本发明涉及干细胞
技术领域：
，尤其涉及一种胎盘间充质干细胞冻存液及其冻存方法。
背景技术：
：干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonicstemcell，es细胞)和成体干细胞(somaticstemcell)。根据干细胞的发育潜能分为三类:全能干细胞(totipotentstemcell，tsc)、多能干细胞(pluripotentstemcell)和单能干细胞(unipotentstemcell)(专能干细胞)。干细胞(stemcell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为"万用细胞"。胎盘中含有多种干细胞，包括间充质干细胞、造血干细胞、内皮干细胞和未知功能的多潜能干细胞等。间充质干细胞，英文名称为mesenchymalstemcells(msc)，也有其他名称，如骨髓基质细胞、脂肪干细胞、多潜能基质细胞等，是指单个或一群符合国际统一标准的细胞。胎盘间充质干细胞是干细胞中的一个重要类型，体内外均具有向骨、软骨和脂肪组织分化的能力，具有免疫调节、造血支持、促血管新生等作用。干细胞治疗是将具有不断自我繁殖能力和多向化潜能的干细胞在体外培养后，再将其移植入患者受损或缺损组织中，从而实现对损伤组织的补充和修复。目前干细胞主要采用冻存方式进行保存，但是冻存过程中会造成干细胞的损伤，因此需要加入冻存液来减缓细胞受损。现有的冻存液组分包括二甲基亚砜、白蛋白及富含多种营养成分的1640培养基，二甲基亚砜作为一种渗透性保护剂，具有较强的穿透能力，可降低细胞冰点，降低冷冻过程中细胞所受的损伤，但是二甲基亚砜有毒，而且在冻存液中所占比例大，容易造成蛋白质变性，最终影响干细胞的存活率。因此有必要研制一种冻存液，以及利用该冻存液进行冻存干细胞的冻存方法。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种胚胎间充质干细胞冻存液，该冻存液可减缓冻存过程中间充质干细胞所受的损伤，同时还解决了现有冻存液对间充质干细胞的毒性影响，改善了冻存效果，提高了间充质干细胞的存活率。为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种胚胎间充质干细胞冻存液，按照重量份数计包括下列组分：deme培养基40-70份、甘油磷酸钠溶液2-6份、羟乙基淀粉1-5份、甘露醇溶液1-4份、乙二醇0.3-0.8份、聚乙烯醇0.5-2份、海藻糖0.5-1.8份和聚乙烯吡咯烷酮0.5-1.5份。作为一种改进的技术方案，所述胚胎间充质干细胞冻存液，按照重量份数计包括下列组分：deme培养基50-70份、甘油磷酸钠溶液4-6份、羟乙基淀粉3-5份、甘露醇溶液2-4份、乙二醇0.5-0.8份、聚乙烯醇1-2份、海藻糖0.8-1.5份和聚乙烯吡咯烷酮0.8-1.5份。作为一种改进的技术方案，所述胚胎间充质干细胞冻存液还包括胶原1-3份。作为一种改进的技术方案，所述甘油磷酸钠溶液的质量浓度为0.5g/l-1.8g/l。作为一种改进的技术方案，所述甘露醇溶液的质量浓度为0.2-1.5g/ml。本发明所要解决的另一个技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种胚胎间充质干细胞的冻存方法。为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种胚胎间充质干细胞的冻存方法，所述冻存方法包括以下步骤：(1)冻存液的制备：将称取的甘露醇溶液、甘油磷酸钠溶液、乙二醇和聚乙烯醇，充分混合均匀，再依次加入deme培养基、海藻糖、胶原和聚乙烯吡咯烷酮，充分混合，得到冻存液；(2)胎盘组织预处理：将获取的新鲜胎盘组织，用pbs反复冲洗除去血迹，用酒精棉球消毒胎盘表面，再用生理盐水冲洗2-3次，备用；(3)胎盘间充质干细胞的分离：取步骤(2)中的胎盘组织，剪成碎片并置于离心管中，再加入等体积的消化酶，在30-37℃条件下进行消化，消化结束后收集消化液，离心，收集细胞沉淀，得到胎盘间充质干细胞；(4)胎盘间充质干细胞的培养：将步骤(3)中的胎盘间充质干细胞进行接种和培养，取对数生长期的胎盘间充质干细胞，清洗后置入步骤(1)的冻存液中，充分混匀，得到胎盘间充质干细胞和冻存液的混合物；(5)胎盘间充质干细胞的冻存：取步骤(4)中的混合物在冰浴上放置10-30min，再将混合物分阶段降温，最后将分阶段降温后的混合物置入液氮中冷冻保存。作为一种改进的技术方案，所述消化酶包括胰蛋白酶、胶原酶和透明质酸酶，且所述胰蛋白酶、胶原酶和透明质酸酶按照0.1～0.7:0.3～0.8:0.2～0.5的体积比组成。作为一种改进的技术方案，分阶段降温方式具体为第一阶段在-10℃～-20℃进行降温，第二阶段在-25℃～-40℃进行降温，第三阶段在-80℃进行降温。采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：(1)采用deme培养基，为胚胎间充质干细胞的冻存及复苏提供所需的氨基酸和营养成分；甘露醇溶液可以有效脱出细胞内的水分，减少冰晶的形成；甘油磷酸钠溶液、羟乙基淀粉、、乙二醇、聚乙烯醇、海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮和胶原的相互配合，形成稳定的液态体系，该体系形成膜状物质，通过膜状物质来包覆胚胎间充质干细胞，冻存液在侵润胚胎间充质干细胞的同时，还起到保护作用，降低了冻存过程胚胎间充质干细胞所受的损伤，大大提高了胚胎间充质干细胞的存活率；(2)采用上述冻存液来冻存细胞，而且在细胞冻存时，先用冰浴遇冷，然后采用分阶段降温的方式来冻存细胞，可有效减少细胞内部冰晶的形成，进一步降低细胞受损伤的可能性。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1一种胚胎间充质干细胞冻存液，按照重量份数计包括下列组分：deme培养基45份、甘油磷酸钠溶液3份(质量浓度0.5g/l)、羟乙基淀粉2份、甘露醇溶液2份(质量浓度0.5g/l)、乙二醇0.3份、聚乙烯醇0.5份、海藻糖0.5份和聚乙烯吡咯烷酮0.5份。实施例2一种胚胎间充质干细胞冻存液，按照重量份数计包括下列组分：deme培养基55份、甘油磷酸钠溶液4份(质量浓度1g/l)、羟乙基淀粉3份、甘露醇溶液3份(质量浓度0.8g/l)、乙二醇0.5份、聚乙烯醇1份、海藻糖0.8份、胶原2份和聚乙烯吡咯烷酮0.8份。实施例3一种胚胎间充质干细胞冻存液，deme培养基68份、甘油磷酸钠溶液6份(质量浓度1.5g/l)、羟乙基淀粉5份、甘露醇溶液4份(质量浓度1.2g/l)、乙二醇0.8份、聚乙烯醇2份、海藻糖1.5份、胶原2.5份和聚乙烯吡咯烷酮1.5份。实施例4一种胚胎间充质干细胞的冻存方法，所述冻存方法包括以下步骤：(1)冻存液的制备：将称取的甘露醇溶液、乙二醇和聚乙烯醇，充分混合均匀，再依次加入deme、海藻糖、胶原和聚乙烯吡咯烷酮，充分混合，得到冻存液；(2)胎盘组织预处理：将获取的新鲜胎盘组织，用pbs反复冲洗除去血迹，用酒精棉球消毒胎盘表面，再用生理盐水冲洗2-3次，备用；(3)胎盘间充质干细胞的分离：取步骤(2)中的胎盘组织，剪成碎片并置于离心管中，再加入等体积的消化酶(胰蛋白酶、胶原酶和透明质酸酶按照0.4:0.3:0.2的体积比组成)，在30-37℃条件下进行消化，消化结束后收集消化液，离心，收集细胞沉淀，得到胎盘间充质干细胞；(4)胎盘间充质干细胞的培养：将步骤(3)中的胎盘间充质干细胞进行接种和培养，取对数生长期的胎盘间充质干细胞，清洗后置入步骤(1)的冻存液中，充分混匀，得到胎盘间充质干细胞和冻存液的混合物；(5)胎盘间充质干细胞的冻存：取步骤(4)中的混合物在冰浴上放置10-30min，再将混合物采用分阶段降温方式进行冻存，其中第一阶段在-10℃～-20℃进行降温，第二阶段在-25℃～-40℃进行降温，第三阶段在-80℃进行降温。对比例1一种胚胎间充质干细胞冻存液，与实施例3相比，唯一区别在于冻存液中不含有甘油磷酸钠溶液。对比例2一种胚胎间充质干细胞冻存液，与实施例3相比，区别在于冻存液中不含有甘露醇溶液。对比例3一种胚胎间充质干细胞冻存液，与实施例3相比，区别在于冻存液中不含有胶原。对比例4一种胚胎间充质干细胞冻存液，与实施例3相比，区别在于冻存液中不含有聚乙烯吡咯烷酮。对比例5一种胚胎间充质干细胞冻存液，与实施例3相比，区别在于冻存液中不含有聚乙烯醇。将同一批次获得的胚胎间充质干细胞平均分为6组，每组20例样品，分别采用实施例1-3及对比例1-3中的组份来配置冻存液，并且进行冻存试验，冻存时间为6个月，冻存结束后，在37℃水浴中复苏，观察样品的沉淀，并采用台盼兰拒染法来测定每组实施例样品的存活率，记录数据并进行平均处理，试验结果见表1.表1为实施例1-3和对比例1-3样品的台盼兰拒染率和沉淀情况试验例台盼兰拒染率沉淀情况实施例196.2±0.5无实施例297.3±1.2无实施例397.6±1.5无对比例142.3±1.2沉淀较少对比例240.6±1.5沉淀较少对比例356.8±1.5沉淀较少对比例443.6±1.3沉淀较少由表1可知，实施例1-3配置的冻存液对间充质干细胞进行冻存，复苏后的间充质干细胞的台盼兰拒染率高，说明间充质干细胞复苏后死亡较少，说明甘油磷酸钠溶液、羟乙基淀粉、甘露醇溶液、乙二醇、聚乙烯醇、海藻糖和聚乙烯吡咯烷酮的相互配合，形成稳定的液态体系，该体系形成膜状物质对间充质干细胞的存活率起到了一定作用。而对比例1-4配置的冻存液对间充质干细胞进行冻存，复苏后的间充质干细胞的台盼兰拒染率低，说明间充质干细胞复苏后死亡多，说明不含甘油磷酸钠溶液、甘露醇溶液、聚乙烯醇、羟乙基淀粉、胶原、聚乙烯吡咯烷酮组份的冻存液来冻存间充质干细胞，会降低间充质干细胞的存活率。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12