一种大蒜根尖分生组织再生的方法及应用与流程

技术领域

本发明属于农业生物工程技术领域，涉及大蒜组织培养与快繁的方法，更具体的说是构建一种大蒜根尖分生组织再生的方法。

背景技术：

大蒜作为无性繁殖作物，生产上多以大蒜瓣为种子进行种植，生产成本高、繁殖系数低、病毒积累、种性退化等问题严重影响大蒜生产。寻找大蒜快繁、脱毒以及种质遗传改良技术迫在眉睫。前人工作中构建了多种大蒜快繁脱毒技术体系，如用大蒜幼叶、全展叶根尖、茎尖、花序轴等为外植体构建大蒜组织培养体系；张素芝等利用大蒜茎盘进行愈伤组织的诱导，并获得了适宜于愈伤组织增殖分化的培养基；Luciani 等以大蒜茎尖为外植体诱导出再生能力较强的愈伤组织；张昌伟等则通过大蒜根尖直接诱导不定芽，得到试管苗并成功的得到了试管鳞茎。大蒜根尖分生组织处于生长顶端，分生组织细胞分裂快，带毒量少甚至不带毒，且一颗蒜瓣可以发几条甚至几十条根，实验取材方便，较大蒜茎尖比较，每一颗蒜瓣只有一个茎尖，用于愈伤组织诱导的茎尖需要在解剖镜下剥离，后期的消毒程度对愈伤组织诱导也有一定的影响。

本发明采用大蒜蒜瓣整体消毒后，无菌条件下发根，以根尖分生组织为外植体，通过高频诱导愈伤组织、诱导再生不定芽和试管鳞茎，构建再生技术体系， 所得试管鳞茎均具有储藏叶，可直接种于大田，易于管理，能明显提高试管苗的移栽成活率。

技术实现要素：

本发明的目的在于公开了一种大蒜根尖分生组织再生的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）以大蒜根尖分生组织为外植体诱导愈伤组织：

选取没有病斑的大蒜鳞茎剥去外皮后自来水冲洗30 min，然后于紫外灭菌后的超净工作台中用0.1%（w/w）的 HgCl₂浸泡20 min，无菌蒸馏水洗涤2-3次，75%（w/w）的酒精浸泡10 min，无菌蒸馏水洗涤3-5遍后，将大蒜鳞茎接入无菌培养瓶中生根；待根长至2-3cm时，切下大蒜根部，用解剖针纵划，将其接入筛选培养基中进行愈伤组织诱导；诱导培养基为MS+1 mg·L^-1 2,4-D+ 1 mg·L^-1 6-BA+30.0 g· L^-1 蔗糖+7.5 g ·L^-1 琼脂，pH=5.8；愈伤组织诱导率达97.5%；

（2）大蒜根尖愈伤组织继代和再分化：

大蒜根尖愈伤组织在诱导培养基上生长4周后，可进行继代，继代培养约2周时，愈伤组织颗粒感明显，呈浅黄色，继代培养4周时，愈伤组织增值明显，继代两次后进行再分化，继代培养基与诱导培养基相同，再分化培养基为：

MS+3 mg·L^-16-BA+30g·L^-1蔗糖+7.5g·L^-1琼脂，pH=5.8；

（3）试管鳞茎诱导与收获

再分化培养1周时愈伤组织表面开始出现大量的绿点，2周可以观察到绿点不断生长，逐渐形成不定芽，3周时，大部分绿点形成不定芽，4周不定芽长至约2cm，7周后不定芽生长长至5-8 cm的簇生试管苗，将簇生试管苗移入诱导试管鳞茎培养基，其培养基为MS + 120 g · L^-1 绵白糖 + 6.8 g · L^-1琼脂， pH=7.5，试管鳞茎成熟后取出，清洗表层培养基后阴干，放4 ℃冰箱低温储存。

本发明进一步公开了大蒜根尖分生组织再生的方法在提高组培苗成活率方面的应用。实验结果证明：用大蒜无菌根为外植体诱导愈伤组织，诱导率达97.5%；愈伤组织再生率可达85%，试管鳞茎的诱导率达95%以上。通过组培途径诱导发育的试管鳞茎对环境适应性强，耐贮藏，易成活。本发明通过大蒜根尖分生组织诱导的愈伤组织，诱导再生植株进而获得试管鳞茎，这些试管鳞茎均具有储藏叶，即均具有发芽的潜力。为大蒜组织培养途径脱毒快繁提供了新的技术方法。

本发明以大蒜根尖分生组织为外植体诱导愈伤组织，愈伤组织经过继代培养，诱导再生试管苗，试管苗直接诱导成具有萌发能力的试管鳞茎，避免了试管苗经过生根、炼苗、移栽等繁琐过程，提高了试管苗成活率。同时与通过茎尖组培途径相比，虽然根尖和茎尖都处于生长点，都有天然脱毒的效果，但每一个大蒜瓣只有一个茎尖，用于愈伤组织诱导的茎尖需要在解剖镜下剥离，后期的消毒程度对愈伤组织诱导也有一定的影响；而一个大蒜瓣可以发出几条或几十条根，大蒜瓣可以整体消毒后再进行根的诱导萌发，实验取材方便，材料量充足。

本发明更加详细的描述如下：

（1）大蒜根尖分生组织获得：

选取没有病斑的大蒜鳞茎剥去外皮后自来水冲洗30 min，然后于紫外灭菌后的超净工作台中用0.1%（w/w）的 HgCl₂浸泡20 min，无菌蒸馏水洗涤2-3次，75%（w/w）的酒精浸泡10 min，无菌蒸馏水洗涤3-5遍后，将大蒜鳞茎接入无菌培养瓶中生根；

（2）以大蒜根尖分生组织为外植体诱导愈伤组织：

待（1）中培养的无菌根长至2-3cm时，切下大蒜根部，用于愈伤组织诱导。诱导培养基为MS+1 mg·L^-1 2,4-D+ 1 mg·L^-1 6-BA+30.0 g· L^-1 蔗糖+7.5 g ·L^-1 琼脂，pH=5.8，诱导率达97.5%。其具体的方法如下：将切下大蒜根用无菌解剖针纵向划开制造伤口，接入愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导。经过1周左右，大蒜根尖分生组织区出现膨大现象并变为浅褐色；大约2周后；大蒜根尖分生组织区持续膨大并变为浅黄色；3周后大蒜根尖分生组织区出现明显的组织结构，呈浅黄色半透明状态；大约4周后，大蒜根尖分生区有明显的块状愈伤组织生成。

（3）大蒜根尖愈伤组织继代和再分化：

大蒜根尖愈伤组织在诱导培养基上生长4周后，可进行继代。具体方法为：继代培养约2周时，愈伤组织颗粒感明显，呈浅黄色。继代培养约4周时，愈伤组织增值明显。继代两次后进行再分化。继代培养基与诱导培养基相同，再分化培养基为：MS+3 mg·L^-16-BA+30g·L^-1蔗糖+7.5g·L^-1琼脂，pH=5.8。

（4）试管鳞茎诱导与收获：

再分化培养1周左右时愈伤组织表面开始出现大量的绿点，约2周左右可以观察到绿点不断生长，逐渐形成不定芽，3周左右时，大部分绿点形成不定芽，4周左右不定芽长至约2cm，7周后不定芽长至5-8 cm的簇生试管苗，将簇生试管苗移入诱导试管鳞茎培养基，其培养基为MS + 120 g · L^-1 绵白糖 + 6.8 g · L^-1琼脂， pH=7.5，试管鳞茎成熟后取出，清洗表层培养基后阴干，放4 ℃冰箱低温储存。

本发明所述的NAA是 a-萘乙酸（1-naphthlcetic acid），简称NAA ； KT是激动素（Kinetin）,简称KT；

所述的MS基本培养基配方：

每1L基本培养基中含有：KNO₃ 1900mg, NH₄NO₃ 1650mg, MgSO₄∙7H₂O 370 mg, KH₂PO₄ 170 mg, CaCl₂∙2H₂O 440 mg, MnSO₄∙4H₂O 22.3 mg, ZnSO₄∙7H₂O 8.6 mg, H₃BO₃ 6.2 mg, KI 0.83 mg, Na₂MO₃∙2H₂O 0.25 mg, CuSO₄∙5H₂O 0.025 mg, CoCl₂∙6H₂O 0.025 mg, Na₂-EDTA 37.7 mg, FeSO₄∙7H₂O 27.8 mg, 甘氨酸2.0 mg, 盐酸硫胺素0.4 mg, 盐酸吡哆素0.5 mg, 烟酸0.5 mg, 肌醇100 mg。

下面本发明以典型的天津市宝坻大蒜快繁为代表，更加具体的说明实施方案：

（1）大蒜根尖分生组织获得：

选取没有病斑的宝坻大蒜“六瓣红”鳞茎，剥去外皮后自来水冲洗30 min，然后于紫外灭菌后的超净工作台中用0.1%（w/w）的 HgCl₂浸泡20 min，无菌蒸馏水洗涤2-3次，75%（w/w）的酒精浸泡10 min，无菌蒸馏水洗涤3-5遍后，将大蒜鳞茎接入无菌培养瓶中生根；

（2）以大蒜根尖分生组织为外植体诱导愈伤组织：

待（1）中培养的无菌根长至2-3cm时，用无菌手术刀切下大蒜根部，将切下大蒜根用无菌解剖针纵向划开制造伤口，接入愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导。诱导培养基为MS+1 mg·L^-1 2,4-D+ 1 mg·L^-1 6-BA+30.0 g· L^-1 蔗糖+7.5 g ·L^-1 琼脂，pH=5.8。经过1周左右，大蒜根尖分生组织区出现膨大现象并变为浅褐色；愈伤组织持续生长，大约2周后，大蒜根尖分生组织区持续膨大并变为浅黄色；3周后，大蒜根尖分生组织区出现明显的组织结构，呈浅黄色半透明状态；大约4周后，大蒜根尖分生区有明显的块状愈伤组织生成。统计愈伤组织诱导率（诱导出愈伤组织根数/接入培养基总根数%），最高达97.5%。

（3）大蒜根尖愈伤组织继代和再分化：

大蒜根尖愈伤组织在诱导培养基上生长4周后，可进行继代。继代培养基与诱导培养基相同。继代培养约2周时，愈伤组织颗粒感明显，呈浅黄色。继代培养约4周时，愈伤组织增值明显。继代两次后将愈伤组织接种到再分化培养基上进行再分化诱导。再分化培养基为：MS+3 mg·L^-16-BA+30g·L^-1蔗糖+7.5g·L^-1琼脂，pH=5.8。

（4）试管鳞茎诱导与收获

在再分化培养基上培养约7周后，不定芽已经长成簇生试管苗，簇生试管苗的高度达到5-8 cm，即可将簇生试管苗移入诱导试管鳞茎培养基，其试管鳞茎诱导培养基为MS + 120 g · L^-1 绵白糖 + 6.8 g · L^-1琼脂， pH=7.5，约6周后，95%的试管苗诱导成试管鳞茎，将成熟的试管鳞茎取出，清洗表层培养基后阴干，放4 ℃冰箱低温储存。

（5）试管鳞茎萌发潜力检测：

将收获的试管鳞茎进行纵向解剖，观察其是否存在储藏叶，可清晰观察到储藏叶的试管鳞茎即具有萌发潜力，可于田间种植形成再生植株。

本发明公开的大蒜根尖分生组织再生的方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：

（1）该方法的核心是用大蒜根尖分生组织为外植体诱导愈伤组织，愈伤组织经过继代培养，再分化出试管苗，试管苗诱导成试管鳞茎。愈伤组织诱导率达97.5%，愈伤组织再生率可达85%，试管鳞茎的诱导率达95%以上。

（2）通过组培途径诱导发育的试管鳞茎对环境适应性强，耐贮藏，易成活。本发明获得的试管鳞茎均具有储藏叶，即均具有发芽的潜力。为大蒜组织培养途径脱毒快繁提供了新的技术方法。

（3）本发明以大蒜根尖分生组织为外植体诱导愈伤组织，愈伤组织经过继代培养，诱导再生试管苗，试管苗直接诱导成具有萌发能力的试管鳞茎，避免了试管苗经过生根、炼苗、移栽等繁琐过程，提高了试管苗成活率。同时与通过茎尖组培途径相比，虽然根尖和茎尖都处于生长点，都有天然脱毒的效果，但每一个大蒜瓣只有一个茎尖，用于愈伤组织诱导的茎尖需要在解剖镜下剥离，后期的消毒程度对愈伤组织诱导也有一定的影响；而一个大蒜瓣可以发出几条或几十条根，大蒜瓣可以整体消毒后再进行根的诱导萌发，实验取材方便，材料量充足。

（4）本发明构建以大蒜根尖分生组织为外植体，通过愈伤组织诱导、再分化、试管鳞茎诱导以及试管鳞茎萌发潜力检测的完整方法，该方法在国内外尚未见相关报道。

附图说明

图1为大蒜水培养生根；

图2为大蒜根尖诱导愈伤；其中a.大蒜根部接入筛选培养基中，b-e. 大蒜根尖诱导愈伤组织1周、2周、3周、4周的生长状况培养；

图3为解剖镜下观察大蒜根尖诱导愈伤组织；其中a.大蒜根部接入筛选培养基中，b-e. 大蒜根尖诱导愈伤组织1周、2周、3周、4周的生长状况培养；

图4为大蒜根尖愈伤组织再分化及再生试管苗；其中a.愈伤组织接入继代培养基中b-c.愈伤组织继代2周、5周d.继代两次后接入分化培养基中e-i. 分化培养1周、2周、3周、4周、7周的试管苗再生过程；

图5为诱导再生苗试管鳞茎；其中a.接入诱导试管鳞茎培养基，b-f. 分别为诱导1周、2周、3周、4周、6周的试管鳞茎；

图6为试管鳞茎形态及生长点；a. 试管鳞茎b.试管鳞茎生长点（图中箭头所示位置）。

具体实施方式

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。其中本发明所用到的NAA，KT， 蔗糖，10%安替福民、琼脂、六瓣红大蒜均有市售。

实施例1

一种大蒜根尖分生组织再生的方法：

（1）以大蒜根尖分生组织为外植体诱导愈伤组织：

选取没有病斑的大蒜鳞茎剥去外皮后自来水冲洗30 min，然后于紫外灭菌后的超净工作台中用0.1%（w/w）的 HgCl₂浸泡20 min，无菌蒸馏水洗涤2次，75%（w/w）的酒精浸泡10 min，无菌蒸馏水洗涤3遍后，将大蒜鳞茎接入无菌培养瓶中生根；待根长至2cm时，切下大蒜根部，用解剖针纵划，将其接入筛选培养基中进行愈伤组织诱导；诱导培养基为MS+1 mg·L^-1 2,4-D+ 1 mg·L^-1 6-BA+30.0 g· L^-1 蔗糖+7.5 g ·L^-1 琼脂，pH=5.8；

（2）大蒜根尖愈伤组织继代和再分化：

大蒜根尖愈伤组织在诱导培养基上生长4周后，可进行继代，继代培养约2周时，愈伤组织颗粒感明显，呈浅黄色，继代培养4周时，愈伤组织增值明显，继代两次后进行再分化，继代培养基与诱导培养基相同，再分化培养基为：

MS+3 mg·L^-16-BA+30g·L^-1蔗糖+7.5g·L^-1琼脂，pH=5.8；

（3）试管鳞茎诱导与收获

再分化培养1周时愈伤组织表面开始出现大量的绿点，2周可以观察到绿点不断生长，逐渐形成不定芽，3周时，大部分绿点形成不定芽，4周不定芽长至约2cm，7周后不定芽生长长至6cm的簇生试管苗，将簇生试管苗移入诱导试管鳞茎培养基，其培养基为MS + 120 g · L^-1 绵白糖 + 6.8 g · L^-1琼脂， pH=7.5，试管鳞茎成熟后取出，清洗表层培养基后阴干，放4 ℃冰箱低温储存.

实施例2

（1）大蒜根尖分生组织获得：

选取没有病斑的宝坻大蒜“六瓣红”鳞茎，剥去外皮后自来水冲洗30 min，然后于紫外灭菌后的超净工作台中用0.1%（w/w）的 HgCl₂浸泡20 min，无菌蒸馏水洗涤2-3次，75%（w/w）的酒精浸泡10 min，无菌蒸馏水洗涤3-5遍后，将大蒜鳞茎接入无菌培养瓶中生根；大蒜鳞茎刚接入生根培养瓶中时，基部已经生长出0.2-0.3cm的根部（见图1-a），在水中培养3天后，大蒜根部长至2-3cm（见图1-b），可接入诱导愈伤培养基中。

（2）以大蒜根尖分生组织为外植体诱导愈伤组织

待大蒜根部长至2-3cm时，切下大蒜根部，用解剖针纵划，将其接入筛选培养基中进行诱导，并观察其诱导情况。

本发明以MS为基本培养基，通过添加不同激素种类和浓度设计了16种筛选培养基（见表1），同时附加蔗糖30g·L^-1，琼脂7.5g·L^-1，pH=5.8，121 ℃ (1.03×10⁵ Pa)灭菌20 min后使用。表1为大蒜根尖诱导愈伤筛选培养基：

表1 筛选培养基激素配比

由于不同激素种类（2，4-D和6-BA）及浓度对不定芽再生效率有一定的影响，我们设计了16种筛选培养基，将大蒜根部长至2-3cm时接入上述筛选培养基中，每瓶中均接入40条根，以2周时间出愈伤组织条数/40来计算愈伤组织诱导率，统计愈伤组织形成的诱导率，确定最佳诱导培养条件，其结果如下表所示：

表2 不同激素配比对宝坻大蒜根尖诱导形成愈伤组织的影响

从表2可以看出，培养基1到8号中，只有2,4-D，其诱导率较低，而培养基9到16号中，在相同浓度的2,4-D条件下，其诱导率均比1到8号高，说明2，4-D对大蒜根尖的愈伤组织有诱导作用，但是当2，4-D与6-BA相互作用时，其诱导率更高。因此，诱导大蒜根尖形成愈伤组织的最佳培养基为：10号培养基，即：MS+1 mg·L^-1 2,4-D+ 1 mg·L^-1 6-BA+30.0 g· L^-1 蔗糖+7.5 g ·L^-1 琼脂，pH=5.8，诱导率达到97.5%。图1是在最佳诱导培养基上诱导愈伤组织各环节：刚接入培养基时未见明显膨大（图2-a）。经过1周左右，大蒜根尖分生组织区出现膨大现象并变为浅褐色（图2-b）。愈伤组织持续生长，大约2周后，大蒜根尖分生组织区持续膨大并变为浅黄色（图2-c）。3周后，大蒜根尖分生组织区出现明显的组织结构，呈浅黄色半透明状态（图2-d）。大约4周后，大蒜根尖分生区有明显的块状愈伤组织生成（图2-e）。最终确定出愈率最高的培养基为MS+1 mg·L^-1 2,4-D+ 1 mg·L^-1 6-BA+30.0 g· L^-1 蔗糖+7.5 g ·L^-1 琼脂，pH=5.8。图3展示的解剖镜下根尖愈伤组织的形成过程：在解剖镜下观察大蒜根尖诱导形成愈伤组织过程见图3，刚接入诱导培养基时，大蒜根尖无变化。在诱导培养基中生长1周左右时间，大蒜根尖分生组织区膨大，为淡黄色（图3-a）。2周左右时间，分生组织区持续膨大，为浅黄色，呈半透明状态（图3-b）。3周后，分生组织区出现明显块状组织（图3-d）。4周后，分生组织区块状结构增大，可进行继代培养（图3-e）。

（3）大蒜根尖愈伤组织继代和再分化：

大蒜根尖分生组织区形成的愈伤组织在诱导培养基上生长4周后，可进行继代（图4-a）。继代培养约2周时，愈伤组织颗粒感明显，呈浅黄色（图4-b）。继代培养约4周时，愈伤组织增值明显（图4-c）。继代两次后，愈伤组织可以进行分化（图4-d），1周左右时愈伤组织表面开始出现大量的绿点（图4-e），约2周左右可以观察到绿点不断生长，逐渐形成不定芽（图4-f），3周左右时，大部分绿点形成不定芽（图4-g），4周左右不定芽长至约2cm（图4-h），7周后不定芽生长旺盛，约5 cm左右，可用于诱导试管鳞茎（图4-i）。

（4）试管鳞茎诱导与收获

在再分化培养基上培养约7周后，不定芽已经长成簇生试管苗，簇生试管苗的高度达到5-8 cm，即可将簇生试管苗移入诱导试管鳞茎培养基，诱导试管鳞茎的培养基为：MS+120g· L^-1绵白糖+6.8g· L^-1琼脂，pH=7.5。从图5中可以看到，诱导大约1周后，试管苗根部开始膨大（图5-b）；2周后，试管苗出现枯萎（图5-c）；3周时，鳞茎外表皮逐渐变为紫色（图5-d）；4周时，诱导形成的试管鳞茎大部分外表皮变为紫色，试管苗枯萎现象严重（图5-e）；6周后，试管苗枯萎，试管鳞茎基本成熟（图5-f）。此时，将试管鳞茎从培养瓶中取出，洗去表面培养基，于阴凉处晾干。

（5）试管鳞茎萌发潜力检测：

将收获的试管鳞茎在解剖镜下纵向剖开，进行解剖观察，观察其是否存在储藏叶，可清晰观察到储藏叶的试管鳞茎即具有萌发潜力。图6为试管鳞茎纵向解剖图，可清晰观察到生长点（图6-a-b），表明收获的试管鳞茎可于田间再生出植株，这为后期再生植株在田间正常生长以及性状观察奠定了基础。