一种席草的多倍体诱导方法与流程

本发明涉及植物育种领域，具体涉及席草的多倍体诱导方法。
背景技术：
：席草(JuncuseffususL.)是极佳的天然绿色植物纤维之一，因此宜于编织，使用席草编织的各类产品具有通气、吸湿、清凉的作用，特别是席草茎具有调节干湿的功能。夏季能保持适度的干燥，使人的皮肤感触异常舒适，冬季保温性能良好，因此席草编织品已成为人们日常生活中不可缺少的家庭日常用品，也是一种独特的室内时尚装饰品，深受广大消费者喜爱。虽然现在各式各样的塑料、化纤、竹子等编织品，花色繁多，但是席草编织品的众多特性和优点是其他产品无法所替代的。日本人喜用席草编织品作为室内装饰和睡眠。据说有调节空气，促进新陈代谢的作用。据我国明朝医学家李时珍著的《本草纲目》及有关医学书《本草从新》、《韩氏医通》等记述：席草根茎可作药用。有利尿、安眠、止血、治小儿夜啼等功效。席草的编织与一般布匹的生产方式相近，也是以经纬交织而成，用原色或染色的席草，再依编织程序卡的设计，但要生产出各种多样优雅美丽的席面，需要品质好、韧性度高的席草，长应在130cm左右，一草到底不拼接。近年来，席草连年采用分株繁殖，导致品种退化严重，一般长为100cm左右，最长仅120cm左右，而且茎韧性越来越差，容易断裂。此外，在席草的多倍体诱变过程中发现，采用常用的多倍体诱变剂秋水仙素、二甲基亚砜、安磺灵及浓度等浸泡处理对席草的外植体毒害很大，致死率达到95％以上，导致多倍体诱变率低。本发明的目的是针对上述问题，利用席草组织培养和多倍体诱变的双重优势，使再生植株染色体加倍，诱导产生多倍体席草来提高其产量和品质，克服席草长期分株种植中出现品种退化问题。技术实现要素：本发明的目的，结合席草的组织培养和多倍体诱变的双重优势，提供一种在最短的时间获得大量诱变试管苗的诱变方法，该方法具有稳定性好、操作简便、诱变效率高的优点。本发明的目的是通过以下方式实现的：一种席草的多倍体诱导方法，包括以下步骤：(1)预处理：将席草无菌苗浸泡于多倍体诱导剂中处理，所述的多倍体诱导剂是含有已过滤灭菌的安磺灵0.1-0.5mg/L，优选0.1mg/L的水溶液，浸泡处理时间为30-60min，优选60min；(2)共培养：将步骤(1)浸泡处理后的无菌苗取出，放置无菌滤纸上晾干后直接接种到包含安磺灵的增殖培养基上培养；(3)多倍体鉴定：选择步骤(2)培养获得的且表型变异明显的植株进行生根，然后取变异苗根尖包含有分生区部位的部分，进行染色体核型鉴定；染色体数目以染色体组为单位成倍增加的即为多倍体；(4)移栽管理：将鉴定为四倍体的植株，打开瓶盖炼苗，取出清洗根部培养基，随后将幼苗直接移栽至水田。步骤(1)预处理是将0.5-1.0cm高的席草无菌苗浸泡于多倍体诱导剂中处理。步骤(1)处理温度为4-25℃，优选4℃。步骤(2)共培养是将步骤(1)浸泡处理后的无菌苗取出，放置无菌滤纸上晾干后直接接种到包含0.01-0.05mg/L,优选0.03mg/L安磺灵的增殖培养基上培养。步骤(2)共培养是25℃，光照培养30-60d，优选60d，每天光照10小时，光照强度1000lx。步骤(2)的增殖培养基配方为1/2MS+6-BA1.2～4.5mg/L的琼脂固体培养基，优选1/2MS+6-BA3.5mg/L或者1/2MS+6-BA4.0mg/L。步骤(3)的生根培养基配方为：1/2MS+6-BA1.2～4.5mg/L+NAA0.02～1.0mg/L+IAA0.02～1.0mg/L+多效唑0.5～5.0mg/L的琼脂固体培养基；优选1/2MS+6-BA2.5mg/L+NAA0.6mg/L+IAA0.5mg/L+多效唑3.0mg/L或者1/2MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.6mg/L+IAA0.4mg/L+多效唑4.0mg/L。步骤(4)移栽管理是将鉴定为四倍体的植株，打开瓶盖炼苗3-5d，取出清洗根部培养基，随后将幼苗直接移栽至水田。在上述试验的多个处理中，诱导率最高组合为0.1mg/L安磺灵溶液在4℃冰箱中预处理60min，然后将其接种到包含0.03mg/L安磺灵的增殖培养基上共培养60d，致死率为55.6％,四倍体诱导率为41.2％，二倍体与四倍体嵌合体诱导率达到46.26％，仅少量诱变苗为二倍体植株。本发明具有如下的优点和效果：1、本发明选择无菌苗为外植体，稳定性好、操作简便，取材容易，不需经过体外消毒，恢复期短，抵抗诱变剂的毒害作用强；2、常规浸泡诱变处理，对外植体的毒害作用强，致死率高达95％以上，甚至达到100％，而且诱变率为0；本发明采用短时间浸泡处理，再结合低浓度诱变剂共培养，能在短时间内获得大量成活试管苗，致死率最低在10％以下；最佳处理组合在半致死条件下获得的试管苗，表型变异明显；经核型分析发现，四倍体诱导率达到41.2％，二倍体和四倍体嵌合体诱导率达到46.26％，将近90％的试管苗发生变异；本发明大大提高了诱变效率，而且节省了大量诱变探索时间；3、本发明选择安磺灵为诱变剂，价格比秋水仙素低800-900元/g，大大降低了诱变成本；选择4℃低温处理，大大降低诱变剂对外植体的毒害作用，能获得较多诱变成活的试管苗；4、本发明选择二倍体植株为对照；两者移栽条件一致，种苗为多倍体的植株相比于对照茎色浓绿，鲜草直径相对较粗、草茎较长，顶草长，分蘖数多，根粗而长，尤其是草茎长平均达到138.67cm，超过了优质产品的标准。5、本发明根据生产需要设计培养方法，首先将无菌苗诱导大量分蘖芽，抑制根的形成，提高增殖倍数，加快基础苗的繁殖，增殖倍数达到7-10；每瓶获得有效苗70株以上，大大提高了培养效率，节约了生产成本。6、批量化生产阶段同步诱导分蘖芽、不定根，增殖与生根简化为一步完成，即“一步成苗”方法，形成完整植株只需30d左右，节约了30d左右的生根时间。附图说明图1为对照例2安磺灵浸泡处理后的苗长势情况；图2为致死率低，表型变异不明显的苗长势情况；图3为最佳处理组合在半致死条件下，表型变异明显的苗长势情况；图4为对照株(左)与诱变株(右)试管苗生长情况；图5为席草二倍体(2×)染色体核型图(1000×)；图6为席草四倍体(4×)染色体核型图(1000×)；图7为二倍体(左)与四倍体(右)大田苗的生长情况。具体实施方式下面结合实施例进一步说明本发明，而非限制本发明。实施例1：1、多倍体的诱变与增殖生根：取席草(JuncuseffususL.)无菌苗，清洗根部的琼脂，放置无菌空瓶中，浸泡于诱变剂中，诱变剂成分包含0.1mg/L、0.5mg/L安磺灵混合溶液中，处理温度4℃、25℃，处理时间为30min、60min，设置3次重复；将无菌苗取出放置无菌滤纸上吸干水分，接种到包含诱变剂的增殖培养基上，诱变剂成分包含0.01mg/L、0.03mg/L、0.05mg/L安磺灵，25℃左右光照培养30d、60d，设置3次重复；2、多倍体鉴定：为了减少染色体数目检测的工作量，将表型变异明显的植株接种到生根培养基上培养。然后切取植株根尖包含有分生区部位的部分，进行染色体核型鉴定。染色体数目以染色体组为单位成倍增加的即为多倍体。3、将鉴定为四倍体的植株，打开瓶盖炼苗3-5d，取出清洗根部培养基，随后将幼苗直接移栽至水田。4、结果表明本发明实验方法诱变处理后的外植体培养20d左右，恢复生长，一般从分蘖芽基部逐渐长出新芽，但随处理浓度和时间的升高，致死率和诱变率随之升高；低浓度低温短时间预处理，结合低浓度短时间共培养处理的苗生长恢复期短，增殖率高，致死率在10％以下，但表型变异率低；对照例2安磺灵浸泡处理后的苗长势情况如图1所示，大部分都黄化死亡；致死率低，表型变异不明显的苗长势情况如图2所示，大部分能够保持生长；反之，苗生长恢复期长，尤其是25℃条件下浸泡处理，致死率大幅度升高；本发明多个处理中最佳组合为0.1mg/L安磺灵溶液在4℃冰箱中预处理60min，然后将其接种到包含0.03mg/L安磺灵的增殖培养基上共培养60d，恢复期较快，表型变异率达到80％以上，致死率为55.6％；最佳处理组合在半致死条件下，表型变异明显的苗长势情况如图3所示，几乎一半能够存活生长，而且表型变异明显；二倍体与变异植株试管苗的生长情况如图4所示，变异株明显长势强。表1安磺灵诱变效果(2)染色体数目以染色体组为单位成倍增加的即为多倍体。经染色体核型鉴定发现，该席草二倍体染色体数目为2n＝2x＝30,四倍体为4n＝4x＝60；本发明最优组合四倍体诱导率为41.2％，二倍体和四倍体嵌合体诱导率达到46.26％，仅少量试管苗为二倍体植株。席草对照株和诱变株染色体核型图如图5、图6所示。(3)本发明选择二倍体植株为对照；两者移栽条件一致，适时追肥一次；移栽7个月左右，种苗为多倍体的植株相比于对照茎色浓绿，鲜草直径相对较粗、草茎较长，顶草长，分蘖数多，根粗而长，尤其是草茎长平均值达到138.67cm，超出了优质产品的标准。席草四倍体与二倍体的主要形态特征比较如表2所示，二倍体与四倍体的植株长势如图7所示。表2席草四倍体与二倍体的主要形态特征比较实施例2：采用本发明经过优化的增殖培养基1/2MS+6-BA3.5mg/L和生根培养基1/2MS+6-BA2.5mg/L+NAA0.6mg/L+IAA0.5mg/L+多效唑3.0mg/L，发现30天增殖倍数达到7-10，每瓶获得有效苗70株以上，大大提高了培养效率，节约了生产成本。而且增殖与生根简化为一步完成，生根率达到95％以上，形成完整诱变植株的时间仅仅30天，大大提高了生产效率。对照例1：以0.1％秋水仙素+2％二甲基亚砜浸泡无菌苗72h，浸泡温度25℃，培养时间60d，但增殖培养时培养基中不添加诱导剂为对照，该对照处理方式是现有技术中诱变多倍体的常规条件。结果如下：诱导剂处理致死率诱导率对照处理100％0本发明最优处理方式55.6％41.2％对照例2：以0.1mg/L安磺灵浸泡无菌苗72h，浸泡温度4℃，培养时间60d，但增殖培养时培养基中不添加诱导剂为对照，该对照处理方式是现有技术中诱变多倍体的常规条件。结果如下：诱导剂处理致死率诱导率对照处理96.1％0本发明最优处理方式55.6％41.2％当前第1页1 2 3