烟粉虱MEAM1隐种瞬时感受器离子通道基因MEAM1 BtTrp及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体涉及烟粉虱MEAM1隐种瞬时感受器离子通道基因MEAM1?BtTrp及其应用，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本发明从烟粉虱MEAM1隐种中克隆到瞬时感受器离子通道TRP(MEAM1?BtTrp)基因的cDNA，并通过饲喂MED?BtTrp基因dsRNA结果导致烟粉虱MEAM1隐种在高温胁迫下存活率显著降低。本发明结果对于明确烟粉虱MEAM1?BtTrp隐种温度感知机制有重要意义，期望为进一步研究烟粉虱的温度适应机理和日后通过温度适应性控制烟粉虱危害的方法提供依据。
【专利说明】烟粉虱MEAM1隐种瞬时感受器离子通道基因MEAM1 BtTrp
及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程领域，具体涉及烟粉虱MEAMl隐种瞬时感受器离子通道基因MEAMl BtTrp及其应用。
【背景技术】
[0002]在动物体中，许多细胞表面受体和离子通道的感受器随着环境变化的刺激影响动物行为。在众多离子通道中，瞬时感受器阳离子通道(transient receptorpotential, TRP)最早发现于果蝇的视觉系统，几乎存在于每个器官。昆虫温度的感知与TRP有关，TRP是位于细胞膜上的一种非选择性阳离子通道跨膜蛋白质，当其被激活时，允许包括钙离子在内的阳离子进行跨膜运输。TRP作为感受器中的门控分子，起到外部环境和神经系统中介的作用，可以将温度刺激、化学刺激以及机械刺激等转化成内向电流。已有研究表明，TRP是生物感知外界温度的关键通道。基于TRP对生物体感知的重要作用，推测其是粉虱类进行温度适应并广泛扩散暴发的重要基础。[0003]粉風属于半翅目(Hemiptera),粉風科(Aleyrodidae),是一类体型微小的植食性刺吸类害虫，主要集中在热带和亚热带地区。至2007年，记载的粉虱有1556种，其中报道最多、为害最为严重的是烟粉風Bemisia tabaci Gennadius。烟粉風是一个包含30个以上隐种的物种复合体。例如，MEAMl (Middle East Asia Minorl)具有很强的入侵性，属于全球入侵种，起源于中东-小亚细亚，现已广泛分布于世界各地，号称“超级害虫”，给许多国家和地区的农作物造成了毁灭性的灾害。温度是决定物种分布和扩散区域的重要影响因子，由此可见，对温度胁迫具有较高的适应能力是烟粉虱MEAMl隐种能广泛分布于世界各地关键因素之一。随着全球温度的变化，烟粉虱MEAMl隐种在不同地理环境下的成功适应，已经广泛引起了人们对其入侵机制的理论探讨，对于其温度适应性的分子机制更是近几年来的研究热点之一。昆虫温度耐受性的获得与热激蛋白(heat shock proteins, HSP)的分子伴侣作用有关，热激蛋白在生物热胁迫生态适应和进化上起着重要作用。前期研究表明热激蛋白基因在烟粉虱MEAMl隐种的温度耐受性中起关键性作用，为更好的理解烟粉虱MEAMl隐种温度适应能力，研究烟粉虱MEAMl隐种怎样感知外界温度并将其传递至体内的温度感知机制尤为重要。因此，研究烟粉虱MEAMl隐种的TRP基因及其在温度胁迫下的作用是回答其温度适应分子机制的核心内容之一。
[0004]RNA干扰(RNA interference, RNAi)现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA存在同源互补序列的双链RNA(doublestrand RNA, dsRNA)导入细胞后能特异性地降解该mRNA，从而产生相应的功能表型缺失。RNAi广泛存在于生物界，从低等原核生物到植物、真菌、无脊椎动物、哺乳动物中均发现有此种现象。近些年，RNAi技术在昆虫研究上得到越来越多的应用，通过RNAi技术沉默昆虫体内某些基因，使昆虫的某些能力增强或丧失，也能在特定时间抑制其功能基因表达使昆虫的发育停留在某个阶段，进而达到利用或防治其危害的目的。RNAi常用的导入方法有浸泡、饲喂、电穿孔、注射、病毒感染、干细胞移植、转基因等。在昆虫中，常用注射法和饲喂法进行RNAi效应的研究，即将目的基因的dsRNA或SiRNA导入昆虫体内，进而实现干扰。由于烟粉虱个体体积小，注射dsRNA不易操作、费时等限制，而饲喂dsRNA具有简便、易于操作等特点而在烟粉虱研究中得以应用。
[0005]本发明从烟粉虱MEAMl隐种中克隆到MEAMl BtTrp基因的cDNA，并提供MEAMlBtTrp基因cDNA的克隆方法；并通过饲喂MEAMl BtTrp基因dsRNA，进而导致烟粉虱MEAMlBtTrp隐种成虫在高温胁迫下死亡率显著增加。本发明结果为明确MEAMl BtTrp基因在烟粉虱MEAMl温度感知中的作用奠定基础，期望为进一步研究烟粉虱MEAMl的温度适应机理和日后通过温度适应性控制烟粉虱危害的方法提供依据。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供烟粉虱MEAMl隐种瞬时感受器离子通道基因MEAMl BtTrp0
[0007]本发明的再一目的是提供上述烟粉虱MEAMl隐种瞬时感受器离子通道基因MEAMlBtTrp的应用。
[0008]根据本发明的MEAMl BtTrp基因的cDNA全长核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示:
[0009]ATGAAGCCGACGGAATCGAAGGAGGACCTTCTGGGGTCGAAGGAAAACCTAAAAAATCCCCGAGAGTCCTTGCAGTCCACCGGCGGCGAGGTTGCCCTCTCCCAAATCGAGAAAAGGTTCCTCTTGCTCAGCGAAAGGGGAGATATCGCCTCTGTCAAAAGGATAATCGCCGAGCACAAAGATCACCCAGAGCTATTGAACATCAATTGCGTTGATCCTCTGAATAGGTCAGCACTCATCGCAGCGATCGAAAATGAAAATATAGAGTTAATAAGAGTCCTCCTCGAACTTGGGATTGAAGTCAAGGATGCTCTTCTACATGCAATTAAGGAAGAGTACGTTGAAGCTGTGGAGATTCTACTTGAATGGGAAGAAAAAATCCACAAACCTGGGCAGCCTTATAGTTGGGAAGCCGTCGACAGGAGCTCTTCGACATTTACACCGGACATAACACCGCTCATATTGGCTGCTCATATGAACAATTACGAAATCCTGAAAATTTTGTTGGATCGAGGGGCCACACTCCCCGTGCCACACGATGTTAGGTGTGGCTGCGACGAATGTGTAACTTCAAGTGAGCAGGATTCTTTGCGACATTCACAAGCTCGGATCAACGCGTACAGAGCTTTAACCGCACCATCCCTCATAGCCCTCTCTTCCAGGGATCCCCTCCTTACCGCCTTCGAGTTATCATGGGAGCTGCGCAGACTCAGCAAGATGGAAGCGGAATTCCGCTCTGAATATAATGAAATGAGAGGTATTTGTCAGACATTTGCAACCTCCTTGCTAGACCACGCGCGAACCTCGTATGAACTGGAGGTGATGCTTAATCATAATCCTGATGGAGAGTCGTGGGAACCAGGAGAGAGGCAAACTCTGGAGAGACTGAAGCTAGCTATCAAATACAAACAAAAAGCGTTTGTTGCTCATCCAAATGTACAACAGCTGCTGGCAGCTATTTGGTATGATGGTCTCCCCGGATTTCGACGAAAAGGGATGATTGGTCAAGCTTTTGAGTGTGGAAAGTTAGGTGCAATGTTTCCTGTCTACGCAACCGTGTATTTGACAGCGCCTGAATCGGAGATGGGCCAGTTCATGAAAAAACCCTTTGTAAAGTTCATCTGTAATTCAACCTCCTACGCTTTCTTCCTGATGTTATTGGCCTTGGCATCACAAAGAGCGGAATTTCTTGCAATCGAATGGTTTGGACCCGACTGGATGAAAGAGATACTGAAAGAGTGGATTCGAAAGGAAAGAGGATCAATACCTGGTCTCATAGAATCCTTTATTATTTTGTATGTCATAAGTTTGATTTGGGGTGAAATGAGAGCATTGTGGTCTGGTGGCTTAGAGGACTATGTTTCAGATTTGTGGAATATAGTGGATTTCATCACCAATGTATTCTATATGATATGGATTTGTCTCAGAGGAACTGCGTATATCATTGTGCAAAGAGAGCATAAAAGTGGCCTCGATCCATGGTATCCTCGTGATAAGTGGGACATGTTTGATCCTCATCTTCTATCAGAAGGTGCGTTTGCAGCCAGTATGATCTTCAGTTTCTTAAAATTGGTTCATATCTTCAGTATCAATCCTCATCTTGGTCCATTGCAAATTTCGTTGGGACGAATGATTGTCGACATCATCAAATTTTTCTTCATCTACACATTGGTCCTTTTCGGTTATGGTTGTGGTATGAATCAGTTACTTTGGTACTATGCTGATCTTGAGAGGAAAAAGTGTTATCATCTCAACGAGGATTATGCTGATTTTGATGGTCAAGATAAAGCCTGTACAACATGGAGACGTTTTGCAAATTTATTTGAAACATCTCAGTCTCTGTTCTGGGCCAGTTTCGGTTTAGTTGATCTTGTATCGTTTGATCTGACTGGTATTAAGAGTTTCACCCGGTTTTGG
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GGTAAATCAACAGTCACCGGCGAAGTACTGACTGGATGGTTGTAA
[0010]本发明还提供了所述烟粉虱MEAMl隐种瞬时感受器离子通道基因MEAMl BtTrp用于防治烟粉虱的应用。
[0011]本发明所获得的结果为明确MEAMl BtTrp基因在烟粉虱MEAMl温度感知中的作用奠定基础，期望为进一步研究烟粉虱MEAMl的温度适应机理和日后通过温度适应性控制烟粉虱危害的方法提供依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1MEAMl BtTrp基因的dsRNA处理对烟粉虱MEAMl隐种成虫耐热性的影响:比较饲喂MEAMl BtTrp基因dsRNA、饲喂10%蔗糖溶液3h后烟粉虱MEAMl隐种成虫死亡率。所有数据均用SPSS16.0统计软件进行数据统计分析，显著性检验水平为P〈0.05。
【具体实施方式】
[0013]实施例1:烟粉虱MEAMl BtTrp基因全长cDNA序列克隆 [0014]1、提取总 RNA:
[0015]取烟粉虱MEAMl隐种的成虫200头放入已灭过菌的研磨器中，加入ImL的Trizol溶液，研磨充分后，加入到1.5mL的离心管中。充分振荡混匀，室温放置5min;静置后加入0.2mL的氯仿,充分振荡混匀15s,室温放置5min,使用高速低温离心机12000rpm离心15min ;取上清液于另一离心管中，加入等体积异丙醇，摇晃混匀，室温放置lOmin。在4°C下12000rpm离心15min ;弃上清液，加入浓度75%的乙醇ImL,在4°C下12000rpm离心10min ；弃上清液，并在超净工作台放置5min，加入50 μ L的DEPC水，在55_60°C水中5min使RNA沉淀充分溶解，_80°C超低温冰箱保存以备用。
[0016]2、烟粉風MEAMl隐种cDNA合成:
[0017]米用Transgen 公司的反转录试剂盒(Super Script First-Strand SynthesisSystem)说明进行。
[0018]3、PCR扩增MEAMl BtTrp基因的中间片段:
[0019](I)设计引物 MEAMl BtTrp-F 和 MEAMlBtTrp-R:
[0020]MEAMlBtTrp-F: 5，-CCACCATTCAACCTATCAC-3，
[0021]MEAMlBtTrp-R: 5’ -AACATCGTCTTTGCCTTC-3’由上海生工生物工程技术服务有限公
司合成。
[0022](2)以cDNA为模板，PCR扩增烟粉虱MEAMl隐种MED BtTrp基因的中间片段:
[0023]反应体系为25 μ L:10XPCR reaction buffer2.5 μ L, dNTP Mix(IOmM)0.5 μ L、Taq聚合酶(2.5U) 0.5 μ L、上游引物和下游引物(10 μ M)各1.0 μ L、cDNA模板0.5 μ L、灭菌 ddH2019.0 μ L。
[0024]反应条件为:94°C5min;94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin, 35 个循环；72°C IOmin
[0025](3)PCR产物纯化:利用 Transgen 公司的 EasyPureTM Quick Gel Extraction Kit试剂盒将PCR产物进行切胶纯化。
[0026](4) PCR产物连接、转化与鉴定:
[0027]连接:在0.2mL的离心管中加入以下试剂:上述PCR纯化产物4 μ L，pEASY-Tl载体I μ L,轻轻混合,室温反应20min,反应结束后置于冰上。
[0028]转化:将连接产物加到体积为50μ L的Transl-Tl感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴20min ;42°C热激30s，立即置于冰上2min ;加入500 μ L液体LB培养基，200rmp，37°C摇床孵育Ih ;取40 μ L X-gal (20mg/mL)和8 μ L的IPTG (500mM),混匀后均匀地涂于LB固体平板培养基上，37 °C培养箱放置30min ;取200 μ L菌液涂平板，37 °C培养过夜。
[0029]鉴定:挑取白色单菌落于含Amp的LB液体培养基中摇床培养10h，菌液进行菌落PCR0菌落PCR反应体系为10 μ L:2 XEasyTaq SuperMix5 μ UM13F上游和下游引物(10 μ Μ)各 1.0 μ L、cDNA 模板 1.0 μ L、灭菌 ddH202.0 μ L。
[0030]菌落PCR 反应条件为:94°C IOmin; 94°C 30s, 55°C 30s, 72°C lmin, 30 个循环；72。。，IOmin。
[0031]琼脂糖凝 胶电泳检测菌落PCR产物大小，选出重组克隆，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
[0032]4、烟粉虱 MEAMl BtTrp 基因 5’ RACE 和 3’ RACE 获得
[0033]根据步骤3所获得的烟粉虱MEAMl BtTrp基因的中间片段序列，设计5’ RACE和3，RACE特异性引物，PCR扩增MED BtTrp基因的5，和3，端序列:
[0034]5’ RACE Outer Primer:5’ -TTGGCGGCAATAGCGTTCCAGTCC-3’
[0035]5’ RACE Inner Primer:5’ -CTCTTTGTCCACGCTCGGTGTCTT-3’
[0036]3’ RACE Outer Primer:5， -ACACCGAGCGTGGACAAAGAGGA-3’[0037]3’ RACE Outer Primer:5’ -CTATTGCCGCCAAGAAAGCATCCAG-3’
[0038]采用SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit (Clonetch)试剂盒，并严格按照试剂盒说明书操作，扩增得到目的条带，将克隆测序后的序列利用DNAMAN和GENtle软件拼接，得到MEAMlBtTrp基因3501bp序列，所得的基因具有如SEQ ID N0.1所示的序列。
【权利要求】
1.烟粉虱MEAMl隐种瞬时感受器离子通道基因MEAMlBtTrp，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.权利要求1所述烟粉虱MEAMl隐种瞬时感受器离子通道基因MEAMlBtTrp用于防治烟粉虱的 应用。
【文档编号】A01P7/04GK103898122SQ201410153889
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月16日 优先权日:2014年4月16日
【发明者】吕志创, 李倩, 万方浩, 周忠实, 郭建英 申请人:中国农业科学院植物保护研究所