一种含有益生菌的乳仔猪专用复合酶及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种含有益生菌的乳仔猪专用酶及其制备方法，属于饲料酶制剂领域。所述含有益生菌的乳仔猪专用酶由以下重量份数的组分组成：中草药粉5-20份，木聚糖酶800-1200份，纤维素酶80-120份，地衣芽孢杆菌培养物250-300份，甘露聚糖酶15-25，蛋白酶600-1000，中温α-淀粉酶50-80份.其中地衣芽孢杆菌（Βacillus?licheniformis）β-10-25，保藏编号CCTCCNO:M2013538。制备方法如下：地衣芽孢杆菌经发酵后通过过滤、浓缩、干燥获得的培养物与其他成分复配，所得复合酶能提高饲料转化率，降低饲料成本，提高保存稳定性。
【专利说明】一种含有益生菌的乳仔猪专用复合酶及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于酶制剂领域，具体涉及一种含有益生菌的乳仔猪专用复合酶及其制备方法。
【背景技术】
[0002]在畜牧业中，乳仔猪饲养是所有阶段猪中最复杂的。营养供给不合理的后果是猪生长缓慢，腹泻率高，死亡率高，进而使中大猪阶段生长缓慢，延长出栏时间。
[0003]但是，为了切断母源疾病的垂直传播途径，同时缩短母猪繁殖周期，延长种用年限，人们将早期断奶技术广泛的应用于猪的大规模养殖工业中。然而由于新生仔猪缺乏先天免疫、消化系统发育尚不完善，消化酶分泌能力弱，直接供给以玉米等为主的饲料很容易引起猪仔对饲料的消化率低、采食量低、生长速度缓慢、腹泻率高等问题。
[0004]为了克服乳猪在断奶后所出现的种种问题，多数企业从断奶前补饲、诱食、日粮酸化、使用适口性好且易消化吸收的饲料原料、添加外源酶、降低日粮的抗原性、降低日粮的粗蛋白含量以及使用促进剂等多个方面进行了改善和优化，但实际效果参差不齐。
[0005]考虑到仔猪在断奶时，其自身的蛋白酶、淀粉酶等酶活应激而大幅下降到断奶时的三分之一，而这些酶类对于仔猪获取营养和能量起着至关重要的作用。同时，饲料用酶在畜禽生产中具有不俗的效果，比如前苏联科学家在早期断奶仔猪日粮中添加淀粉糊精酶，使得日增重提高14.6%，碳水化合物消化率提高77.2%。据美国有关资料报道，Collier在早期断奶仔猪日粮中补充酶制剂(含蛋白酶、淀粉酶、葡聚糖酶)，结果实验组比对照组日增重提高了 25%，饲料转化率提高了 15.5%。
[0006]添加酶制剂能补充蛋白酶和淀粉酶，是辅助分解日粮中的蛋白和淀粉，降解日粮中的抗营养因子，并能有效分解玉米/豆柏型日粮中的植物细胞壁，使细胞内的营养物质如淀粉、蛋白质等释放出来。同时分解可溶性纤维，降低植物纤维物质的吸水能力和肠道内容物的粘度。另外，大量的生产实践和科学实验也证明了 β_葡聚糖酶等酶制剂的使用，能有效的解决这个问题，但目前在生产、实验中的实际应用的β -葡聚糖酶酶活力大多较低，且热稳定性差。此外，科学实验证实了地衣芽孢杆菌具有促进畜禽生长，降低料重比；增加肠道有益菌数量，改善畜禽肠道微生态环境；预防和治疗肠道疾病，降低死亡率的作用。1989年，美国FDA和美国饲料控制官员协会公布了可以直接饲喂且一般认为是安全的微生物菌种名单，其中包括地衣芽孢杆菌。中华人民共和国农业部318号公告也把地衣芽孢杆菌列入了饲料添加剂目录。
[0007]鉴于以上原因，我们经过多次饲喂实验，研制出了一种添加有能够生产高活性和稳定性β -葡聚糖酶的地衣芽孢杆菌培养物的乳仔猪专用复合酶，其能有效地提高饲料的利用率、降低腹泻率、促进动物生长，针对性强，效果好，经济效益显著。
【发明内容】
[0008]本发明的目的在于提供一种酶活力高、抗腹泻效果显著且含有益生菌的乳仔猪专用复合酶及其制备方法。
[0009]本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
[0010]一种含有益生菌的乳仔猪专用复合酶，其特征在于，所述乳仔猪专用复合酶由以下重量份数的组分组成:中草药粉5-20份，木聚糖酶800-1200份，纤维素酶80-120份，地衣芽孢杆菌培养物250-300份，甘露聚糖酶15-25，蛋白酶600-1000，中温α -淀粉酶50-80份。
[0011]所述木聚糖酶、纤维素酶、甘露聚糖酶、蛋白酶和中温α-淀粉酶均为湖南鸿鹰翔生物工程股份有限公司或其他现有产品；
[0012]所述中草药粉的制备方法如下:
[0013]称取黄芪5-15份；党参10-18份；板蓝根10-15份；当归10-15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下混合获得中草药粉；
[0014]所述地衣芽孢杆菌培养物的制备方法如下:
[0015](I)种子培养
[0016]将地衣芽孢杆菌斜面菌种经三级摇瓶发酵剂一级种子罐发酵；
[0017]所述种子培养的培养基为:酵母粉0.5%，蛋白胨I%，可溶性淀粉I%，NaCl 1%,ρΗ4.5-7.0,121-123°C灭菌 30_40min。
[0018](2)发酵罐发酵
[0019]将一级种子罐发酵液以3%接种量接入含有3L发酵培养基的发酵罐中，培养温度35-45 °C，搅拌速度200-300r/min，通风量(V/V) 1:1-3，培养时间10_15h ;然后将IL经过121°C灭菌20min，温度为10°C的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至35_45°C时恒温培养15-20h ;此时，将一级种子罐发酵液以2%接种量追加接入发酵罐，恒温培养10-15h ;继续将IL经过121°C灭菌20min，温度为10°C的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至35_45°C时恒温培养10-15h ;
[0020]所述发酵培养基组成为:麦麸75g，玉米粉55g，米糠25g，豆饼粉20g，β -葡聚糖2g，中草药剂粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g，消泡剂0.5g,纯净水IOOOmL, pH值4.5-7.0,121°C灭菌20min ；
[0021]所述发酵培养基的调配方法为:按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，pH值3-7,加入中温淀粉酶(3u/g玉米粉)与高温淀粉酶(30u/g玉米粉)，同时边搅拌边升温至70°C保温15-30min，然后缓慢升温至90°C保温15_30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，PH3-7，121-123°C灭菌30_40min备用。
[0022]溶解氧控制:通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15-30% ；
[0023]PH控制:通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在3-7 ；
[0024]补料控制:当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时,开始添加补料培养基，补料量以维持发酵液还原糖含量为2mg/ml-5mg/ml ；
[0025]放罐标准:60-80%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢。
[0026](3)发酵液经孔径10-1000 μ m粗滤，然后于10_20°C循环超滤浓缩去除水分得固形物含量20-40%浓缩液；浓缩液经真空冷冻干燥、超微粉碎得地衣芽孢杆菌培养物。
[0027]所述地衣芽孢杆菌具体为地衣芽孢杆菌(B acillus Iicheniformis) β-10-25。该菌株已于2013年11月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为:湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学生命科学学院)，保藏号为CCTCC NO:M 2013538。
[0028]所述菌株为经物理化学诱变获得，特点如下:
[0029]所述菌株在固体平板上菌落为白色，边缘不整齐，表面干燥不透明，镜检为革兰氏阳性细菌，细胞形态呈短杆状，芽孢中生，椭圆形，不膨大。
[0030]所述菌株生理生化特征:V-P试验( + )，淀粉水解( + )，酪素水解( + )，明胶水解( + )，硝酸盐还原( + )，吲哚试验(_)，利用柠檬酸盐( + )，硝酸还原( + )，甘露醇( + )，木糖(+ )。
[0031]所述地衣芽孢杆菌β-10-25是一株高产热稳定性β-葡聚糖酶的菌株，生产所得的葡聚糖酶酶活力高达8000-10000u/ml ;在室温下保存6个月后酶活损失小于25%，4°C保存12个月后酶活损失小于20% ;60°C条件下保存Ih后仍能保持80%以上酶活，70°C条件下保存IOmin后保持20%以上酶活。比现有的β _葡聚糖酶酶活力高，热稳定性及储存稳定性均较高，特别适合饲料工业的需求。
[0032]优选的，一种含有益生菌的乳仔猪专用复合酶按如下重量份数组成:中草药粉10份，木聚糖酶1000份，纤维素酶100份，地衣芽孢杆菌培养物275份，甘露聚糖酶20份，蛋白酶800份，中温α -淀粉酶65份。
[0033]所述乳仔猪专用复合酶适用于饲料加工厂和养殖场自配饲料，使用时应与饲料中的其它原料混合均匀，可事先将本发明与少量饲料混合均匀，再混合到大批饲料中，直接饲喂。建议每吨全价料添加量为60-120g。
[0034]有益效果:
[0035]本发明根据乳仔猪消化生理特点，并经过动物实验筛选复合配方，设置复合酶酶谱，有效补充乳仔猪消化道蛋白酶、淀粉酶等内源酶的不足，有效提高乳仔猪对饲料的消化利用率，防止营养性腹泻的产生。本发明所添加的地衣芽孢杆菌培养物中含有地衣芽孢杆菌和葡聚糖酶，与添加纯酶工艺相比不仅简化了酶的纯化工艺，而且在添加酶的同时加入大量益生菌——地衣芽胞杆菌。地衣芽胞杆菌的添加一方面能产生蛋白多肽类抗菌物质，拮抗肠道病原细菌，抑制需氧菌及兼性厌氧菌特别是大肠杆菌等病原菌的繁殖，一方面还能产生除β_葡聚糖酶外的多种酶类，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶及纤维素酶等，从而进一步提高畜禽对蛋白质和能量的利用率，促进动物生长。最后，地衣芽胞杆菌还具有增强动物免疫功能、抵御感染和改善动物生理状态的功能。本发明所添加地衣芽孢杆菌培养物中的β -葡聚糖酶酶活力高达8000-10000u/ml ;该酶在60°C条件下保存Ih后仍能保持80%以上酶活，70°C条件下保存IOmin后保持20%以上酶活；在室温下保存6个月后酶活损失小于25%，4°C保存12个月后酶活损失小于20%。比现有的葡聚糖酶酶活力高，酶作用最适PH值范围宽泛，热稳定性及储存稳定性均较高。
[0036]本发明中添加了中草药粉，其具有天然抗菌和增强免疫力的作用，可以有效的提乳仔猪的抗应激能力、免疫功能以及抗病防御机能。另外，中草药粉中添加了具有抗热应激原作用的黄芩、板蓝根，使得本发明产品具有更好的稳定性和保存活性，较没有添加中草药粉的广品在长时间闻温条件下的保存活性提闻了 15%。
【具体实施方式】
[0037]实施例1中草药粉的制备方法[0038]一种中草药粉的制备方法如下:
[0039]称取黄芪10份；党参15份；板蓝根12份；当归12份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下混合获得中草药粉。
[0040]实施例2 —种地衣芽孢杆菌培养物的制备方法
[0041]一种地衣芽孢杆菌培养物的制备方法，包括如下步骤:
[0042](I)液体种子扩大培养
[0043]①一级种子培养:将活化后的斜面菌种2环接入500毫升摇瓶中，培养基装量100毫升，旋转式摇床180转/分，培养温度40°C，培养时间IOh ；
[0044]②二级种子培养:将一级种子按照10%的接种量接入500毫升二级种子摇瓶中，培养条件与一级种子相同；
[0045]③三级种子培养:将二级种子以10%接种量接入5000晕升三级种子摇瓶中，培养基装量1000毫升，旋转式摇床100转/分，培养温度40°C，培养时间12h ；
[0046]④一级种子罐培养:将三级种子以10%接种量接入总容积为150L的一级种子罐，发酵培养基装量100L，培养温度41°C，搅拌速度300rpm，通风量(V/V) 1:1.5，罐压
0.05Mpa,培养时间15h ；
[0047]所述种子培养基重量组成为:酵母粉0.5%，蛋白胨I %，可溶性淀粉I %，NaCll%，ρΗ5.5，121。。灭菌 35min。
[0048](2)发酵罐发酵
[0049]将一级种子罐发酵液以3%接种量接入含有3L发酵培养基的发酵罐中，培养温度37°C，搅拌速度250r/min，通风量(V/V) 1:1-3，培养时间12h ;然后将IL经过121°C灭菌20min，温度为10°C的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至37°C时恒温培养18h ;此时，将一级种子罐发酵液以2%接种量追加接入发酵罐，恒温培养12h ;继续将IL经过121°C灭菌20min，温度为10°C的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至37°C时恒温培养12h ；
[0050]所述发酵培养基组成为:麦麸75g，玉米粉55g，米糠25g，豆饼粉20g，β -葡聚糖2g，中草药粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g，消泡剂0.5g,纯净水IOOOmL, pH值5.5，121°C灭菌20min ；
[0051]所述发酵培养基的调配方法为:按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值5.5，加入中温淀粉酶(3u/g玉米粉)与高温淀粉酶(30u/g玉米粉)，同时边搅拌边升温至70°C保温20min，然后缓慢升温至90°C保温20min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始PH5.5，121°C灭菌35min备用。
[0052]中草药粉的制备方法如下:
[0053]称取黄芪10份；党参15份；板蓝根8份，分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下混合获得中草药粉。
[0054](3)发酵液经孔径500 μ m粗滤，然后于15°C循环超滤浓缩去除水分得固形物含量20%浓缩液；浓缩液经真空冷冻干燥、超微粉碎得地衣芽孢杆菌培养物。
[0055]实施例3 —种含有益生菌的乳仔猪专用复合酶的制备方法
[0056]一种含有益生菌的乳仔猪专用复合酶，由以下重量份数的酶制剂组成:
[0057]中草药粉10份，木聚糖酶1000份，纤维素酶100份，地衣芽孢杆菌培养物275份，甘露聚糖酶20份，蛋白酶800份，中温α -淀粉酶65份。[0058]按上述重量份数取产自湖南鸿鹰翔生物工程股份有限公司的木聚糖酶，纤维素酶，甘露聚糖酶，中温α -淀粉酶，蛋白酶，以及实施例1所得的中草药粉，实施例2所述的地衣芽孢杆菌培养物于25°C条件下在混合机中搅拌均匀，搅拌时间为5分钟。搅拌均匀装箱后于常温或冷室中保存。
[0059]实施例4 一种含有益生菌的乳仔猪专用复合酶的制备方法
[0060]一种含有益生菌的乳仔猪专用复合酶，由以下重量份数的酶制剂组成:
[0061]中草药粉20份，木聚糖酶1200份，纤维素酶120份，地衣芽孢杆菌培养物300份，甘露聚糖酶15份，蛋白酶600份，中温α -淀粉酶80份；
[0062]中草药粉重量份数组成:黄苗15份；党参18份；板蓝根10份；当归10份；
[0063]按上述重量份数取产自湖南鸿鹰翔生物工程股份有限公司的木聚糖酶，纤维素酶，甘露聚糖酶，中温α -淀粉酶，蛋白酶，以及中草药粉，实施例2所述的地衣芽孢杆菌培养物，于5°C条件下在混合机中搅拌均匀，搅拌时间为5分钟。搅拌均匀装箱后于常温或冷
室中保存。
[0064]实施例5 —种含有益生菌的乳仔猪专用复合酶的制备方法
[0065]一种含有益生菌的乳仔猪专用复合酶，由以下重量份数的酶制剂组成:
[0066]中草药粉5份，木聚糖酶800份，纤维素酶80份，地衣芽孢杆菌培养物200份，甘露聚糖酶25份，蛋白酶1200份，中温α -淀粉酶50份；
[0067]中草药粉重量份数组成:黄苗5份；党参10份；板蓝根12份；当归12份；
[0068]按上述重量份数取产自湖南鸿鹰翔生物工程股份有限公司的木聚糖酶，纤维素酶，甘露聚糖酶，中温α -淀粉酶，蛋白酶，以及中草药粉，实施例2所述的地衣芽孢杆菌培养物于25°C条件下在混合机中搅拌均匀，搅拌时间为5分钟。搅拌均匀装箱后于常温或冷室中保存。
[0069]实施例6效果对比实验
[0070]选取120头断奶仔猪，按体重、血统及性别无差异分为实验组和对照组，每组3个重复，每个重复20头猪。实验期为28天，实验组每吨饲料添加本实施例2所述复合酶制剂120g，对照组不添加复合酶制剂，于试验期的始末日早晨空腹称重，计算饲料转化率、日增重、料肉比、腹泻率和死淘率。实验结果如下表所示:
[0071]
【权利要求】
1.一种含有益生菌的乳仔猪专用复合酶，其特征在于:由以下重量份数的组分组成:中草药粉5-20份，木聚糖酶800-1200份，纤维素酶80-120份，地衣芽孢杆菌培养物250-300份，甘露聚糖酶15-25，蛋白酶600-1000，中温α -淀粉酶50-80份； 所述地衣芽孢杆菌具体为地衣芽孢杆菌(B acillus Iicheniformis) β-10-25,保藏编号为 CCTCC Ν0:Μ 2013538。
2.如权利要求1所述一种含有益生菌的乳仔猪专用复合酶，其特征在于，所述中草药粉的制备方法如下: 称取黄芪5-15份；党参10-18份；板蓝根10-15份；当归10-15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下混合获得中草药粉。
3.如权利要求1所述一种含有益生菌的乳仔猪专用复合酶，其特征在于，地衣芽孢杆菌培养物的制备方法，包括如下步骤: 地衣芽孢杆菌β-10-25经斜面菌种活化培养后进行一、二、三级液体种子和种子罐培养；将一级种子罐发酵液以3%接种量接入含有3L发酵培养基的发酵罐中，培养温度35-45°C，搅拌速度200-300r/min，通风量(V/V) 1:1-3，培养时间10_15h ;然后将IL经过121°C灭菌20min，温度为10°C的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至35_45°C时恒温培养15-20h ;此时，将一级种子罐发酵液以2%接种量追加接入发酵罐，恒温培养10-15h ;继续将IL经过121°C灭菌20min，温度为10°C的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至35_45°C时恒温培养10-15h ; 发酵液经孔径10-1000 μ m粗滤，然后于10-20°C循环超滤浓缩去除水分得固形物含量20-40%浓缩液；浓缩液经真空冷冻干燥、超微粉碎得地衣芽孢杆菌培养物。
4.如权利要求3所述的一种含有益生菌的乳仔猪专用复合酶，其特征在于，所述发酵培养基组成为:麦麸75g，玉米粉55g，米糠25g，豆饼粉20g，β -葡聚糖2g，中草药粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g，消泡剂0.5g,纯净水lOOOmL，pH 值4.5-7.0,121°C灭菌20min，中草药粉的制备方法如下:称取黄芪10份；党参15份；板蓝根8份，分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下混合获得中草药粉。
5.一种制备如权利要求1所述的含有益生菌的乳仔猪专用复合酶的方法，包括如下步骤: 按照原料组成将木聚糖酶，纤维素酶，甘露聚糖酶，蛋白酶，地衣芽孢杆菌培养物，中温α -淀粉酶，中草药粉混合均匀即可； 所述中草药粉的制备方法如下: 称取黄芪5-15份；党参10-18份；板蓝根10-15份；当归10-15份；分别将上述中草药粉碎至粒径为2毫米以下混合获得中草药粉； 所述地衣芽孢杆菌培养物制备方法如下: (1)种子培养 将地衣芽孢杆菌β -10-25斜面菌种经三级摇瓶发酵剂一级种子罐发酵； 所述种子培养的培养基为:酵母粉0.5 %，蛋白胨I %，可溶性淀粉I %，NaCl I %，。 (2)发酵罐发酵 将一级种子罐发酵液以3%接种量接入含有3L发酵培养基的发酵罐中，培养温度35-451:，搅拌速度200-3001'/1^11，通风量1:1-3，培养时间10_15h ;然后将IL经过121°C灭菌20min，温度为10°C的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至35_45°C时恒温培养15_20h ；此时，将一级种子罐发酵液以2%接种量追加接入发酵罐，恒温培养10-15h ;继续将IL经过121°C灭菌20min，温度为10°C的发酵培养基补入发酵罐，待温度升至35_45°C时恒温培养10-15h ； 所述发酵培养基组成为:麦麸75g，玉米粉55g，米糠25g，豆饼粉20g，β -葡聚糖2g，中草药粉40g，海藻糖35g，酵母粉6g，玉米浆3g，硫酸铵2g，磷酸氢二钾2g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸钠3g,消泡剂0.5g,纯净水1000mL, pH值4.5-7.0,121°C灭菌20min ； 所述发酵培养基的调配方法为:按比例准确称取原料，将原料中的纯净水、玉米粉、豆饼粉投入配料罐中，调节PH值3-7，加入中温淀粉酶与高温淀粉酶，同时边搅拌边升温至70°C保温15-30min，然后缓慢升温至90°C保温15_30min进行液化，最后加入其它原料，搅拌均匀，调初始pH3-7，121-123°C灭菌30_40min备用； 溶解氧控制:通过调整搅拌转速及通风量，控制溶解氧15-30% ； pH控制:通过补氨水或稀磷酸，控制发酵过程中pH值保持在3-7 ； 补料控制:当发酵液中的还原糖含量降至3mg/ml-8mg/ml时,开始添加补料培养基,补料量以维持发酵液还原糖含量为2mg/ml-5mg/ml ； 放罐标准:60-80%菌体衰老自溶，酶活力增长缓慢； (3)发酵液经孔径ΙΟ-ΙΟΟΟμπι粗滤，然后于10-20°C循环超滤浓缩去除水分得固形物含量20-40%浓缩液；浓缩液经真空冷冻干燥、超微粉碎得地衣芽孢杆菌培养物。
6.如权利要求1所述的一种含有益生菌的乳仔猪专用复合酶，其特征在于:所述复合酶由以下重量份数的组分组成:中草药粉10份，木聚糖酶1000份，纤维素酶100份，地衣芽孢杆菌培养物275份，甘露聚糖酶20`份，蛋白酶800份，中温α -淀粉酶65份。
7.如权利要求所述的一种含有益生菌的乳仔猪专用复合酶在乳仔猪饲养过程中的应用。
【文档编号】C12N1/20GK103875935SQ201310739737
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】李海清, 胡永明, 胡波, 周玉明, 易继云 申请人:湖南鸿鹰生物科技有限公司