本发明属于转基因发光植物
技术领域：
，尤其涉及一种自发光烟草及转基因方法。
背景技术：
：在生物进化的过程中，形成了自发荧光的藻类，真菌，细菌，昆虫等物种。但是，自然界中却鲜有自发荧光的植物。全世界关于发光烟草的研究涉及方方面面，大多发光烟草的专利都是以将某些发光化合物涂在植物表面，或者是对植物培养装置进行改造，在使植物在黑暗中发出亮光。基因工程的蓬勃发展，使得科学家对生物的发光机制有了分子层面的研究。科学家通过将发光基因导入植物细胞的染色体中，从而获得相应发光植株。在自然界，动物、微生物都有能发光的，唯独只有植物在进化过程中没有发光这一现象，故发光植物具有很大的观赏价值，同时，电影《阿凡达》中的荧光植物给人类极大的憧憬和向往，几年来，人类对荧光植物的好奇心从未减弱，荧光植物的问世也具有极大的商业价值。申请号为cn201310396243.7的中国专利申请公开了一种发光仙人球。该发光仙人球采用以下方法得到：荧光素酶基因群pcr扩增；荧光素酶基因群与pm-18t载体的构建；基因测序；融合基因转入大肠杆菌，测序；目的基因与表达载体的连接；特定启动子与表达载体的构建；融合基因转入农杆菌；将基因及荧光素的合成前提物一起转入植物；以及进行转代筛选稳定发光烟草体。采用农杆菌转化法将发光基因整合到植物染色体基因中，拷贝数较低，导致转化率很低，植物发光不明显，该方法应用到烟草中几乎得不到发光烟草。“autoluminescentplants(krichevsky,etal,2010,plosone)”一文中以nicotianatabacum(四倍体烟草)为受体材料，质粒载体由质体特有启动子prrn启动aada(筛选基因)和lux操纵子基因，来作为外源基因表达盒，同时选择rps12-trnv和trna-trni两种同源位点作为对照，获得的自发光烟草。技术实现要素：本发明针对现有技术的不足，提供一种自发光烟草及转基因方法。本发明能够定点整合，且拷贝数高，顺利得到高表达的自发光烟草；其自发光烟草在没有外力作用(外加底物或蓝紫光激发等)下，能够自发出裸眼可见的荧光。本发明第一方面，提供一种自发光烟草，其特征在于，所述自发光烟草通过发光基因与质粒载体构建发光基因-质体载体表达载体，发光基因-质体载体表达载体再通过质体转基因技术导入到烟草叶片中，烟草叶片通过组织培养得到。所述质粒载体为p-dk6质粒载体，碱基序列如seqidno.1所示。所述p-dk6质粒载体的组成部分：启动子，终止子，筛选抗性基因(aada)，多克隆位点，叶绿体基因组同源序列(orf131，16srrna)等。质粒载体中的筛选基因aada和外源基因lux分别由质体特异启动子ppsba和prrn启动，组成两套基因表达盒，在光量子的表达水平来看，采用两个启动子分别启动的效果较高。所述发光基因为lux基因，可通过人工合成获得，发光基因lux最早发现于海洋发光细菌中，海洋发光细菌是一类在正常的生理条件下能够发射可见荧光的细菌，这种可见荧光波长在450-490nm之间，在黑暗处肉眼可见。本发明第二方面，提供一种自发光烟草的转基因方法，所述转基因方法操作如下：通过基因合成得到发光基因lux序列，并进行pcr扩增；然后采用ncoi限制性内切酶和xbai限制性内切酶切p-dk6质粒载体，获得线性化p-dk6质粒载体，将发光基因lux连接到线性化p-dk6质粒载体上，获得发光基因-质体载体，采用基因枪将发光基因-质体载体轰击导入经高渗培养后的烟草叶片中；导入有发光基因-质体载体的烟草叶片经过恢复培养基培养后，然后在筛选培养基中进行筛选培养，得到阳性愈伤组织，阳性愈伤组织继续继代筛选培养获得同质化100％的愈伤组织，进而在生根培养基中诱导成苗得到自发光烟草；所述基因枪轰击烟草叶片的条件如下：基因枪氦气压至1050～1150psi，轰击距离为6cm或9cm。所述发光基因lux进行pcr扩增时的引物对如下：前引物primer-f：agggagggatccatgggaataccaaaggagattac；后引物primer-r：taatgtctactctagaaatatccctataaatagaac。所述高渗培养条件如下：高渗培养基配方为ms基础培养基+甘露醇0.05～0.3mol/l+山梨醇0.05～0.2mol/l+蔗糖25～35g/l+琼脂6.8～9g/l，ph5.6～6；高渗处理时间为3～5h，常温密封放置；所述恢复培养条件如下：恢复培养基配方为ms基础培养基+6-ba0.5～1.5mg·l-1+naa50～180ug·l-1+蔗糖25～35g·l-1+琼脂6.8～9g·l-1，ph5.6～6；恢复培养为暗培养，温度为22～26℃，培养时间为5～10天。导入有发光基因-质体载体的烟草叶片经过2～4轮筛选培养得到阳性愈伤组织；筛选条件如下：筛选培养基配方为ms基础培养基+6-ba0.5～1.5mg·l-1+naa50～180ug·l-1+蔗糖25～35g·l-1+琼脂6.8～9g·l-+壮观霉素500～2000mg/l，ph5.6～6；筛选培养温度为22～26℃，光照强度为1500～2500lux，每天光照时间为12～14小时，筛选培养时间为70～85天；或者筛选培养温度为22～26℃，光照强度为8000～11000lux，每天光照时间为14～16小时，筛选培养时间为35～45天。获得的阳性愈伤组织继续切成小片，放置于继代筛选培养基中筛选1～3轮得到同质化100％的阳性愈伤组织；继代筛选条件如下：继代筛选培养基配方为ms基础培养基+6-ba0.5～1.5mg·l-1+naa50～180ug·l-1+蔗糖25～35g·l-1+琼脂6.8～9g·l+壮观霉素500～2000mg/l，ph5.6～6.2；继代筛选培养温度为25～28℃，光照强度为8000～12000lux，每天光照时间为12～18小时，继代筛选时间为30～60天。同质化100％的愈伤组织在暗室里能裸眼观察到荧光，将愈伤组织切成小片放置于生根培养基中获得能自发光的烟草，生根培养基成份如下：生根培养基配方为ms0培养基+蔗糖25～35g/l+壮观霉素500～2000mg/l+植物凝胶2～4g/l，ph5.6～6.2。本发明采用的ms基础培养基配方为：硝酸铵30～35g·l-1，硝酸钾36～40g·l-1，磷酸二氢钾3～3.8g·l-1，硫酸镁7～7.5g·l-1，氯化钙8～9g·l-1，碘化钾0.1～0.2g·l-1，硼酸1.1～1.4g·l-1，四水硫酸锰4～5g·l-1，七水硫酸锌1.5～1.9g·l-1，二水钼酸钠0.02～0.1g·l-1，五水硫酸铜4～6mg·l-1，六水氯化钴4.5～5.5mg·l-1，七水硫酸亚铁5～6g·l-1，乙二胺四乙酸二钠7～8g·l-1，甘氨酸19.5～21.3mg·l-1，肌醇95～105mg·l-1，盐酸硫胺素18～22mg·l-1，盐酸吡哆素99～104mg·l-1，烟酸197～102mg·l-1。考虑到采用农杆菌转化法将发光基因整合到植物核基因中，拷贝数低，转化率较低，本发明将发光基因运用质体转基因技术导入植物细胞的叶绿体基因组中，外源基因整合在叶绿体orf131基因与16srrna基因之间，叶绿体基因组主要由lsc，ssc，ira，irb四部分组成，ira，irb两部分核酸序列完全一致，方向相反，orf131基因与16srna基因位于ira，irb上，理论上而言，外源在这两个位点进行同源重组整合的时候，一个叶绿体基因组就可以整合上两个外源基因；同时，一个叶肉细胞含有几十个叶绿体，一个叶绿体里面有几十个叶绿体基因组的拷贝，所以一个叶肉细胞有接近10000个叶绿体基因组的拷贝，相比一个二倍体的叶肉细胞只有2套核基因组的拷贝，获得的质体转基因植株能比核转基因高上千倍的表达量，故本发明能够定点整合，且拷贝数高。通过优化培养条件(如筛选培养基成分、筛选光照和温度等)能够获得同质化程度100％的阳性苗，克服了现有叶绿体转化中同质化程度低的缺陷，顺利得到高表达的自发光烟草。另外，本发明采用的p-dk6质粒载体中的筛选基因aada和外源基因lux分别由质体特异启动子ppsba和prrn启动，组成两套基因表达盒，在光量子的表达水平来看，采用两个启动子分别启动的效果较高。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明采用质体转基因技术得到自发光烟草，该方法依赖于外源基因与叶绿体基因的同源重组，具有定点整合外源基因并使之稳定遗传，环境安全性好，基因产物区域化，表达量极高等优点而受到科学家的青睐。与我国现有的发光植物相比，对比转入荧光蛋白的植物，不需要蓝紫光激发和佩戴有色眼镜，安全且便于观察；对比转入荧光素酶的植物，不需要添加外用底物荧光素，安全且植物生长良好，发光强度保持恒定，不会随时间而减弱。本发明获得的自发光烟草在黑暗条件下便可明显观察到烟草自发荧光，是荧光植物的新一代优秀产品，市场潜力巨大。附图说明图1为lux基因phanta聚合酶pcr结果图；图2为p-dk6骨架载体图谱；图3为p-dk6载体图谱；图4为载体p-dk6酶切后胶图；图5为模拟成功重组后的基因组序列；图6为left-f/r跑胶得到的目的条带，其中1、1-1、2、13条带大小接近1600bp；图7为right-f/r跑胶得到的目的条带，大小在2300bp，大小符合；图8为提取的本氏烟草样品愈伤组织全基因组dna胶图；图9为lux-bs(本氏)内参基因和目的基因的扩增曲线；图10为lux-bs(本氏)内参基因的标准曲线；图11为lux-bs(本氏)目的基因的标准曲线；图12为lux-bs(本氏)内参基因和目的基因的溶解曲线；图13为本氏阳性烟草荧光拍摄效果图；图14为贵烟受体获得阳性愈伤的pcr胶图结果图；图15为lux-g(贵烟)目的基因与内参基因的扩增曲线；图16为lux-g(贵烟)目的基因与内参基因的溶解曲线。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。实施例1以本氏烟(nicotianabenthamiana，二倍体)为受体，其叶绿体中转入lux基因开发自发光烟草步骤(1)在ncbi上查找获取lux基因序列，在上海捷瑞生物工程有限公司合成lux基因在载体p-gh-lux(上海捷瑞公司合成基因使用的骨架载体是p-gh，p-gh的碱基序列在ncbi中可查到)中，设计in-fusion连接引物，通过pcr扩增，获得目的条带，pcr引物如下：primer-f：agggagggatccatgggaataccaaaggagattac；primer-r：taatgtctactctagaaatatccctataaatagaac；发光基因lux进行pcr扩增时，pcr反应体系(25ul)如表1所示。表1pcr反应条件如表2所示。表2pcr反应结果后进行凝胶电泳，利用1.2％胶回收得到目的片段，如图1所示。图1中m是1kbmaker，1～11表示不同的退火温度(50～68℃，梯度为2℃)得到的胶带，12为阳性对照，13是空白对照。步骤(2)利用nco1，xbal酶切烟草叶绿体基因组同源重组载体p-dk6，获得线性化p-dk6质粒载体，p-dk6质粒载体的骨架载体以及载体图谱分别如图2、图3所示。图2中16srrna—trnv和orf13表示同源位点、prrn和ppsba表示叶绿体特异启动子、trbcl和tpsba表示叶绿体特异终止子、b-bar1表示骨架载体原有的外源基因(抗除草剂的)、aada表示筛选基因(壮观素酶、抗壮观霉素)。nco1，xbal酶切反应体系如表3所示。表3将酶切反应体系置于37℃水浴锅中放置3h，酶切反应后进行凝胶电泳，(1.2％)胶回收得到酶切后线性化p-dk6质粒载体，酶切图谱如图4所示，图4中从左至右m为1kb和dl2000maker，1～4为双限制性酶切片段，5为p-dk6载体作为阴性对照。步骤(3)利用infusion试剂盒，将p-dk6线性载体和pcr后的lux目的基因片段进行连接，获得p-lux质粒；infusion反应体系(10ul)如表4所示。表4infusion反应体系置于pcr仪器，反应温度为50℃，反应时间为30min。连接产物转化大肠杆菌(氨苄抗性)，挑取单克隆，摇菌，利用试剂盒提取质粒，质粒送测序公司测序，获得p-lux质粒。步骤(4)利用“基因枪轰击”的方式(基因枪型号为pds-1000)，轰击高渗处理的植物烟草叶片，将p-lux质粒导入烟草。基因枪轰击烟草叶片，具体操作如下：(a)叶片预处理以及基因枪配件的灭菌准备：在超净工作台中，从无菌培养瓶取出长势良好且无卷曲的本氏烟草叶片若干，切成20cm*20cm大小的叶片，近轴面朝上平铺于高渗培养基中，放置4h；同时，对50％甘油、2.5mcacl2、滤纸、1.5ml硅化离心管、载体膜(macrocarries)、终止屏(stoppingscreens)、破裂盘固定帽和载体膜支架进行120℃20min的高压蒸汽灭菌处理，对基因枪所处的超净工作台用70％的酒精擦拭消毒灭菌，同时对基因枪pds-1000的腔体也进行70％的酒精擦拭灭菌；高渗培养基配方：ms基础培养基+0.1mol·l-1甘露醇+0.1mol·l-1山梨醇+蔗糖30g·l-1+琼脂8g·l-1，ph5.8，120℃高压灭菌20min。ms基础培养基配方为：硝酸铵33g·l-1，硝酸钾38g·l-1，磷酸二氢钾3.4g·l-1，硫酸镁7.4g·l-1，氯化钙8.8g·l-1，碘化钾0.166g·l-1，硼酸1.24g·l-1，四水硫酸锰4.46g·l-1，七水硫酸锌1.72g·l-1，二水钼酸钠0.05g·l-1，五水硫酸铜5mg·l-1，六水氯化钴5mg·l-1，七水硫酸亚铁5.56g·l-1，乙二胺四乙酸二钠7.46g·l-1，甘氨酸20mg·l-1，肌醇100mg·l-1，盐酸硫胺素20mg·l-1，盐酸吡哆素100mg·l-1，烟酸100mg·l-1；(b)微载体的配置：以60次轰击实验为例，称取0.6μm的金粉30mg，将其放入1.5ml的硅化离心管中，向离心管内加入1ml70％乙醇，涡旋混合器上充分震荡3～5分钟，震荡结束后静置15分钟，1500r/min离心约5秒钟，弃上清，在得到的微载体沉淀中加入1ml蒸馏水充分震荡1分钟，震荡结束后静置1分钟，将上述含有微载体的水溶液大致离心后弃上清，再重复蒸馏水洗2次，在得到的微载体沉淀中加入500μl经灭菌的50％甘油，向硅化离心管中加入浓度为1μg/μl的质粒50μl，再加入250μl2.5mcacl2以及20μl0.1m亚精胺，持续震荡2～3分钟，静置1分钟后离心约2sec，弃上清，在得到的沉淀中加入700μl70％乙醇(hplc级或分光光度计级)，离心弃上清，加入700μl100％乙醇，离心弃上清，在得到的沉淀中加入480μl100％乙醇，轻轻地拍打离心管管壁数次后，在低速的混合器上充分震荡2～3分钟，即得到微载体；(c)基因枪法轰击叶片：用灭过菌的镊子夹取1100psi的破裂盘在70％的异丙醇中浸润消毒，放置于破裂盘固定帽中，将微载体混匀吸取8μl均匀的涂于载体膜的半径为0.5cm的中心圆内，取经高渗处理4h后的无菌烟草叶片放置于过渡培养基皿正中，关闭基因枪气门，打开基因枪电源，调节氦气瓶气压阀门至1300psi左右，抽真空至-25inhg，hold键保持，按fire键，待基因枪氦气压至1100psi左右，会听到“嘣”的一声，轰击结束，打开基因枪阀门，待真空压指针回归0，再打开气门，取出材料，封口，放于25℃暗培养箱恢复培养一周，恢复培养为暗培养，温度为22～26℃；恢复培养基配方为ms基础培养基+6-ba(6-苄氨基嘌呤)1mg·l-1+naa(萘乙酸)100ug·l-1+蔗糖30g·l-1+琼脂8g·l-1，ph5.8，120℃高压灭菌20min；步骤(5)恢复培养后的叶片在含有500mg/l的aada(壮观霉素)的筛选培养基上进行筛选：整个烟草叶片分别切成5mm*5mm叶片左右，按照3-4-4-3(每行排列分别摆放3、4、4、3个小叶片)阵列放入筛选培养皿中；筛选培养基配方如下：ms基础培养基+6-ba1mg·l-1+naa100ug·l-1+蔗糖30g·l-1+琼脂8g·l-1+壮观霉素500mg/l，ph5.8，120℃高压灭菌20min。筛选培养条件分两种，具体如下：第一种筛选温度为25℃，光照强度为2000lux，光照时间为12小时/天,筛选培养过程中每隔25d换筛选培养基，保持选择压(aada浓度为500mg/l),上筛选培养70天后，陆续开始有嫩芽长出；第二种筛选温度为26℃，光照强度为10000lux，光照时间为18小时/天，每隔20d换筛选培养基，上筛选培养35天后，陆续有绿色芽点长出。步骤(6)在筛选培养基上获得的芽点继续在筛选培养基上筛选，芽点会逐渐长大为较大的愈伤组织，对愈伤组织进行基因型鉴定，确定愈伤组织中含有整合的目的片段，经测序结果比对，目的片段成功定点整合到叶绿体基因组上的目标位置，愈伤组织为阳性。基因型鉴定过程：(a)从叶片中提取全基因组dna：按照新型植物基因组dna提取试剂盒(tiangen天根型号：dp320-03)说明书，进行实验即可。(b)pcr验证：配置25ul反应体系，使用高浓度胶(2％-3％)，50bpmarker(dl2000也可以使用)检测产物。需保证条带大小正确，无二聚体，送测序进一步验证。若发光基因-质体载体p-lux成功重组到本氏烟草的叶绿体基因组中，则在阳性愈伤组织的叶绿体基因组中的基因序列如图5所示。然后设计左右同源序列引物，进行pcr扩增。right-f/r目标条带大小为2300bp，left-f/r目标条带大小为1600bp。right-f:ctggcgatgagcgaaatgta；right-r:catggggacgtaaaaaaggg；left-f:gaattcattggatcctttccg；left-r:ctgtagcccatttaattgcat；发光基因-质体载体p-lux的pcr反应体系(25ul)如表5所示。表5pcr反应条件如表6所示表6pcr扩增结束后进行凝胶电泳，采用1.2％胶分别目的条带，如图6所示。图6中1k、2k、750bp表示maker条带对应的大小，从左至右4～18分别表示筛选得到的样品编号,19为阴性对照(野生苗)，检测是否为阳性。图7中1k、2k、3k表示maker条带对应的大小，1～13是根据left-f/r引物检测为阳性的样品，也是样品编号。回收目的条带，测序后与正确序列进行比对，证明序列完全正确，目的基因已经成功定点整合在烟草叶绿体基因组上，获得了阳性愈伤组织，序列比对结果如下：步骤(7)基因型鉴定为阳性的愈伤组织，在继代筛选培养基上继续培养，提高目的基因在叶绿体中的同质化程度到达100％，利用rt-pcr进行检测同质化程度。继代筛选培养基配方：ms基础培养基+6-ba1mg·l-1+naa100ug·l-1+蔗糖30g·l-1+琼脂8g·l-1+壮观霉素1000mg/l，ph5.8，120℃高压灭菌20min；继代筛选条件如下：继代筛选培养温度为26℃，光照强度为10000lux，每天光照时间为18小时，继代筛选时间为30～60天；利用荧光定量pcr实验检测同质化程度方法如下：a：获得实验室成功导入lux基因到烟草叶绿体基因组中的阳性愈伤组织，，提取阳性愈伤组织全基因组dna：获得的全基因组dna需要包含尽可能多的叶绿体基因组dna，来保证检测的叶绿体转化的同质化程度与实际同质化程度误差较小，在实际操作过程中，因样品量较少，不能在研钵中碾磨(损失极大)，又因愈伤组织水份含量较高，样品进行液氮冷却后，在打样机上无法打碎，故在超净工作台进可能的将愈伤组织切割成小块放入灭菌的1.5ml离心管，然后使用研磨棒在离心管里将样品磨碎，磨碎后的样品按照高效植物基因组dna提取试剂盒(dp350，天根，tiangen)的方法提取全基因组，最大限度的保护dna的完整性，提取的基因组dna片段大，纯度高，提取的全基因组在0.8％～1.2％的凝胶电泳上获得的条带需为单一条带，拖带较少，且大小在10k以上，则获得的全基因组dna可作为模板dna，并测dna浓度；若获得的条带有拖带现象，则不建议作为模板dna，如下图8所示为提取的本氏烟草样品愈伤组织全基因组dna，图8中m为1kbmaker,m1为dl2000maker,样品1,3,4,6,7,10,13,17,20,21主条带较清晰，拖带较少，适合作为模板dna；样品2,8,15,16,19,22主条带不够明亮清晰，不适合作为模板dna；样品5,9,11,12,14,18虽主条带明亮清晰，但拖带较多，不建议作为模板dna。b：选取目的基因位于骨架载体筛选基因aada基因上；选取内参基因在烟草叶绿体基因组上，不在同源序列orf131基因和16srrna基因上。采用oligo7软件设计目的基因和内参基因的引物，送测序公司合成，进行预实验来验证引物的特异性；pcr预实验验证：目的条带和内参条带近进行扩增时，pcr反应体系(25μl)如表7所示。表7pcr反应条件如表8所示。表8pcr反应结束后进行凝胶电泳，使用2.5％高浓度胶回收得到目的片段，需保证条带大小正确，无二聚体，则可送测序进一步验证，发现两对引物的特异性较好。目的基因选自载体上的aada基因的部分片段，内参基因选自叶绿体基因组dna上的ycf2基因的部分片段，aada基因以及ycf2基因的碱基序列均可在ncbi中可查到。目的基因引物1：rt-aada-f1：ccttttggaaacttcggctt；rt-aada-r1：aagatagccagatcaatgtcg；对应目的基因1的目的条带序列1(位于aada基因上)：ccttttggaaacttcggcttcccctggagagagcgagattctccgcgctgtagaagtcaccattgttgtgcacgacgacatcattccgtggcgttatccagctaagcgcgaactgcaatttggagaatggcagcgcaatgacattcttgcaggtatcttcgagccagccacgatcgacattgatctggctatctt；内参基因引物1：nc-f1：gtcatttgatccaatagcgttc；nc-r1：ctggtttatcaagaatacgcaag；内参基因引物1对应的目的条带序列1(位于ycf2基因上)：gtcatttgatccaatagcgttccgttagataggaacagatttgataaatactgataactctcggatagagtattagaacggaaagatccattagataatgaactgttggttctaagccatctctgacgattaatcaacaattcgaagtgcttttcttgcgtattcttgataaaccag；c：验证单对引物扩增效率和溶解曲线，保证内参与目的基因扩增效率相同：步骤(1)获得的全基因组dna按照1：10、1：100、1：1000、1：10000连续稀释作为模板dna，每个稀释比做4个重复，同时做定量pcr对内参和目的基因定量，定量pcr体系(20μl)如表9所示：表920μl体系加载完毕，离心冰浴，使用一套移液枪，每加一个样换枪头，将样品加载到96孔板，使用quantstudio12kflex荧光定量pcr仪(abi，美国应用生物系统公司)获得扩增曲线和溶解曲线数据。若内参扩增标准曲线和目的基因扩增标准曲线的扩增效率在98％～102％之间，且两者斜率差在0.001～0.02之间，表明内参选取合适，若溶解曲线对单峰，表明数据可靠性强。图9为lux-bs(本氏)内参基因和目的基因的扩增曲线，图10为lux-bs(本氏)内参基因的标准曲线，图11为lux-bs(本氏)目的基因的标准曲线，两者的标准曲线斜率差为0.003，符合误差范围，内参选取合适，图12为lux-bs(本氏)内参基因和目的基因的溶解曲线，都为单峰，表明数据可靠性强。d：荧光定量pcr实验：将步骤(1)提取好的全基因组dna按照1:10、1:100、1:1000、1:10000连续稀释作为模板dna，每个稀释比做4个重复，pcr体系如表3所示，反应条件在上机操作中设置，使用仪器为quantstudio12kflex荧光定量pcr仪(abi，美国应用生物系统公司)，上机操作步骤如下：(1)向96孔板加样，使用一套移液枪，每加一个样换枪头，保证加样的准确性；(2)每个样品重复4次，记录好每个孔对应的样品；(3)使用封口膜封口，尽量不要触碰96孔板中间的位置；(4)程序设置，“platesetup”主要用于设定板上需要荧光检测的样品位置，“edit”进入设定界面，点选对应有样品的孔，在“protocolsetup”中设置pcr反应程序，设置如下：step1:95℃30s1cyclestep2:95℃15s58℃30s72℃30s40cyclesstep3:融解曲线设置使用默认设置即可熔点曲线的反应程序设置参考：(一般只有一个步骤，随着循环的进行，其退火温度在不断的升高和降低)(1)在要设置为熔点曲线的地方插入一个循环。(2)在反应程序文件列表中收集熔点曲线数据步骤输入起始温度(退火温度58℃)。(3)输入该步骤的保持时间，输入时，如要输入10秒，可以输入“0:10”或“0.10”。实验结束后，使用格式化的u盘拷取数据，进行分析。计算：根据数据计算出样品的同质化百分比，内参基因的标准曲线与目的基因的标准曲线斜率分别为1和0.997，且内参基因与目的基因的溶解曲线都为单峰，适合计算方法为△ct法:表达水平＝2-△ct，如下表10为lux阳性愈伤的百分比，表10中样品75和78同质化百分比超过100％，但在误差允许范围内，认为同质化程度达到了100％。表10lux基因在烟草叶绿体基因组中同质化程度结果步骤(8)同质化100％的阳性愈伤组织置于生根培养基上培养，获得目的基因同质化程度100％的阳性烟草植株；所述生根培养基的成分如下：生根培养基配方为ms0培养基+蔗糖30g/l+壮观霉素1000mg/l+植物凝胶3g/l，ph5.8，120℃高压灭菌20min。ms0基础培养基配方为：硝酸铵33g·l-1，硝酸钾38g·l-1，磷酸二氢钾3.4g·l-1，硫酸镁7.4g·l-1，氯化钙8.8g·l-1，碘化钾0.166g·l-1，硼酸1.24g·l-1，四水硫酸锰4.46g·l-1，七水硫酸锌1.72g·l-1，二水钼酸钠0.05g·l-1，五水硫酸铜5mg·l-1，六水氯化钴5mg·l-1，七水硫酸亚铁5.56g·l-1，乙二胺四乙酸二钠7.46g·l-1；自发光烟草生根条件如下：无菌透气，培养温度为26℃，光照强度为10000lux，每天光照时间为18小时，生根时间为25～30天。步骤(9)自发光烟草在仪器ab-2270luminescencerocta(单管发光检测仪)中20min，光量子强度为2.2x107photos/min，在暗室里，待裸眼适应黑暗条件3～5min后，会逐渐看到烟草发出较微弱的荧光，图13为荧光拍摄效果，使用仪器为全自动化学发光检测系统(天能型号：5200)，曝光时间为5min，图13中左边上下两图分别表示阳性愈伤组织在自然光和黑暗中的照片，右边上下两幅图为野生型植株叶片在自然光和黑暗条件下的照片。实施例2以贵烟(四倍体)为受体，气叶绿体基因组中转入lux基因开发自发光烟草步骤(1)lux基因的来源、扩增体系同实施例1。步骤(2)p-lux载体的构建方法同实施例1。步骤(3)用“基因枪轰击”方式将p-lux载体导入烟草：高渗培养基及叶片高渗处理方式同实施例1，基因枪配件的灭菌处理及微载体的配制也同实施例1，基因枪法轰击叶片与实施例1唯一的区别在于实施例2的轰击距离只为6cm，恢复培养基配方和恢复培养方式同实施例1。步骤(4)恢复培养后的叶片在含有500mg/l的aada(壮观霉素)的筛选培养基上进行筛选：整个烟草叶片分别切成5mm*5mm叶片左右，按照3-4-4-3(每行排列分别摆放3、4、4、3个小叶片)阵列放入筛选培养皿中；筛选培养基配方同实施例1。筛选培养条件具体如下：在光照培养箱(上海一恒，型号：mgc-350bf-2)中培养，筛选温度为26℃，光照强度为8000lux，光照时间为22小时/天，每隔15天换筛选培养基，上筛选25天后，陆续有绿色芽点长出。步骤(5)在筛选培养基上获得的芽点继续在筛选培养基上筛选，芽点会逐渐长大为较大的愈伤组织，对愈伤组织进行基因型鉴定，确定愈伤组织中含有整合的目的片段，经测序结果比对，目的片段成功定点整合到叶绿体基因组上的目标位置，愈伤组织为阳性。基因型鉴定过程：提取全基因组dna的方法同实施例1，pcr反应体系和条件以及凝胶浓度同实施例1，与实施例1不同的是引物，因lux基因较大(6.7kb)，无法完整p出，选取lux基因中间一段设计引物为lux-jc-f3/r3，引物序列如下所示，图14为贵烟受体获得阳性愈伤的pcr胶图结果，图14中m为dl2000maker，16为阴性对照，17为阳性对照，样品6和14为阳性，片段回收测序，经比对完全正确，目的基因已经成功定点整合到贵烟叶绿体基因组上，获得了阳性愈伤组织。lux-jc-f3:agtcagtaaataattgccat；lux-jc-r3:agtaattgaactaagctcat；步骤(7)基因型鉴定为阳性的愈伤组织，在继代筛选培养基上继续培养，提高目的基因在叶绿体中的同质化程度到达100％，利用rt-pcr进行检测同质化程度。继代筛选培养基配方：ms基础培养基+6-ba1mg·l-1+naa100ug·l-1+蔗糖30g·l-1+琼脂8g·l-1+壮观霉素1500mg/l，ph5.8，120℃高压灭菌20min；继代筛选条件如下：继代筛选培养温度为26℃，在光照强度为9000lux，每天光照时间为20小时/天，每隔15天换筛选培养基，继代筛选时间为25～50天；利用荧光定量pcr实验检测同质化程度，实验过程同实施例1，内参基因引物和目的基因引物同实施例1，根据实验获得的lux-g(贵烟)目的基因与内参基因的扩增曲线如图15所示，两者之间标准曲线的斜率差为0.006，说明内参选取合适，图16为lux-g(贵烟)目的基因与内参基因的溶解曲线，都为单峰，说明数据可靠性强，适合使用△ct法计算，计算结果如表11所示，表11中4个样品不属于同一批样品，样品17和20同质化程度超过100％，属于误差范围内，理论上认为同质化程度达到100％。样品16不是采用本发明提供的筛选方法得到的样品，同质化程度较低。表11编号lux-g-1lux-g-2lux-g-3lux-g-4样品样品16样品17样品20样品21内参基因ct值7.017.8917.1659.204目的基因ct值9.1637.6916.9089.446△ct2.153-0.2-0.2570.2422^-△ct(同质化程度)22.48％115％119.5％84.55％步骤(8)同质化100％的阳性愈伤组织置于生根培养基上培养，获得目的基因同质化程度100％的阳性烟草植株；所述生根培养基的成分如下：生根培养基配方为ms0培养基+蔗糖30g/l+壮观霉素500mg/l+琼脂8g/l，ph5.8，120℃高压灭菌20min。自发光烟草生根条件如下：无菌透气，培养温度为26℃，光照强度为9000lux，每天光照时间为16小时，生根时间为15～20天。步骤(9)自发光烟草在仪器ab-2270luminescencerocta(单管发光检测仪)中20min，光量子强度为4.2x107photos/min，在暗室里，待裸眼适应黑暗条件5min后，会逐渐看到烟草发出微弱的荧光。sequencelisting<110>云南纳博生物科技有限公司<120>一种自发光烟草及转基因方法<130>2017.1.12<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>8308<212>dna<213>人工合成<400>1cttaacgctatggaactcgccgcccgactgggctggcgatgagcgaaatgtagtgcttac60gttgtcccgcatttggtacagcgcagtaaccggcaaaatcgcgccgaaggatgtcgctgc120cgactgggcaatggagcgcctgccggcccagtatcagcccgtcatacttgaagctagaca180ggcttatcttggacaagaagaagatcgcttggcctcgcgcgcagatcagttggaagaatt240tgtccactacgtgaaaggcgagatcaccaaggtagtcggcaaataatgtctagctagagc300gatcctggcctagtctataggaggttttgaaaagaaaggagcaataatcattttcttgtt360ctatcaagagggtgctattgctcctttctttttttctttttatttatttactagtatttt420acttacatagacttttttgtttacattatagaaaaagaaggagaggttattttcttgcat480ttattcatgggggatcactttgacaattgaatccgattttgaccattattttcatatccg540taatagtgcgaaaagaaggcccggctccaagttgttcaagaatagtggcgttgagtttct600cgaccctttgacttaggattagtcagttctatttctcgatggggcggggaagggatataa660ctcagcggtagagtgtcaccttgacgtggtggaagtcatcagttcgagcctgattatccc720taagcccaatgtgagtttttctagttggatttcgaggcctcgaaagctcccccgccgtcg780ttcaatgagaatggataagaggctcgtgggattgacgtgagggggcagggatggctatat840ttctgggagcgaactccgggcgaatatgaagcgcatggatacaagttatgccttggaatg900aaagacaattccgaatccgctttgtctacgaacaaggaagctataagtaatgcaactatg960aatctcatggagagttcgatcctggctcaggatgaacgctggcggcatgcttaacacatg1020caagtcggacgggaagtggtgtttccagtggcggacgggtgagtaacgcgtaagaacctg1080cccttgggaggggaacaacagctggaaacggctgctaataccccgtaggctgaggagcaa1140aaggaggaatccgcccgaggaggggctcgcgtctgattagctagttggtgaggcaatagc1200ttaccaaggcgatgatcagtagctggtccgagaggatgatcagccacactgggactgaga1260cacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaattttccgcaatgggcgaaagcct1320gacggagcaatgccgcgtggaggtagaaggcccacgggtcgtgaacttcttttcccggag1380aagaagcaatgacggtatctggggaataagcatcggctaactctgtgccagcagccgcgg1440taatacagaggatgcaagcgttatccggaatgattgggcgtaaagcgtctgtaggtggct1500ttttaagtccgccgtcaaatcccagggctcaaccctggacaggcggtggaaactaccaag1560ctggagtacggtaggggcagagggaatttccggtggagcggtgaaatgcgtagagatcgg1620aaagaacaccaacggcgaaagcactctgctgggccgacactgacactgagagacgaaagc1680taggggagcgaatgggattagataccccagtagtcctagccgtaaacgatggatactagg1740cgctgtgcgtatcgacccgtgcagtgctgtagctaacgcgttaagtatcccgcctgggga1800gtacgttcgcaagaatgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagca1860tgtggtttaattcgatgcaaagcgaagaaccttaccagggcttgacatgccgcgaatcct1920cttgaaagagaggggtgccttcgggaacgcggacacaggtggtgcatggctgtcgtcagc1980tcgtgccgtaaggtgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgtgtttagttgcc2040atcgttgagtttggaaccctgaacagactgccggtgataagccggaggaaggtgaggatg2100ccgtcaagtcatcatgccccttatgccctgggcgacacacgtgctacaatggccgggaca2160aagggtcgcgatcccgcgagggtgagctaaccccaaaaacccgtcctcagttcggattgc2220aggctgcaactcgcctgcatgaagccggaatcgctagtaatcgccggtcagccatacggc2280ggtgaattaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgtta2340cccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagagg2400cccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgc2460ggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatacgtcaaagcaaccata2520gtacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgac2580cgctacacttgccagcgccttagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgc2640cacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatt2700tagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgg2760gccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatag2820tggactcttgttccaaactggaacaacactcaactctatctcgggctattcttttgattt2880ataagggattttgccgatttcggtctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatt2940taacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaattttatggtgcactctcagtacaat3000ctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgcc3060ctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggag3120ctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgt3180gatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtgg3240cacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaa3300tatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaa3360gagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgcct3420tcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttggg3480tgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcg3540ccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtatt3600atcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatga3660cttggttgaatactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagaga3720attatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaac3780gatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcg3840ccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccac3900gatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactct3960agcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttct4020gcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgg4080gtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttat4140ctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagatagg4200tgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagat4260tgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatct4320catgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaa4380gatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaa4440aaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttcc4500gaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgta4560gttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcct4620gttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacg4680atagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccag4740cttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgc4800cacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacagg4860agagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtt4920tcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatg4980gaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctca5040catgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtg5100agctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagc5160ggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcag5220ctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgag5280ttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtg5340tggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaa5400gctctagctagaggatctttcttgatcaatccctttgcccctcattcttcaagaataagg5460aagatccttttcaagtttgaatttgttcatttggaatctgggttcttctacttcatattt5520atttaatatgaatattttccctctcttttttttatatcattccttaagtcccataggttt5580gatcctgtagaatttgacccattttctcattgaacgaaaggtacgaaataaatcagattg5640ataaaagtaccatgtgaaatcttcggtttttccccttcctcgatccctatcccataggtt5700aggtacagtgtttgaatcaatagagaaccttttcttctgtatgaatcgatattattccat5760tccaaatccttcccgatacctcccaaggaaaatctcgaatttggatcccaaattgacggg5820ttagtgtgagcttatccatgcggttatgcactctttgaataggaatccgttttctgaaag5880atcctggctttcgtactttggtgggtctccgagatcctttcgatgacctatgttgaaggg5940atatctatctaatccgatcgattgcgtaaagcccgcggtagcaacggaaccggggaaagt6000atacagaaaagacagttcttttctattatattagtattttctattatattagatatatta6060gactattatattagattagtattagttagtgatcccgacttagtgagtctgatgaattgt6120tggcaccagtcctacattttgtctctgtggaccgaggagaaaaggggctcggcgggaaga6180ggagtgtaccatgagagaagcaaggaggtcaacctctttcaaatatacaacataaattct62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