本发明涉及细胞冻存技术领域，特别是涉及一种外周血单个核细胞的冻存方法。
背景技术：
外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,pbmc)是外周血中具有单个核的细胞群体，包括淋巴细胞(t细胞、b细胞和自然杀伤细胞)和单核细胞等多种免疫细胞及造血干细胞。pbmc在人体中含量丰富，其在疾病诊断、药物分析、抗体研究、细胞治疗等前沿医学领域中发挥重要作用，具有广阔的医学应用前景。目前最热门的免疫治疗策略，其主要思路为：在年轻时保存自体健康的免疫细胞(即指pbmc)，中老年经过体外增殖处理后回输体内。这一技术能显著改善年龄导致的免疫力低下和亚健康，有利于提高中老年的寿命和亚健康人群的生活质量，但其重要的技术步骤之一，即为pbmc细胞的超低温长期储存和复苏。
pbmc在医学研究和临床上应用广泛，故其冻存方式尤为重要。与其它细胞相比，pbmc细胞直径区间相对较小，总体上更为脆弱，冻存复苏的处理操作很容易破坏pbmc的形态和功能，复苏后可明显观察到细胞结团、裂解、数目减少，活性降低。目前细胞冻存采用-196℃液氮程控降温保存，理论上可使细胞保存23～25年，数量和活力达到90％。但pbmc的复苏数目和活率常常仅有50％～80％，时间仅有2～3年，甚至更低，严重影响了pbmc细胞的研究和应用。
技术实现要素：
基于此，有必要提供一种长时间冻存复苏后细胞得率活率较高的外周血单个核细胞的冻存方法。
一种外周血单个核细胞的冻存方法，包括以下步骤：
将外周血单个核细胞与预处理液混合，于-10℃～4℃接触≥20min；所述预处理液中含有海藻糖和抗坏血酸；
从所述预处理液中分离外周血单个核细胞，然后与冻存液混合，经程序性降温后转入液氮中保存；所述冻存液中含有海藻糖、抗坏血酸、rock激酶抑制剂、dmso和血清。
在传统的细胞冻存方法中，往往都是将待冻存的细胞离心收集后直接与冻存液混合，然后进入程序性降温过程，以追求最大限度地保存细胞活力，提高冻存的质量。而本发明针对外周血单个核细胞的冻存采用的是不同的思路，主要为先通过预处理液对外周血单个核细胞进行预处理，预处理液中的海藻糖可与细胞膜中的脂质相互作用从而保护细胞膜的完整性，而抗坏血酸可恢复失活的维生素e，减少活性氧(ros)诱导的dna破坏，并减少脂质过氧化。如此，通过海藻糖和抗坏血酸协同配合诱导细胞提前建立抵抗超低温冻存产生的凋亡、坏死、裂解作用，使细胞以更佳的状态进入后续冻存流程。然后，再将经过预处理的外周血单个核细胞与冻存液混合，通过在冻存液中加入三种特异性针对冻存损伤机制的保护试剂组合即海藻糖、抗坏血酸和rock激酶抑制剂，可以稳定细胞膜，保护胞内蛋白不被降解，有效提高冻存复苏后pbmc的数量、活性和功能。最后，将pbmc进行程序性降温，并转入液氮中长期保存。
在其中一个实施例中，所述预处理液中，所述海藻糖的浓度为50mmol/l～150mmol/l，所述抗坏血酸的浓度为0.125mmol/l～0.375mmol/l。
在其中一个实施例中，所述预处理液中，所述海藻糖的浓度为90mmol/l～110mmol/l，所述抗坏血酸的浓度为0.2mmol/l～0.3mmol/l。
在其中一个实施例中，所述冻存液中，所述海藻糖的浓度为50mmol/l～150mmol/l，所述抗坏血酸的浓度为0.125mmol/l～0.375mmol/l，所述rock激酶抑制剂的浓度为5mmol/l～15mmol/l，所述血清的体积百分比为70％～90％，所述dmso的体积百分比为8％～12％。
在其中一个实施例中，所述冻存液中，所述海藻糖的浓度为90mmol/l～110mmol/l，所述抗坏血酸的浓度为0.2mmol/l～0.3mmol/l，所述rock激酶抑制剂的浓度为9mmol/l～11mmol/l。
在其中一个实施例中，所述外周血单个核细胞以白膜层细胞的形式与所述预处理液混合。
在其中一个实施例中，所述白膜层细胞通过以下步骤得到：获取外周血并离心收集血细胞沉淀，采用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，收集白膜层细胞。
在其中一个实施例中，所述接触的过程伴随外周血单个核细胞的离心分离。
在其中一个实施例中，所述外周血单个核细胞与所述冻存液混合后，细胞密度为(0.5～2)×107个/ml。
在其中一个实施例中，所述rock激酶抑制剂包括ar-12286、y-27632和snj-1656中的一种或多种。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明一实施例的外周血单个核细胞的冻存方法，包括以下步骤s1～s2：
s1、将外周血单个核细胞与预处理液混合，于-10℃～4℃接触≥20min。其预处理液中含有海藻糖和抗坏血酸。
s2、从预处理液中分离外周血单个核细胞，然后与冻存液混合，经程序性降温后转入液氮中保存。其冻存液中含有海藻糖、抗坏血酸、rock激酶抑制剂、dmso和血清。
在传统的细胞冻存方法中，往往都是将待冻存的细胞离心收集后直接与冻存液混合，然后进入程序性降温过程，以追求最大限度地保存细胞活力，提高冻存的质量。而本发明针对外周血单个核细胞的冻存采用的是不同的思路，主要为先通过预处理液对外周血单个核细胞进行预处理，预处理液中的海藻糖可与细胞膜中的脂质相互作用从而保护细胞膜的完整性，而抗坏血酸可恢复失活的维生素e，减少活性氧(ros)诱导的dna破坏，并减少脂质过氧化。如此，通过海藻糖和抗坏血酸协同配合诱导细胞提前建立抵抗超低温冻存产生的凋亡、坏死、裂解作用，使细胞以更佳的状态进入后续冻存流程。然后，再将经过预处理的外周血单个核细胞与冻存液混合，通过在冻存液中加入三种特异性针对冻存损伤机制的保护试剂组合即海藻糖、抗坏血酸和rock激酶抑制剂，可以稳定细胞膜，保护胞内蛋白不被降解，有效提高冻存复苏后pbmc的数量、活性和功能。最后，将pbmc进行程序性降温，并转入液氮中长期保存。
综上所述，本发明通过二步法对pbmc进行处理，并在预处理液及冻存液中配合加入特异性针对冻存损伤机制的保护试剂组合对pbmc进行冻存保护，经实验证明，该方法能够显著地提高长时间冻存后复苏pbmc细胞的数量、活性，并维持其功能，确保pbmc长期低温冻存的效率，有效地解决了pbmc长期超低温冻存后复苏数目和活率显著下降的问题，有利于推进pbmc细胞医学研究和临床应用的发展。
在一个具体示例中，预处理液中，海藻糖的浓度为50mmol/l～150mmol/l，抗坏血酸的浓度为0.125mmol/l～0.375mmol/l。优选地，预处理液中，所述海藻糖的浓度为90mmol/l～110mmol/l，所述抗坏血酸的浓度为0.2mmol/l～0.3mmol/l，复苏后的细胞得率和细胞活率更高。
在一个具体示例中，冻存液中，海藻糖的浓度为50mmol/l～150mmol/l，抗坏血酸的浓度为0.125mmol/l～0.375mmol/l，rock激酶抑制剂的浓度为5mmol/l～15mmol/l，血清的体积百分比为70％～90％，dmso的体积百分比为8％～12％。rock激酶抑制剂可以通过减少凋亡的负面影响来提高细胞存活率，从而提高复苏后细胞增殖效率，充分量的血清可以提供细胞生存所需的天然蛋白和细胞因子，适量dmso可以防止细胞中冰晶的产生，保护成分浓度太低将不能提供充足的抗凋亡、抗氧化效果，保护成分浓度太高则会提高成本，还可能显著影响细胞形态和功能。优选地，血清为自体血清。
优选地，冻存液中，海藻糖的浓度为90mmol/l～110mmol/l，抗坏血酸的浓度为0.2mmol/l～0.3mmol/l，rock激酶抑制剂的浓度为9mmol/l～11mmol/l，冻存的效果更好。
在一个具体示例中，外周血单个核细胞以白膜层细胞的形式与预处理液混合。可选地，白膜层细胞通过以下步骤得到：获取外周血并离心收集血细胞沉淀，采用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，收集白膜层细胞。优选地，密度梯度离心的离心力为450g～550g，离心时间为20～30min。可以理解，外周血单个核细胞也可从其他来源获得，例如直接离心收集培养基中的纯外周血单个核细胞。
在一个具体示例中，上述接触的过程伴随外周血单个核细胞的离心分离，即接触的过程中采用新鲜的预处理液置换预处理液一次或多次，从而更好地诱导细胞提前建立抵抗超低温冻存产生的凋亡、坏死、裂解作用，并可进一步去除杂质。
在一个具体示例中，外周血单个核细胞与冻存液混合后，细胞密度为(0.5～2)×107个/ml，采用适宜的细胞密度冻存效率更高。
在一个具体示例中，rock激酶抑制剂包括ar-12286、y-27632和snj-1656中的一种或多种。超低温保存复苏过程诱导细胞凋亡，细胞分裂成小的聚集体，复苏后大量细胞死亡，这种凋亡可能与rhoa鸟苷三磷酸信号通路有关，rock激酶抑制剂则可以通过减少凋亡的负面影响来提高细胞存活率。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
实施例1
本实施例提供一种高效的外周血单个核细胞pbmc的冻存方法，具体包括如下步骤：
(1)抽取外周血之前，志愿者签署知情同意书。
(2)抽取外周血50ml置于50ml离心管中，3000rpm离心20分钟。
(3)分离上层血浆，56℃灭活30分钟后，3000rpm离心10分钟，上清置于4℃冰箱备用。
(4)下层全血经淋巴细胞分离液ficoll密度梯度500g，离心25分钟，分离获得中间白膜层细胞。
(5)制备pbmc预处理液：按体积和浓度含量，将海藻糖、抗坏血酸与pbs(磷酸缓冲液)溶液混匀，制得pbmc预处理液，海藻糖终浓度为100mm，抗坏血酸终浓度为0.25mm，于4℃保存备用。
(6)制备pbmc冻存液：按体积和浓度含量，将海藻糖、抗坏血酸、y-27632、dmso、自体血清混匀，制得pbmc冻存液，海藻糖终浓度为100mm，抗坏血酸终浓度为0.25mm，y-27632终浓度为10mm，dmso的体积百分比为10％，自体血清的体积百分比为80％，于4℃保存备用，现配现用。
(7)白膜层细胞用pbmc预处理液45ml重悬，冰上静置5分钟，400g，离心10分钟，弃上清。
(8)离心后下层细胞再用pbmc预处理液45ml重悬，冰上静置5分钟，400g，离心8分钟，弃上清，收集外周血单个核细胞。
(9)冻存：单个核细胞以1×107个细胞/ml与pbmc冻存液混合放入2ml冻存管中。将冻存管放入程序降温盒并放入-80℃深低温冰箱24小时，第二天转入液氮罐(-196℃)中存储。
(10)复苏：从液氮罐取出装有pbmc的冻存管，快速置于37℃水浴3～5分钟，轻柔振荡直至细胞悬液将要完全融化，加入30ml淋巴细胞培养基重悬细胞，400g，离心10分钟，弃上清。重复洗涤1～2次，即可。
实施例2
本实施例提供一种高效的外周血单个核细胞pbmc的冻存方法，具体包括如下步骤：
(1)抽取外周血之前，志愿者签署知情同意书。
(2)抽取外周血50ml置于50ml离心管中，3000rpm离心20分钟。
(3)分离上层血浆，56℃灭活30分钟后，3000rpm离心10分钟，取上清置于4℃冰箱备用。
(4)下层全血经淋巴细胞分离液ficoll密度梯度500g，离心25分钟，分离获得中间白膜层细胞。
(5)制备pbmc预处理液：按体积和浓度含量，将海藻糖、抗坏血酸与pbs溶液混匀，制得pbmc预处理液，海藻糖终浓度为50mm，抗坏血酸终浓度为0.125mm，于4℃保存备用。
(6)制备pbmc冻存液：按体积和浓度含量，将海藻糖、抗坏血酸、y-27632、dmso、自体血清混匀，制得pbmc冻存液，海藻糖终浓度为50mm，抗坏血酸终浓度为0.125mm，y-27632终浓度为5mm，dmso的体积百分比为10％，自体血清的体积百分比为80％，于4℃保存备用，现配现用。
(7)白膜层细胞用pbmc预处理液45ml重悬，冰上静置5分钟，400g，离心10分钟，弃上清。
(8)离心后下层细胞用pbmc预处理液45ml重悬，冰上静置5分钟，400g，离心8分钟，弃上清，收集外周血单个核细胞。
(9)冻存：单个核细胞以1×107个细胞/ml与pbmc冻存液混合放入2ml冻存管中。将冻存管放入程序降温盒并放入-80℃深低温冰箱24小时，第二天转入液氮罐(-196℃)中存储。
(10)复苏：从液氮罐取出装有pbmc的冻存管，快速置于37℃水浴3～5分钟，轻柔振荡直至细胞悬液将要完全融化，加入30ml淋巴细胞培养基重悬细胞，400g，离心10分钟，弃上清。重复洗涤1～2次，即可。
实施例3
本实施例提供一种高效的外周血单个核细胞pbmc的冻存方法，具体包括如下步骤：
(1)抽取外周血之前，志愿者签署知情同意书。
(2)抽取外周血50ml置于50ml离心管中，3000rpm离心20分钟。
(3)分离上层血浆，56℃灭活30分钟后，3000rpm离心10分钟，取上清置于4℃冰箱备用。
(4)下层全血经淋巴细胞分离液ficoll密度梯度500g，离心25分钟，分离获得中间白膜层细胞。
(5)制备pbmc预处理液：按体积和浓度含量，将海藻糖、抗坏血酸与pbs溶液混匀，制得pbmc预处理液，海藻糖的终浓度为150mm，抗坏血酸的终浓度为0.375mm，于4℃保存备用。
(6)制备pbmc冻存液：按体积和浓度含量，将海藻糖、抗坏血酸、y-27632、dmso、自体血清混匀，制得pbmc冻存液，海藻糖的终浓度为150mm，抗坏血酸的终浓度为0.375mm，y-27632的终浓度为15mm，dmso的体积百分比为10％，自体血清的体积百分比为80％，于4℃保存备用，现配现用。
(7)白膜层细胞用pbmc预处理液45ml重悬，冰上静置5分钟，400g，离心10分钟，弃上清。
(8)离心后下层细胞用pbmc预处理液45ml重悬，冰上静置5分钟，400g，离心8分钟，弃上清，收集外周血单个核细胞。
(9)冻存：单个核细胞以1×107个细胞/ml与pbmc冻存液混合放入2ml冻存管中。将冻存管放入程序降温盒并放入-80℃深低温冰箱24小时，第二天转入液氮罐(-196℃)中存储。
(10)复苏：从液氮罐取出装有pbmc的冻存管，快速置于37℃水浴3～5分钟，轻柔振荡直至细胞悬液将要完全融化，加入30ml淋巴细胞培养基重悬细胞，400g，离心10分钟，弃上清。重复洗涤1～2次，即可。
对比例1
本对比例与实施例1相比，区别在于pbmc分离后无预处理步骤，具体步骤如下：
(1)抽取外周血之前，志愿者签署知情同意书。
(2)抽取外周血50ml置于50ml离心管中，3000rpm离心20分钟。
(3)分离上层血浆，56℃灭活30分钟后，3000rpm离心10分钟，上清置于4℃冰箱备用。
(4)下层全血经淋巴细胞分离液ficoll密度梯度500g，离心25分钟，分离获得中间白膜层细胞。
(5)制备pbmc冻存液：按体积和浓度含量，将海藻糖、抗坏血酸、y-27632、dmso、自体血清混匀，制得pbmc冻存液，海藻糖终浓度为100mm，抗坏血酸终浓度为0.25mm，y-27632终浓度为10mm，dmso的体积百分比为10％，自体血清的体积百分比为80％，于4℃保存备用，现配现用。
(6)冻存：单个核细胞以1×107个细胞/ml与pbmc冻存液混合放入2ml冻存管中。将冻存管放入程序降温盒并放入-80℃深低温冰箱24小时，第二天转入液氮罐(-196℃)中存储。
(7)复苏：从液氮罐取出装有pbmc的冻存管，快速置于37℃水浴3～5分钟，轻柔振荡直至细胞悬液将要完全融化，加入30ml淋巴细胞培养基重悬细胞，400g，离心10分钟，弃上清。重复洗涤1～2次，即可。
对比例2
本对比例与实施例1相比，区别在于无预处理步骤，且冻存试剂中不含有海藻糖和抗坏血酸。具体步骤如下：
(1)抽取外周血之前，志愿者签署知情同意书。
(2)抽取外周血50ml置于50ml离心管中，3000rpm离心20分钟。
(3)分离上层血浆，56℃灭活30分钟后，3000rpm离心10分钟，上清置于4℃冰箱备用。
(4)下层全血经淋巴细胞分离液ficoll密度梯度500g，离心25分钟，分离获得中间白膜层细胞。
(5)制备pbmc冻存液：按体积和浓度含量，将dmso、1640培养基、自体血清混匀，制得pbmc冻存液，dmso的体积百分比为10％，1640培养基的体积百分比为10％，自体血清的体积百分比为80％，于4℃保存备用，现配现用。
(6)冻存：单个核细胞以1×107个细胞/ml与pbmc冻存液混合放入2ml冻存管中。将冻存管放入程序降温盒并放入-80℃深低温冰箱24小时，第二天转入液氮罐(-196℃)中存储。
(7)复苏：从液氮罐取出装有pbmc的冻存管，快速置于37℃水浴3～5分钟，轻柔振荡直至细胞悬液将要完全融化，加入30ml淋巴细胞培养基重悬细胞，400g，离心10分钟，弃上清。重复洗涤1～2次，即可。
对比例3
本对比例与实施例1相比，区别在于预处理液中不含有海藻糖和抗坏血酸。具体步骤如下：
(1)抽取外周血之前，志愿者签署知情同意书。
(2)抽取外周血50ml置于50ml离心管中，3000rpm离心20分钟。
(3)分离上层血浆，56℃灭活30分钟后，3000rpm离心10分钟，上清置于4℃冰箱备用。
(4)下层全血经淋巴细胞分离液ficoll密度梯度500g，离心25分钟，分离获得中间白膜层细胞。
(5)制备pbmc冻存液：按体积和浓度含量，将海藻糖、抗坏血酸、y-27632、dmso、自体血清混匀，制得pbmc冻存液，海藻糖终浓度为100mm，抗坏血酸终浓度为0.25mm，y-27632终浓度为10mm，dmso的体积百分比为10％，自体血清的体积百分比为80％，于4℃保存备用，现配现用。
(6)白膜层细胞用pbs45ml重悬，冰上静置5分钟，400g，离心10分钟，弃上清。
(7)离心后下层细胞再用pbs45ml重悬，冰上静置5分钟，400g，离心8分钟，弃上清，收集外周血单个核细胞。
(8)冻存：单个核细胞以1×107个细胞/ml与pbmc冻存液混合放入2ml冻存管中。将冻存管放入程序降温盒并放入-80℃深低温冰箱24小时，第二天转入液氮罐(-196℃)中存储。
(9)复苏：从液氮罐取出装有pbmc的冻存管，快速置于37℃水浴3～5分钟，轻柔振荡直至细胞悬液将要完全融化，加入30ml淋巴细胞培养基重悬细胞，400g，离心10分钟，弃上清。重复洗涤1～2次，即可。
对比例4
本对比例与实施例1相比，区别在于预处理液中海藻糖替换为甘油，抗坏血酸替换为谷胱甘肽。具体步骤如下：
(1)抽取外周血之前，志愿者签署知情同意书。
(2)抽取外周血50ml置于50ml离心管中，3000rpm离心20分钟。
(3)分离上层血浆，56℃灭活30分钟后，3000rpm离心10分钟，上清置于4℃冰箱备用。
(4)下层全血经淋巴细胞分离液ficoll密度梯度500g，离心25分钟，分离获得中间白膜层细胞。
(5)制备pbmc预处理液：按体积和浓度含量，将甘油、谷胱甘肽与pbs溶液混匀，制得pbmc预处理液，甘油终浓度为5％，谷胱甘肽终浓度为2mm，于4℃保存备用。
(5)制备pbmc冻存液：按体积和浓度含量，将海藻糖、抗坏血酸、y-27632、dmso、自体血清混匀，制得pbmc冻存液，海藻糖终浓度为100mm，抗坏血酸终浓度为0.25mm，y-27632终浓度为10mm，dmso的体积百分比为10％，自体血清的体积百分比为80％，于4℃保存备用，现配现用。
(6)白膜层细胞用pbmc预处理液45ml重悬，冰上静置5分钟，400g，离心10分钟，弃上清。
(7)离心后下层细胞再用pbmc预处理液45ml重悬，冰上静置5分钟，400g，离心8分钟，弃上清，收集外周血单个核细胞。
(8)冻存：单个核细胞以1×107个细胞/ml与pbmc冻存液混合放入2ml冻存管中。将冻存管放入程序降温盒并放入-80℃深低温冰箱24小时，第二天转入液氮罐(-196℃)中存储。
(9)复苏：从液氮罐取出装有pbmc的冻存管，快速置于37℃水浴3～5分钟，轻柔振荡直至细胞悬液将要完全融化，加入30ml淋巴细胞培养基重悬细胞，400g，离心10分钟，弃上清。重复洗涤1～2次，即可。
冻存效果测试：
采用实施例1～3和对比例1～4的冻存方法分别冻存外周血单个核细胞1个月、6个月和12个月后，检测复苏的外周血单个核细胞的细胞得率、细胞活率和细胞功能，结果如下所示。
复苏后立即对细胞进行计数，计数结果除以冻存时的细胞数量，最后结果用百分比表示，为细胞得率。用台盼蓝染色法计算活细胞数目，除以复苏后细胞总数，为细胞活率，用百分比表示。将各组复苏后pbmc细胞取5×106个置于细胞培养板中，置饱和湿度，5％co2培养箱中，37℃培养24小时后，加入lps40ng/ml，48小时后收集上清，用elisa试剂盒检测其ifn-γ的含量。
细胞得率结果见下表1所示，可以看出，常规冻存方案细胞复苏后得率显著降低，冻存越久得率越低。在预处理液中加入海藻糖和抗坏血酸对细胞进行预处理后，细胞得率显著提高，其中实施例1最优。
细胞活率结果见下表2所示，可以看出，常规冻存方案细胞复苏后活率显著降低，冻存越久活率越低。在预处理液中加入海藻糖和抗坏血酸对细胞进行预处理后，细胞活率提高，其中实施例1最优。
细胞功能结果见下表3所示，可以看出，实施例各组经lps刺激后ifn-γ的含量没有明显降低，各组误差在合理范围内，对比例则有明显降低。结果表明，预处理和保护性试剂组合的使用没有影响pbmc细胞的功能。
通过以上实施例和对比例可以说明，采用本发明的外周血单个核细胞pbmc的冻存方法能够使细胞复苏后的细胞得率最高达到95％以上，细胞活率达到95％以上，并能维持pbmc的功能不受影响。本发明能有效解决外周血单个核细胞冻存复苏后得率差、活性低、运输困难的问题，有望促进pbmc细胞医学研究和临床应用的进一步发展。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。