷施剂将上述所得复合微生物的发酵物稀释后即为喷施剂。
权利要求
1.一种复合益生菌喷施剂的制备方法，其特征在于1)复合菌种的增值培养将产朊假丝酵母、乳酸链球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌、 慢生大豆根瘤菌、生脂固氮螺菌、沼泽红假单孢菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和圆褐固氮菌分别按重量百分比-4%的接种量分别在各自的培养基中进行增殖培养，直至对数生长期。2)复合微生物的发酵物将上述分别增殖培养的产朊假丝酵母、乳酸链球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽孢杆菌混合，而后将混合后菌种按照重量百分比3% -4%接种于液体发酵培养基中，在25-37°C下，发酵培养48-72h，所得发酵物再与分别上述培养至对数生长期的慢生大豆根瘤菌、生脂固氮螺菌、沼泽红假单孢菌、巨大芽孢杆菌、胶质芽孢杆菌和圆褐固氮菌混合得复合微生物的发酵物，混合比例为共同发酵物占40%，每单一培养细菌分别占 10% ；3)喷施剂将上述所得复合微生物的发酵物稀释后即为喷施剂。
2.按权利要求1所述的复合益生菌喷施剂的制备方法，其特征在于所述步骤1)中各菌种的培养基分别为产朊假丝酵母的培养基马铃薯浸粉3g，葡萄糖20g，琼脂粉15g，蒸馏水加至IOOOmL, 121°C高压灭菌20分钟；乳酸链球菌的培养基葡萄糖2%，蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母膏0. 5 %，磷酸氢二钾0. 2 %，乙酸钠0. 5 %，柠檬酸铵0.2%，硫酸镁0. 058 %，硫酸锰0. 025 %，琼脂1. 5-2 %， ρΗ6· 5。121°C高压灭菌20分钟；嗜酸乳杆菌的培养基葡萄糖2%，蛋白胨1%，牛肉膏1%，酵母膏0.5%，磷酸氢二钾0. 2 %，乙酸钠0. 5 %，柠檬酸铵0.2%，硫酸镁0. 058 %，硫酸锰0. 025 %，琼脂1. 5-2 %， pH6. 5。121°C高压灭菌20分钟;枯草芽孢杆菌的培养基蛋白胨10g，琼脂20g，氯化钠5g，肉浸粉10g，水加至IOOOmL, pH7. 2。121°C高压灭菌20分钟;生脂固氮螺菌的培养基甘露醇10g，酵母膏lg，K2HPO4 0. 15g,NaC10. llg，Rh溶液4ml， 琼脂20g，蒸馏水IOOOmL, ρΗ6· 8 7· 0 ； 121°C高压灭菌20分钟；巨大芽孢杆菌的培养基牛肉膏5g，蛋白胨5g，氯化钠(NaCl)5g，蒸馏水IOOOmL, ρΗ6· 8 7. 2 ； 121°C高压灭菌20分钟；慢生大豆根瘤菌培养基甘露醇10g、K2HPO4 0. 5g、酵母粉0. 4g、MgSO4 · 7Η200· 2g、 NaClO. lg、CaCl2 · 6H200. lg、蒸溜水 1000mL、pH6. 8-7. 0。121°C 高压灭菌 20 分钟；沼泽红假单孢菌培养基酵母粉0. 3%，蛋白胨0. 3%，硫酸镁0. 05%，氯化钙0. 03%， 蒸馏水IOOOmL, ρΗ6· 8-7. 0 ；121°C高压灭菌20分钟。胶质芽孢杆菌培养基蔗糖10g，酵母膏0. 2g，(NH4) SO4 0. 5g，MgSO4 0. lg, KC10. lg, Na2HPO4 0. lg, CaCO3 1. 0g，蒸馏水 IOOOmL, ρΗ7· 0。121°C 高压灭菌 20 分钟；圆褐固氮菌培养基葡萄糖 10g, KH2PO4 0. 2g，MgSO4 · 7Η200· 2g，NaClO. 2g， CaSO4 · 7Η200· 2g, CaCO3 5. 0g，蒸溜水 lOOOmL，pH7. 0-7. 2，113°C灭菌 30 分钟。
3.按权利要求2所述的复合益生菌喷施剂的制备方法，其特征在于所述Rh溶液为 NaMo045g, H3B045g，蒸馏水 lOOOmL，ρΗ3· 0。
4.按权利要求1所述的复合益生菌喷施剂的制备方法，其特征在于所述步骤2)中的液体发酵培养基为葡萄糖2%，蛋白胨1% ，牛肉膏1%，酵母膏0.5%。
全文摘要
本发明涉及的是微生物领域，具体的说是一种复合益生菌喷施剂的制备方法。按重量百分比1％-4％的接种量分别在各自的培养基中进行增殖培养，而后混合按照重量百分比3％-4％接种于液体发酵培养基中，最后在温度25-37℃下，发酵培养48-72h。本发明叶面喷施剂可延长蔬菜生长期、提高蔬菜产量、品味，蔬菜产量可以提高5.5-10.0％；延长花卉观赏期，花卉观赏期可以延长8-10天。
文档编号C05F11/08GK102153380SQ20101058877
公开日2011年8月17日 申请日期2010年12月15日 优先权日2010年12月15日
发明者于波, 刘丽丽, 单立秋, 吴琼, 宋良敏, 朱天勇, 王守峰, 白子金, 白志超, 白春生, 邵中金, 陈德民, 陈思, 高忠武, 高林 申请人:沈阳科丰牧业科技有限公司