朝鲜蓟试管实生苗茎尖快繁育苗的方法
【专利摘要】本发明公开一种朝鲜蓟试管实生苗茎尖快繁育苗的方法。本发明利用种子消毒后进行试管内播种，获得大量无菌实生苗；并采取合适大小的试管实生苗茎尖进行从芽诱导获得继代无根苗；将无根苗进行生根培育获得朝鲜蓟优质种苗。因朝鲜蓟种皮坚硬，对消毒剂有较强的耐受力，因此用本发明的消毒剂消毒后无污染率可达80％以上；且进行适当的物理处理后的种子消毒后发芽率可达到85％以上。获得的无菌实生苗采取其茎尖进行诱导，成活率可达到90％，丛芽诱导成功率可达85％；且进行试管播种成苗后无需再消毒，成功率可达90％以上，无疑达到快繁种苗并降低成本的目的。本发明的方法具有种苗快繁效率高、成本低、前景好等优势。
【专利说明】朝鲜蓟试管实生苗茎尖快繁育苗的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，特别涉及一种朝鲜蓟试管实生苗茎尖快繁育苗的方 法。
【背景技术】
[0002] 朝鲜蓟，别名菊蓟、菜蓟，学名Cynara scolymus L.，为菊科（Comopsite)菜蓟属多 年生草本植物。并且是一种药食同源植物，既是一种很好的菜肴，同时有很好的药用价值， 其花蕾或叶含菜蓟素、菜蓟苦素、大海米菊素、木犀草甙等成分，在欧洲的德国、法国、英国、 意大利等国家，朝鲜蓟用于防治消化不良、便秘、腹泻、肝脏和胆囊疾病以及高血脂、动脉硬 化、高血糖、黄胆等；在巴西，朝鲜蓟用于糖尿病、高血压的预防。同时，朝鲜蓟最突出的特点 是同时具备保护和恢复肝脏细胞的功能，也是其它降脂降糖产品所无法替代的。在我国，朝 鲜蓟主要加工成罐头成品出口，目前世界上朝鲜蓟罐头年需求量约10万吨以上。近年来， 美国及西欧等发达国家对朝鲜蓟的消费和进口量不断增加，罐头制品在国际市场供不应求 (李进进.朝鲜蓟继代增殖快繁方法探讨[J].种子，2011(1))。
[0003] 目前朝鲜蓟的种植方法多采用种子播种，露天栽种，而朝鲜蓟是异化授粉植物， 在我国大多数地区只开花不结果，种子繁育率低，虽然种子昂贵但我国几个主要种植地区 (如湖南常德）每年都需要大量进口种子，这不仅成本高，而且经常因茬口接不上而延误农 时；另一种是通过组培快繁技术，但外植体是采用露地健壮植株的分蘖苗茎尖消毒后进行 诱导培育朝鲜蓟种苗，其缺点和不足是朝鲜蓟表面密布绒毛，消毒效果不理想，而且幼嫩茎 尖常因消毒剂的副作用导致褐化或死忙，影响成苗率（张平喜，朝鲜蓟的组织培养与快速 繁殖技术研究[J].中国园艺文摘，2011.6)。为改善传统的育种方法，适应国际市场的需 要，迫切需要改善朝鲜蓟的组培快繁途径。
【发明内容】
[0004] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种朝鲜蓟试管实生苗 茎尖快繁育苗的方法。利用种子消毒后进行试管内播种，获得大量无菌实生苗；并采取合适 大小的试管实生苗茎尖进行从芽诱导获得继代无根苗；将无根苗进行生根培育获得朝鲜蓟 优质种苗，从而达到快速繁殖朝鲜蓟种苗的目的。
[0005] 因种子消毒比露地实生苗茎尖消毒容易而且成活率高，进行试管播种成苗后无需 再消毒，成功率可达90%以上，无疑达到快繁种苗并降低成本的目的。
[0006] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种朝鲜蓟试管实生苗茎尖快繁育苗的方 法，包括如下步骤：
[0007] (1)将朝鲜蓟（Cynara scolymus L.)种子进行物理处理后，再经消毒剂消毒后在 种子培养基中进行试管内播种、培育，将培育发芽的种子挑出至新鲜的种子培养基中进行 自然光照，获得无菌实生苗；
[0008] (2)在无菌条件中进行如下操作，将步骤（1)获得的无菌实生苗切取0. 7?1. 0_ 的实生苗茎尖转入丛芽诱导培养基中进行诱导，再转入自然光照下进行培养，获得丛芽，然 后将丛芽转至继代培养基中，经继代培养后获得无根苗；
[0009] (3)将步骤（2)获得的无根苗转至试管生根培养基中，进行试管生根培育获得朝 鲜蓟优质种苗。
[0010] 步骤⑴中所述的物理处理的条件优选为黑暗条件下30?35°C温水中恒温浸泡 12?24h ;更优选为黑暗条件下30°C温水中恒温浸泡24h ;
[0011] 步骤（1)中所述的消毒剂的组成及消毒条件优选为75% (v/v)酒精15s+2% (v/ ￥)似(]10(10?15)111；[11+18/1^取012(10?15)111；[11;更优选为75 (%(￥八）酒精158+2(%(￥八） NaC10(10?15)min+lg/L HgCl215min ;适当提高lg/LHgCl2的消毒时间，污染率会随着降 低。
[0012] 步骤（1)中的物理处理后的种子用纱布松散包扎，消毒剂处理后用无菌水浸洗 4?5次；
[0013] 步骤（1)中所述的种子培养基的组成优选为MS培养基+GA3(0?3.0)mg/ L+NAA (0 ?0· 2) mg/L+ 活性炭（0 ?2) g/L+ 卡拉胶（6. 8 ?7) g/L+ 鹿糖 30g/L，ρΗ5· 5 ?5. 7， 其中，ΝΑΑ为零时，GA3和活性炭均不为零；更优选为MS培养基+GA31. 0mg/L+活性炭2g/L+ 卡拉胶7g/L+鹿糖30g/L，pH5. 6 ;所述的GA3，指赤霉素；所述的NAA，指a-萘乙酸；
[0014] 步骤（1)中所述的培育的条件优选为黑暗条件下，环境温度23?28°C培育15? 25天，培养湿度为70 %?85 % ;
[0015] 步骤⑴中所述的进行自然光照的条件优选为23?28°C自然光照30?40天，湿 度为70%?85% ;
[0016] 步骤（2)中所述的丛芽诱导培养基的组成优选为MS培养基+6-BA (2. 0?5. 0) mg/ L+NAA(0. 2 ?0· 5)mg/L+KT(0 ?0· 2)mg/L+ 琼脂 6. 8g/L+ 蔗糖 30g/L，ρΗ5· 6 ;更优选为 MS 培养基 +6-BA2. 0mg/L+NAA0· 2mg/L+KT0. 2mg/L+ 琼脂 6. 8g/L+ 蔗糖 30g/L，ρΗ5· 6 ;所述的 6-ΒΑ，指6-苄基腺嘌呤；所述的ΚΤ，指激动素；
[0017] 步骤（2)中所述的诱导的条件优选为黑暗条件下23?28°C诱导培养10?15天；
[0018] 步骤（2)中所述的自然光照下进行培养的条件优选为待茎尖膨大1?2倍后转 入培养室自然光下培养15?20天，待开始转绿而且有芽点出现时适当增加光照强度至 2500?30001ux，再培养25?35天后获得丛芽；
[0019] 步骤⑵中所述的继代培养基的组成优选为MS培养基+ΝΑΑ(0?0. 5)mg/ L+GA3(0 ?0· 5)mg/L+6_BA(0 ?1. 5)mg/L+CM(挪子汁）（0 ?50)g/L+ 卡拉胶 7g/L+ 鹿 糖30g/L，ρΗ5· 5?5. 7,其中，NAA、GA3、6-BA与CM不能同时为零；更优选为MS培养基 +GA30. 5mg/L+6-BAl. 5mg/L+CM(椰子汁）50g/L 卡拉胶 7g/L+鹿糖 30g/L，pH5. 6 ;所述的 GA3， 指赤霉素；所述的CM(椰子汁），从椰果中抽取的原液；
[0020] 步骤（2)中所述的继代培养的条件优选为温度23?28°C培养15?25天，湿度为 70%?85%，光照强度 3000 ?350011?;
[0021] 步骤（3)中所述的试管生根培养基的组成优选为1/2MS培养基+ΙΒΑ(0. 2?1. 0) mg/L+香蕉泥（0 ?50) g/L+ 活性炭（0 ?2) g/L+琼脂 6. 8g/L+鹿糖 20g/L，ρΗ5· 5 ?5. 8 ;更 优选为1/2MS培养基+ΙΒΑ0. 5mg/L+香蕉泥50g/L+活性炭2g/L+琼脂6. 80g/L+蔗糖20g/ L，pH5. 7 ;所述的IBA，指吲哚丁酸；所述的香蕉泥，指成熟香蕉果肉匀浆物；所述1/2MS培 养基是指MS培养基的大量元素减半；
[0022] 步骤（3)中所述的生根培育的条件优选为温度23?28°C培育20?30天，湿度为 70%?85%，光照强度 3000 ?450011?;
[0023] 本发明的机理是：利用植物组织培养的原理和技术进行种苗扩繁。植物组织培养 (又称为离体培养、植物克隆），简称组培，是将植物的离体材料（器官、组织、细胞、原生质 体等）无菌培养，使其生长、分化、增殖，再生出完整植株或生产次生代谢物质的技术。植物 组织培养的特点有：培养材料经济；培养条件可以人为控制；生长周期短，繁殖率高；管理 方便，利于工厂化生产和自动化控制等。
[0024] 本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
[0025] (1)利用种子进行消毒，因种皮坚硬，对消毒剂有较强的耐受力，因此使用本发明 的消毒剂消毒后无污染率可达80%以上。
[0026] (2)获得的无菌实生苗采取其茎尖进行诱导，成活率可达到90%，丛芽诱导成功 率可达85% ;
[0027] (3)因朝鲜蓟种皮较坚硬，进行适当的物理处理后的种子消毒后发芽率可达到 85%以上；
[0028] (4)本发明的方法具有种苗快繁效率高、成本低、前景好等优势。
【专利附图】
【附图说明】
[0029] 图1是经消毒处理后进行试管播种的朝鲜蓟种子的示意图。
[0030] 图2是朝鲜蓟种子发芽后自然形式的示意图。
[0031] 图3是朝鲜蓟茎尖诱导后的丛芽的示意图。
[0032] 图4是朝鲜蓟种苗楼顶种植着生的花苞的示意图。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限 于此。
[0034] 实施例1 :
[0035] (1)从北京花仙子园艺有限公司购进朝鲜蓟（Cynara scolymus L.)优质种子；
[0036] (2)先将种子进行物理处理（黑暗条件下，30°C温水中恒温浸泡24小时），然 后在超净工作台上用特定的消毒剂（75% (v/v)酒精15s+2% (v/v)NaC1010min+lg/L HgCl215min)，进行种子消毒，再用无菌水浸洗4?5次，然后接种至种子培养基（其配方为 MS 培养基 +GA31. 0mg/L+ 活性炭 2g/L+ 卡拉胶（CAS9000-07-1) 7g/L+ 蔗糖 30g/L，ρΗ5· 6)中 进行暗培养，要求培养室温度23?28°C，湿度75%?85% ;(见图1)
[0037] (3) 15?25天后陆续有种子发芽，将发芽的种子挑出至新鲜的种子培养基（配方 与步骤⑵中的相同）中进行自然光照，温度23?28 °C，湿度75 %?85%，30?40天后 获得无菌实生苗（见图2);总发芽率可达到80%以上；
[0038] (4)当无菌实生苗高3. 5cm左右时，切取0. 7mm?1. 0mm的实生苗茎尖在丛芽诱 导培养基（MS 培养基 +6-BA2. 0mg/L+NAA0· 2mg/L+KT0. 2mg/L+ 琼脂 6. 8g/L+ 蔗糖 30g/L， ρΗ5· 6)中进行丛芽诱导（培养室温度23?28°C，10?15天，湿度75%?85%，暗培养）， 待茎尖膨大1?2倍后转入培养室自然光下培养15?20天，待开始转绿而且有芽点出现 时适当增加光照至2500?30001ux，再培养25?35天后获得丛芽（见图3)，丛芽诱导成 功率可达85% ;
[0039] (5)将步骤（4)获得的丛芽转至继代培养基（其配方为MS培养基+GA30· 5mg/ L+6-BA1. 5mg/L+CM (椰子汁）50g/L+卡拉胶7g/L+蔗糖30g/L，ρΗ5· 6)中，进行继代培养， 培养室温度23?28°C，15?25天，湿度75 %?85 %，光照强度3000?35001ux，获得健壮 无根苗；
[0040] (6)将步骤（5)中获得的健壮无根苗在试管生根培养基（1/2MS培养基 +ΙΒΑ0. 5mg/L+香蕉泥50g/L+活性炭2g/L+琼脂6. 8g/L+鹿糖20g/L，pH5. 7)中进行生根培 育，培养室温度23?28°C，培养20?30天，湿度75 %?85%，光照强度3500?4000lux， 获得朝鲜蓟优质种苗；
[0041] (7)将步骤（6)获得的种苗露地繁育（见图4)。
[0042] 实施例2 :
[0043] 本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤（2)采用消毒剂配方：75% (v/v)酒 精15s+2% (v/v)NaC1015min+lg/L HgCl215min进行种子消毒，再用无菌水浸洗4?5次， 然后接种至种子培养基上，可达到同样理想的效果。可见，lg/LHgCl 2的消毒溶液对朝鲜蓟 种子的消毒起着重要的作用。
[0044] 实施例3 :
[0045] 本实施例中的步骤（1)、（2)、（3)、（4)与实施例1中的步骤（1)、（2)、（3)、（4)相 同。
[0046] (5)将步骤（4)获得的丛芽转至继代培养基（其配方为MS培养基+ΝΑΑ0. 2mg/ L+6-BA1. Omg/L+CM (椰子汁）50g/L+卡拉胶7g/L+蔗糖30g/L，ρΗ5· 7)中进行继代培养，培 养室温度23?28°C，15?25天，湿度75 %?85%，光照强度3000?35001ux，同样可获得 健壮无根苗；
[0047] (6)将步骤（5)中获得的健壮无根苗在试管生根培养基（1/2MS培养基 +ΙΒΑ0. 2mg/L+香蕉泥30g/L+活性炭2g/L+琼脂6. 8g/L+蔗糖20g/L，ρΗ5· 8)中进行生根培 育，培养室温度23?28°C，培养20?30天，湿度75 %?85%，光照强度3500?4500lux， 亦可获得朝鲜蓟优质种苗；
[0048] (7)将步骤（6)获得的种苗露地繁育（结果与图4相近）。
[0049] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的 限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化， 均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1. 一种朝鲜蓟试管实生苗茎尖快繁育苗的方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 将朝鲜蓟（Cynara scolymus L.)种子进行物理处理后，再经消毒剂消毒，然后在种 子培养基中进行试管内播种、培育，将培育发芽的种子挑出至新鲜的种子培养基中进行自 然光照，获得无菌实生苗； (2) 在无菌条件中进行如下操作，将步骤（1)获得的无菌实生苗切取0. 7?1. Omm的实 生苗茎尖转入丛芽诱导培养基中进行诱导，再转入自然光照下进行培养，获得丛芽，然后将 丛芽转至继代培养基中，经继代培养后获得无根苗； (3) 将步骤（2)获得的无根苗转至试管生根培养基中，进行试管生根培育获得朝鲜蓟 优质种苗。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1)中所述的消毒剂的组成及消毒 条件为75%酒精158+2%似(：10(10?15)11^11+18/1取(：1 2(10?15)11^11。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1)中所述的种子培养基的组成为 MS 培养基 +GA3 (0 ?3. 0) mg/L+NAA (0 ?0· 2) mg/L+ 活性炭（0 ?2) g/L+ 卡拉胶（6. 8 ?7) g/L+蔗糖30g/L，pH5. 5?5. 7,其中，NAA为零时，GA3和活性炭均不为零。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2)中所述的丛芽诱导培养基的组 成为 MS 培养基 +6-BA (2. 0 ?5. 0) mg/L+NAA (0· 2 ?0· 5) mg/L+KT (0 ?0· 2) mg/L+ 琼脂 6. 8g/ L+ 鹿糖 30g/L，ρΗ5· 6。
5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2)中所述的继代培养基的组成为 MS 培养基 +ΝΑΑ (0 ?0· 5) mg/L+GA3 (0 ?0· 5) mg/L+6-BA (0 ?1. 5) mg/L+CM (0 ?50) g/L+ 卡 拉胶7g/L+蔗糖30g/L，pH5. 5?5. 7,其中，NAA、GA3、6-BA与CM不能同时为零。
6. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3)中所述的试管生根培养基的组 成为1/2MS培养基+IBA (0· 2?1. 0) mg/L+香蕉泥（0?50) g/L+活性炭（0?2) g/L+琼脂 6. 8g/L+ 鹿糖 20g/L，ρΗ5· 5 ?5. 8。
7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1)中所述的物理处理的条件为黑 暗条件下30?35°C恒温浸泡12?24h ; 步骤（1)中所述的培育的条件为黑暗条件下，环境温度23?28°C培育15?25天，培 养湿度为70 %?85% ; 步骤（1)中所述的进行自然光照的条件为23?28 °C自然光照30?40天，湿度为 70%?85%。
8. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2)中所述的诱导的条件为黑暗条 件下23?28°C诱导培养10?15天； 步骤（2)中所述的自然光照下进行培养的条件为待茎尖膨大1?2倍后转入培养 室自然光下培养15?20天，待开始转绿而且有芽点出现时适当增加光照强度至2500? 30001ux，再培养25?35天。
9. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2)中所述的继代培养的条件为温 度23?281：培养15?25天，湿度为70%?85%，光照强度3000?350011?。
10. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3)中所述的生根培育的条件为温 度23?28°C培育20?30天，湿度为70%?85%，光照强度3000?45001ux。
【文档编号】A01H4/00GK104145825SQ201410449833
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年9月4日 优先权日:2014年9月4日
【发明者】李进进, 廖俊杰, 张建军, 曾佑炜, 高阳林 申请人:东莞市睿绅生物技术有限公司, 广东轻工职业技术学院