本发明涉及一种昆虫病原线虫的繁殖方法。
背景技术：
昆虫病原线虫作为一种重要的生防因子，可通过寄生昆虫幼虫，有效地控制农田地下害虫和钻驻性害虫。根据昆虫病原线虫繁殖载体的不同，将昆虫病原线虫繁殖方法分为活体繁殖法和离体繁殖法。离体繁殖法就是利用人工培养基，通过昆虫病原线虫随身携带的共生细菌进行昆虫病原线虫繁殖，目前国内外均是采用该技术繁殖昆虫病原线虫，进行大量生产。但该技术对生产条件要求比较严格，且多采用液体发酵技术生产，导致生产成本高、技术难掌握。本发明是利用昆虫病原线虫寄主进行活体繁殖的工厂化生产，该技术简化了生产过程，降低了生产成本和难度。
昆虫病原线虫是昆虫的专化性寄生天敌，可寄生鞘翅目﹑双翅目﹑同翅目﹑膜翅目、等翅目﹑鳞翅目﹑脉翅目﹑蜻蜓目和直翅目等近250多种昆虫。该类线虫可从昆虫的肛门、气孔、节间膜或随寄主食物进入昆虫体内，释放携带的共生细菌，使寄主昆虫患败血病死亡。因此，人们利用该线虫的特点进行害虫生物防治，该线虫对人畜安全，不污染环境。它具有寄主广泛、主动寻找寄主、高效、快速、安全、易规模化生产等优点，尤其对于一些化学药剂难以防治的钻蛀性害虫和土壤害虫，有很好的防治效果。随着化学杀虫剂污染越来越严重、人们对害虫无公害控制技术的渴望和害虫抗药性的增强，害虫生物控制也逐步引起人们的重视，昆虫病原线虫作为一种很有潜能的生防因子，近年在国内外生物防治领域发展迅速。
昆虫病原线虫能否作为一种生防制剂在工业上大面积应用，关键在于解决线虫的高效生产技术问题。目前国际上活体繁殖技术主要是采用大蜡螟(galleriamellonella)进行繁殖，但现今该技术仅局限于实验室试验繁殖，产量极低，也有利用黄粉虫生产线虫，但该技术要借助固体载体进行繁殖，技术繁琐。
技术实现要素：
本发明是为了解决昆虫病原线虫活体繁殖效率低，无法工厂化生产的问题，提供一种昆虫病原线虫活体繁殖方法。
本发明昆虫病原线虫活体繁殖方法，按以下步骤进行：
一、选择健康的鳞翅目夜蛾科的斜纹夜蛾(prodenialitura(fabricius))6龄幼虫为昆虫病原线虫繁殖寄主；
二、将斜纹夜蛾幼虫放置于容器中，放置密度为1头/4cm2，使斜纹夜蛾幼虫饥饿9～11小时后，将侵染期昆虫病原线虫接种到斜纹夜蛾幼虫上，在室温下进行侵染繁殖；
所述接种方法为：将侵染期昆虫病原线虫悬浮液均匀喷施到斜纹夜蛾幼虫上，昆虫病原线虫与斜纹夜蛾幼虫的个数比为(0.9～1.1)万:1；
三、线虫收获：昆虫病原线虫在斜纹夜蛾幼虫体内繁殖，待斜纹夜蛾幼虫死亡后，移出已经死亡的斜纹夜蛾幼虫，收集线虫。使用自来水清洗线虫，然后放入冰箱保存。
一般在接种昆虫病原线虫72小时以后，斜纹夜蛾幼虫即死亡，准备收集线虫。
进一步的，所述昆虫病原线虫为斯氏线虫属(steinernemacarpocapsae)的线虫或异小杆线虫属(heterorhabditisbacteriophora)的线虫。
进一步的，步骤三所述收集线虫的及具体方法为：
移出已经死亡的斜纹夜蛾幼虫到无菌滤纸上，每条滤纸放120-150头斜纹夜蛾幼虫，滤纸下方放有吸了自来水的海绵块，利用昆虫病原线虫趋水性，使线虫爬出斜纹夜蛾幼虫体内，透过滤纸进入有水的海绵块中进行收集。在接种斜纹夜蛾幼虫第5-7天就有昆虫病原线虫爬出，每天收集线虫，收集10天，将线虫放入10℃冰箱保存。
本发明的有益效果：
本发明方法可高效率繁殖昆虫病原线虫，繁殖技术采用的繁殖寄主是鳞翅目夜蛾科的斜纹夜蛾(prodenialitura(fabricius))幼虫，技术原理是根据昆虫病原线虫可对斜纹夜蛾幼虫进行活体寄生的特性；利用昆虫病原线虫的趋水性进行昆虫病原线虫收集和收获；适合该繁殖方法的昆虫病原线虫包括斯氏线虫属(steinernemacarpocapsae)和异小杆(heterorhabditisbacteriophora)线虫属。经过12-16天的繁殖可获得昆虫病原线虫，每头斜纹夜蛾幼虫繁殖至少7-8万头昆虫病原线虫。
本发明在72小时以后寄主昆虫已全部死亡，5-7天就有线虫爬出，本方法的繁殖效率高、速度快。
本发明方法使用斜纹夜蛾作为寄主昆虫，其体大，为33-50毫米，斜纹夜蛾幼虫便于繁殖，且产量高。
本发明收集线虫所用的滤纸下海绵块里的水是自来水，清洗线虫用的也是自来水，条件要求低，无需使用无菌水，无需使用培养箱，适于工厂化生产。
本发明是利用昆虫病原线虫寄主的寄生特性，进行活体繁殖的工厂化生产，该技术生产过程简单，生产效率提高，降低了生产成本和技术难度。因此，该技术可大大促进昆虫病原线虫制剂的应用。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式昆虫病原线虫活体繁殖方法，按以下步骤进行：
一、选择健康的鳞翅目夜蛾科的斜纹夜蛾(prodenialitura(fabricius))6龄幼虫为昆虫病原线虫繁殖寄主；
二、将斜纹夜蛾幼虫放置于容器中，放置密度为1头/4cm2，使斜纹夜蛾幼虫饥饿9～11小时后，将侵染期昆虫病原线虫接种到斜纹夜蛾幼虫上，在室温下进行侵染繁殖；
所述接种方法为：将侵染期昆虫病原线虫悬浮液均匀喷施到斜纹夜蛾幼虫上，昆虫病原线虫与斜纹夜蛾幼虫的个数比为(0.9～1.1)万:1；
三、线虫收获：昆虫病原线虫在斜纹夜蛾幼虫体内繁殖，待斜纹夜蛾幼虫死亡后，移出已经死亡的斜纹夜蛾幼虫，收集线虫，使用自来水清洗线虫，然后放入冰箱保存。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所述昆虫病原线虫为斯氏线虫属(steinernemacarpocapsae)的线虫或异小杆线虫属(heterorhabditisbacteriophora)的线虫。其它与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤二中使斜纹夜蛾幼虫饥饿10小时。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤二中昆虫病原线虫与斜纹夜蛾幼虫的个数比为1万:1。其它与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤三所述收集线虫的及具体方法为：
移出已经死亡的斜纹夜蛾幼虫到无菌滤纸上，每条滤纸放120-150头斜纹夜蛾幼虫，滤纸下方放有吸了自来水的海绵块，利用昆虫病原线虫趋水性，使线虫爬出斜纹夜蛾幼虫体内，透过滤纸进入有水的海绵块中进行收集。在接种斜纹夜蛾幼虫第5-7天就有昆虫病原线虫爬出，每天收集线虫，收集10天，将线虫放入10℃冰箱保存。其它与具体实施方式一至四之一相同。
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
一、繁殖寄主选择：选择健壮肥大的斜纹夜蛾(prodenialitura(fabricius))幼虫用于昆虫病原线虫繁殖寄主；
二、寄主繁殖：人工繁殖饲养斜纹夜蛾幼虫，待幼虫达到6龄，挑选健康幼虫用于繁殖线虫；
三、将侵染期昆虫病原线虫接种到斜纹夜蛾幼虫上，进行侵染繁殖。接种方法是将侵染期昆虫病原线虫悬浮液均匀喷施到斜纹夜蛾幼虫上，昆虫病原线虫与斜纹夜蛾幼虫的个数比为1万:1；
四、线虫收获：昆虫病原线虫在斜纹夜蛾幼虫体内繁殖，待斜纹夜蛾幼虫死亡后，移出已经死亡的斜纹夜蛾幼虫，收集线虫。待昆虫病原线虫在斜纹夜蛾幼虫体内开始繁殖后，斜纹夜蛾幼虫开始死亡，移出已经死亡的斜纹夜蛾幼虫到20厘米×20厘米的塑料方盒中无菌滤纸上，滤纸下方放有吸了自来水的海绵块，一般在接种72小时以后移出死亡的斜纹夜蛾幼虫，该培养盒放置在25℃的车间内。利用昆虫病原线虫趋水性，使线虫爬出斜纹夜蛾幼虫体内，透过滤纸进入有水的海绵块中进行收集。在移出死亡的斜纹夜蛾幼虫第5-7天就有昆虫病原线虫爬出，每天收集线虫，收集10天，将线虫放入10℃冰箱保存。
本发明是国家科技部的农业科技成果转化项目“昆虫病原线虫大量繁殖技术转化与应用推广”的主要内容。于2009年——2014年间使用本方法进行了昆虫病原线虫活体大量繁殖试验。试验采用斜纹夜蛾幼虫繁殖了斯氏线虫属(steinernemacarpocapsae)sc-all品系和异小杆(heterorhabditisbacteriophora)线虫属hb-1品系，比较了2个属的典型代表品系的繁殖产量和效率，二者产量相当。均为接种第10-14天日产量达到高峰，在50:1-200:1的接种范围内，随着接种比例提高而产量呈升高趋势。斜纹夜蛾幼虫的繁殖线虫日产量高峰较大蜡螟提早3天。斜纹夜蛾繁殖的sc-all品系线虫的日产量在第11天达到1.5万条/头，hb-1品系的日产量在第14天达到0.9万条/头。以斜纹夜蛾为寄主对sc-all品系线虫较hb-1品系繁殖能力强。由于鳞翅目夜蛾科幼虫虫体较大，可收集线虫时间较长，到收集20d后，仍可收集到线虫。因此，该技术繁殖线虫高效，可用于工厂化生产。该技术在线虫生产车间进行了中试和大量生产应用，采用该技术生产的线虫产品制剂黑龙江、吉林、河南和宁夏等省区农田中进行了应用，控制地下害虫和钻驻性害虫效果显著。