一种菘蓝的组培快繁方法
【专利摘要】本发明公开了一种菘蓝的组培快繁方法，包括菘蓝无菌苗的获得、丛生芽的获得、生根培养、炼苗等步骤。本发明由于采用剥去外皮的菘蓝种子为实验材料，缩短了出苗时间，增加了出苗率。以MS+ 1.3-1.7 mg/L 6-BA + 0.5-1.0 mg/L NAA为丛生芽诱导培养基，缩短了丛生芽诱导时间，提高了丛生芽诱导率，为在短时间内获得大量丛生芽提供了保障。以1/2 MS + 0.3-0.7 mg/L IBA为生根培养基，获得了大量细长健壮的根系，为幼苗存活奠定了基础。由于炼苗时以蛭石、草炭、珍珠岩的混合物为培养介质，保证了幼苗成活率。
【专利说明】一种菘蓝的组培快繁方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药用植物组织培养和快速繁殖领域，具体地说，涉及十字花科菘蓝属 植物菘蓝的组织培养和快速繁殖方法。
【背景技术】
[0002] 菘蓝（J1Saii1SifltZigoiica Fortune),十字花科两年生草本植物，原产我国，有着悠 久的栽培历史，北方大部分地区都有栽培，南方相对较少。菘蓝的根、叶均供药用，有清热解 毒、凉血消斑、利咽止痛的功效。叶还可提取蓝色染料；种子榨油，供工业用。菘蓝的根称为 板蓝根（/fei/ijr isaiii/is)，为我国传统中药材，史载于《神农本草经》，1985年起录入《中 国药典》。板蓝根味苦、性寒，归心、胃经。主治流感、流脑、乙脑、肺炎、痒腮、丹毒、疮疹和咽 喉肿痛等症。板蓝根具有广泛的药理活性，不仅对特异性免疫、非特异性免疫、体液免疫和 细胞免疫有一定的促进作用，还有降血脂、抗内毒素、抗病毒、抗肿瘤、抗炎、抗菌、清除自由 基等作用。其使用也越来越广泛，以板蓝根为主要原料的产品层出不穷，如板蓝根冲剂、板 蓝根针剂、三九感冒灵、康必得等感冒和抗病毒类中成药等，因此对板蓝根药材的需求量日 益增多。
[0003] 组织培养技术是药用植物育种过程中一项基本技术，是组织脱毒和转基因技术研 究的基础。关于菘蓝的组织培养，开展过一些研究，主要内容集中于外植体的选择、不同培 养基对愈伤组织诱导和再生植株分化的影响。如客绍英等以菘蓝幼叶为外植体，对其诱导 培养过程中细胞启动、脱分化、组织分化和器官（芽和根）发生，进行了石蜡切片观察和分 析。李连华等以菘蓝愈伤组织为试验材料，分析比较了不同培养基对菘蓝愈伤组织增殖和 分化的影响。由于这些研究选用的试验材料不同、实验方法不同，因此得出的结论也不一 致。目前存在的缺点在于出苗诱导率较低，不能满足常规实验、生产需求。
【发明内容】
[0004] 本发明公开的菘蓝的组培快繁方法主要解决的是：提供一种能更快繁殖出菘蓝幼 苗、且诱导率更高、移栽成活率更高的菘蓝组培快繁方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明公开了如下的记述内容： 一种菘蓝的组培快繁方法，其特征在于按如下的步骤进行： (1) 菘蓝无菌苗的获得： 取菘蓝种子，剥去种皮，在超净工作台上放入灭菌的50mL三角瓶中，加入10mL75%的乙 醇浸泡30S,倒出乙醇,加入2. 5%的次氯酸钠溶液,消毒10-15min,倒出次氯酸钠,无菌水冲 洗5遍，取出种子放于IOOmL已灭菌的装有20mLMS培养基的三角瓶中，将三角瓶放于25°C 光照培养箱中，光强12001uX，每天光照16小时，3-4天后，种子发芽，约30天后，菘蓝苗长 至 IOcm ; (2) 丛生芽的获得： 在超净工作台上将菘蓝叶片剪成长Icm的小段放于灭菌的装有20mL丛生芽培养基 (MS+ I. 3-1. 7 mg/L 6-BA (6-苄氨基嘌呤）+ 0· 5-1. O mg/L NAA (萘乙酸）的 IOOmL 三角 瓶中，将三角瓶放置于22± I°C光照培养箱中，光强12001ux，每天光照16小时，25天后，长 出大量丛生芽，丛生芽诱导率达到97%，40天后，丛生芽高度达到l-2cm ; 诱导率（％) =出现丛生芽的外植体数/总外植体数X 100 (3) 生根培养： 在超净工作台上用灭菌剪刀剪下丛生芽，放置于灭菌的装有20mL生根培养基（1/2 MS + 0.3-0. 7 mg/L IBA (吲哚丁酸）的IOOmL三角瓶中，将三角瓶放置于23±1°C光照培养箱 中，光强12001ux，每天光照16小时，20天后，长出大量根，生根率达到95%。40天后，株商 达到IOcm ; 生根率（％) =生根的芽数/总芽数X 100 (4) 炼苗： 将步骤（3)中生根并已长至10-15cm的幼苗，打开封口膜置于温室中炼苗3-5天，洗去 根部培养基，移入灭菌处理过的体积份数比为蛭石：草炭：珍珠岩=15 :5 :2的混合介质中， 放置于温室中，上面覆薄膜，每天敞开薄膜，通风2次，20天后，幼苗成活率达96%。其中的 MS培养基是组培通用基础培养基(常规培养基)。
[0006] 本发明主要考查了如下的内容： (1) 菘蓝无菌苗的获得技术； (2) 获得菘蓝丛生芽的适宜培养基、光照条件及温度条件； (3) 菘蓝丛生芽生根的最佳条件，包括培养基、温度和光照； (4) 菘蓝组培苗移栽适宜条件。
[0007] 本发明公开的菘蓝的组培快繁方法与现有技术相比所具有的积极效果在于： (1)本发明采用剥去外皮的菘蓝种子为实验材料，缩短了出苗时间，增加了出苗率。其 中的消毒过程包括75%酒精消毒和2. 5%次氯酸钠消毒两个步骤，使得消毒更加彻底，为无 菌苗的获得奠定了良好的基础。
[0008] (2)本发明由于以优选的无菌、幼嫩的菘蓝叶片为外植体，为组培快繁的成功提供 了材料保证。特别是以剪切的菘蓝幼嫩叶片为外植体进行丛生芽诱导，使得诱导培养更容 易成功，保证了诱导效果。
[0009] (3)本发明以 MS+ L 3-1. 7 mg/L 6-BA + 0· 5-1. 0 mg/L NAA 为丛生芽诱导培养 基，缩短了丛生芽诱导时间，提高了丛生芽诱导率，采用1/2 MS + 0.3-0. 7 mg/L IBA为生 根培养基，保证了生根率，为获得健康的组培苗奠定了基础，为在短时间内获得大量组培苗 提供了保障。每天光照16小时，充分保证了光照需求，诱导更容易成功。
[0010] (4)本发明在炼苗时以蛭石、草炭、珍珠岩的混合物为培养介质，保证了幼苗成活 率。炼苗时，每天通风2次，保证了幼苗对空气和湿度的需求，提高了幼苗成活率。
【具体实施方式】
[0011] 以下结合较佳实施例，对本发明做进一步的描述，特别加以说明的是，菘蓝种子有 市售。MS培养基指的是植物组织培养通用基础培养基(有市售），其他的试剂6-苄氨基嘌 呤、萘乙酸等均由市售。
[0012] 实施例1. (1)菘蓝无菌苗的获得： 取菘蓝种子，剥去种皮，在超净工作台上放入灭菌的50mL三角瓶中，加入10mL75%的乙 醇浸泡30S，倒出乙醇，加入2. 5%的次氯酸钠溶液，消毒lOmin，倒出次氯酸钠，无菌水冲洗 5遍，取出种子放于IOOmL已灭菌的装有20mLMS培养基的三角瓶中。将三角瓶放于25°C光 照培养箱中，光强12001u X，每天光照16小时。3天后，种子发芽，约30天后，菘蓝苗长至 IOcm0
[0013] (2)丛生芽的获得： 在超净工作台上将菘蓝叶片剪成长Icm的小段放于灭菌的装有20mL丛生芽培养基 (MS+ 1.3 mg/L 6-BA + 0. 5 mg/L NAA)的IOOmL三角瓶中，将三角瓶放置于22±1°C光照 培养箱中，光强12001UX，每天光照16小时。大约25天后，长出大量丛生芽，丛生芽诱导率 达到97%，40天后，丛生芽高度达到lcm。
[0014] (3)生根培养 在超净：工作台上用灭菌剪刀剪下丛生芽，放置于灭菌的装有20mL生根培养基（1/2 MS + 0.3 mg/L IBA)的IOOmL三角瓶中，将三角瓶放置于23土 TC光照培养箱中，光强 12001ux，每天光照16小时。大约20天后，长出大量根，生根率达到95%。40天后，株高达 到 10cm。
[0015] (4:丨炼苗： 3中生根并已长至IOcm的幼苗，打开封口膜置于温室中炼苗3天，洗去根部培养基，移 入灭菌处理过的体积份数比为蛭石：草炭：珍珠岩=15 :5 :2的混合介质中，放置于温室中， 上面覆薄膜，每天敞开薄膜，通风2次，20天后，幼苗成活率达96%。
[0016] 实施例2. (1)菘蓝无菌苗的获得： 取菘蓝种子，剥去种皮，在超净工作台上放入灭菌的50mL三角瓶中，加入10mL75%的乙 醇浸泡30S，倒出乙醇，加入2. 5%的次氯酸钠溶液，消毒llmin，倒出次氯酸钠，无菌水冲洗 5遍，取出种子放于IOOmL已灭菌的装有20mLMS培养基的三角瓶中。将三角瓶放于25°C光 照培养箱中，光强12001u X，每天光照16小时。4天后，种子发芽，约30天后，菘蓝苗长至 IOcm0
[0017] (2)丛生芽的获得： 在超净工作台上将菘蓝叶片剪成长I. 5cm的小段放于灭菌的装有20mL丛生芽培养基 (MS+ 1.4mg/L 6-BA + 0. 6 mg/L NAA)的IOOmL三角瓶中，将三角瓶放置于22±1°C光照培 养箱中，光强12001UX，每天光照16小时。大约25天后，长出大量丛生芽，丛生芽诱导率达 到97%，40天后，丛生芽高度达到2cm。
[0018] (3)生根培养： 在超净工作台上用灭菌剪刀剪下丛生芽，放置于灭菌的装有20mL生根培养基（1/2 MS + 0.4 mg/L IBA)的IOOmL三角瓶中，将三角瓶放置于23土 TC光照培养箱中，光强 12001ux，每天光照16小时。大约20天后，长出大量根，生根率达到95%。40天后，株高达 到 10cm。
[0019] (4)炼苗： 将3中生根并已长至Ilcm的幼苗，打开封口膜置于温室中炼苗4天，洗去根部培养基， 移入灭菌处理过的体积份数比为蛭石：草炭：珍珠岩=15 :5 :2的混合介质中，放置于温室 中，上面覆薄膜，每天敞开薄膜，通风2次，20天后，幼苗成活率达96%。
[0020] 实施例3. (1)菘蓝无菌苗的获得： 取菘蓝种子，剥去种皮，在超净工作台上放入灭菌的50mL三角瓶中，加入10mL75%的乙 醇浸泡30S，倒出乙醇，加入2. 5%的次氯酸钠溶液，消毒12min，倒出次氯酸钠，无菌水冲洗 5遍，取出种子放于IOOmL已灭菌的装有20mLMS培养基的三角瓶中。将三角瓶放于25°C光 照培养箱中，光强12001u X，每天光照16小时。3天后，种子发芽，约30天后，菘蓝苗长至 IOcm0
[0021] (2)丛生芽的获得： 在超净工作台上将菘蓝叶片剪成长2 cm的小段放于灭菌的装有20mL丛生芽培养基 (MS+ 1.5 mg/L 6-BA + 0. 7 mg/L NAA)的IOOmL三角瓶中，将三角瓶放置22±1°C光照培 养箱中，光强12001UX，每天光照16小时。大约25天后，长出大量丛生芽，丛生芽诱导率达 到97%，40天后，丛生芽高度达到lcm。
[0022] (3)生根培养： 在超净工作台上用灭菌剪刀剪下丛生芽，放置于灭菌的装有20mL生根培养基（1/2 MS + 0.5 mg/L IBA)的IOOmL三角瓶中，将三角瓶放置于23土 TC光照培养箱中，光强 12001ux，每天光照16小时。大约20天后，长出大量根，生根率达到95%。40天后，株高达 到 10cm。
[0023] (4)炼苗： 将3中生根并已长至12cm的幼苗，打开封口膜置于温室中炼苗5天，洗去根部培养基， 移入灭菌处理过的体积份数比为蛭石：草炭：珍珠岩=15 :5 :2的混合介质中，放置于温室 中，上面覆薄膜，每天敞开薄膜，通风2次，20天后，幼苗成活率达96%。。
[0024] 实施例4. (1)菘蓝无菌苗的获得： 取菘蓝种子，剥去种皮，在超净工作台上放入灭菌的50mL三角瓶中，加入10mL75%的乙 醇浸泡30S，倒出乙醇，加入2. 5%的次氯酸钠溶液，消毒13min，倒出次氯酸钠，无菌水冲洗 5遍，取出种子放于IOOmL已灭菌的装有20mLMS培养基的三角瓶中。将三角瓶放于25°C光 照培养箱中，光强12001u X，每天光照16小时。3天后，种子发芽，约30天后，菘蓝苗长至 IOcm0
[0025] (2)丛生芽的获得： 在超净工作台上将菘蓝叶片剪成长Icm的小段放于灭菌的装有20mL丛生芽培养基 (MS+ 1.6 mg/L 6-BA + 0. 8 mg/L NAA)的IOOmL三角瓶中，将三角瓶放置于22±1°C光照 培养箱中，光强12001UX，每天光照16小时。大约25天后，长出大量丛生芽，丛生芽诱导率 达到97%，40天后，丛生芽高度达到l-2cm。
[0026] (3)生根培养： 在超净工作台上用灭菌剪刀剪下丛生芽，放置于灭菌的装有20mL生根培养基（1/2 MS + 0.6 mg/L IBA)的IOOmL三角瓶中，将三角瓶放置于23土 TC光照培养箱中，光强 12001ux，每天光照16小时。大约20天后，长出大量根，生根率达到95%。40天后，株高达 到 10cm。
[0027] (4)炼苗： 将3中生根并已长至13cm的幼苗，打开封口膜置于温室中炼苗3天，洗去根部培养基， 移入灭菌处理过的体积份数比为蛭石：草炭：珍珠岩=15 :5 :2的混合介质中，放置于温室 中，上面覆薄膜，每天敞开薄膜，通风2次，20天后，幼苗成活率达96%。
[0028] 实施例δα) 菘蓝无菌苗的获得： 取菘蓝种子，剥去种皮，在超净工作台上放入灭菌的50mL三角瓶中，加入10mL75%的乙 醇浸泡30S，倒出乙醇，加入2. 5%的次氯酸钠溶液，消毒14min，倒出次氯酸钠，无菌水冲洗 5遍，取出种子放于IOOmL已灭菌的装有20mLMS培养基的三角瓶中。将三角瓶放于25°C光 照培养箱中，光强12001u X，每天光照16小时。4天后，种子发芽，约30天后，菘蓝苗长至 10cm。
[0029] (2)丛生芽的获得： 在超净工作台上将菘蓝叶片剪成长I. 5 cm的小段放于灭菌的装有20mL丛生芽培养基 (MS+ 1.9 mg/L 6-BA + 0. 9 mg/L NAA)的IOOmL三角瓶中，将三角瓶放置于22±1°C光照 培养箱中，光强12001UX，每天光照16小时。大约25天后，长出大量丛生芽，丛生芽诱导率 达到97%，40天后，丛生芽高度达到l-2cm。
[0030] (3)生根培养： 在超净工作台上用灭菌剪刀剪下丛生芽，放置于灭菌的装有20mL生根培养基（1/2 MS + 0.7 mg/L IBA)的IOOmL三角瓶中，将三角瓶放置于23土 TC光照培养箱中，光强 12001ux，每天光照16小时。大约20天后，长出大量根，生根率达到95%。40天后，株高达 到 10cm。
[0031] (4)炼苗： 将3中生根并已长至14cm的幼苗，打开封口膜置于温室中炼苗4天，洗去根部培养基， 移入灭菌处理过的体积份数比为蛭石：草炭：珍珠岩=15 :5 :2的混合介质中，放置于温室 中，上面覆薄膜，每天敞开薄膜，通风2次，20天后，幼苗成活率达96%。
[0032] 实施例θα) 菘蓝无菌苗的获得： 取菘蓝种子，剥去种皮，在超净工作台上放入灭菌的50mL三角瓶中，加入10mL75%的乙 醇浸泡30S，倒出乙醇，加入2. 5%的次氯酸钠溶液，消毒15 min，倒出次氯酸钠，无菌水冲洗 5遍，取出种子放于IOOmL已灭菌的装有20mL，MS培养基的三角瓶中。将三角瓶放于25°C 光照培养箱中，光强12001uX，每天光照16小时。3天后，种子发芽，约30天后，菘蓝苗长至 IOcm0
[0033] (2)丛生芽的获得： 在超净工作台上将菘蓝叶片剪成长Icm的小段放于灭菌的装有20mL丛生芽培养基 (MS+2. 0 mg/L 6-BA + 1.0 mg/L NAA)的IOOmL三角瓶中，将三角瓶放置于22±1°C光照培 养箱中，光强12001UX，每天光照16小时。大约25天后，长出大量丛生芽，丛生芽诱导率达 到97%，40天后，丛生芽高度达到2cm。
[0034] (3)生根培养： 在超净工作台上用灭菌剪刀剪下丛生芽，放置于灭菌的装有20mL生根培养基（1/2 MS + 0.6 mg/L IBA)的IOOmL三角瓶中，将三角瓶放置于23土 TC光照培养箱中，光强 12001ux，每天光照16小时。大约20天后，长出大量根，生根率达到95%。40天后，株高达 到 10cm。
[0035] ⑷炼苗 将3中生根并已长至15 cm的幼苗，打开封口膜置于温室中炼苗5天，洗去根部培养 基，移入灭菌处理过的体积份数比为蛭石：草炭：珍珠岩=15 :5 :2的混合介质中，放置于温 室中，上面覆薄膜，每天敞开薄膜，通风2次，20天后，幼苗成活率达96%。
[0036] 实施例7 对比试验：
【权利要求】
1. 一种菘蓝的组培快繁方法，其特征在于按如下的步骤进行： (1) 菘蓝无菌苗的获得：取菘蓝种子，剥去种皮，在超净工作台上放入灭菌的50mL三角 瓶中，加入10mL75%的乙醇浸泡30S，倒出乙醇，加入2. 5%的次氯酸钠溶液，消毒10-15min， 倒出次氯酸钠，无菌水冲洗5遍，取出种子放于lOOmL已灭菌的装有20mLMS培养基的三角 瓶中，将三角瓶放于25°C光照培养箱中，光强12001UX，每天光照16小时，3-4天后，种子发 芽，约30天后，菘蓝苗长至10cm ; (2) 丛生芽的获得：在超净工作台上将菘蓝叶片剪成长lcm的小段放于灭菌的装有 20mL丛生芽培养基MS+ 1.3-1.7 mg/L 6-BA + 0.5-1.0 mg/L NAA 的 lOOmL三角瓶中，将三 角瓶放置于22±1°C光照培养箱中，光强12001UX，每天光照16小时，25天后，长出大量丛 生芽，40天后，丛生芽高度达到l-2cm ; (3) 生根培养：在超净工作台上用灭菌剪刀剪下丛生芽，放置于灭菌的装有20mL生根 培养基1/2 MS + 0.3-0. 7 mg/L IBA的lOOmL三角瓶中，将三角瓶放置于23 ±1°C光照培养 箱中，光强12001ux，每天光照16小时，20天后，长出大量根，40天后，株高达到10cm ; (4) 炼苗：将步骤（3)中生根并已长至10-15cm的幼苗，打开封口膜置于温室中炼苗3-5 天，洗去根部培养基，移入灭菌处理过的体积份数比为蛭石：草炭：珍珠岩=15 :5 :2的混合 介质中，放置于温室中，上面覆薄膜，每天敞开薄膜，通风2次，20天后，幼苗成活率达96%。
【文档编号】A01H4/00GK104488724SQ201410832705
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月29日 优先权日:2014年12月29日
【发明者】刘玉堂, 岳东霞, 赵宪争, 尉万聪, 杨迎霞, 周祥明, 宋兆伟 申请人:天津市农业生物技术研究中心