专利名称：防治害虫的方法和制剂的制作方法
本申请是1992年12月30日呈交的序号为07/999,185的未决申请的部分后续，该未决申请是1991年4月18日呈交的序号为07/687,362的申请(现已放弃)的后续。本申请也是1992年12月30日呈交的序号为07/999,186的未决申请的部分后续，该未决申请是1991年4月18日呈交的序号为07/687,361的申请(现已放弃)的后续。
开发生物防治剂作为防治重要的害虫种类的化学杀虫剂的替代品，是人们日益感兴趣的课题。对环境和人暴露于空气、食物和水中的有害物质的关注，一直刺激着有关化学农药应用(特别是用于出现在都市环境的害虫的化学农药应用)的立法和限制。防治都市中的害虫是人们非常需要的，但暴露于室内和来自草坪和花园的化学农药是公众尤为关注的。如果给予选择，大多数人会选用非毒性的生物防治，而不会选用毒性化学品来防治都市环境中的害虫。问题是，公众所能购买和使用的替代化学杀虫剂的生物替代品寥寥无几。
对于都市环境中需要防治的大多数害虫(蚂蚁、蟑螂、白蚁、虱、黄蜂等)，现还没有可作为产品购买到的生物制剂。
蟑螂是都市环境中的严重经济害虫。由于蟑螂与人类密切相关，且以腐坏食物、面包屑或废弃物为普通食物，并频繁出没于不洁场所如下水道和化粪池，因此它们的存在造成对人类健康的潜在威胁。业已从采集于家里或家周围环境的蟑螂中分离出致病微生物。然而，蟑螂作为病原体媒介的作用是有争议的。蟑螂不象许多嗜血的节肢动物那样会由于其嗜血行为而导致将病原体直接传染给人，蟑螂是经食物污染或用于准备食物的用具污染而非直接地潜在传染病原体。业已证实，蟑螂只是简单地爬过培养物就可沾上病原细菌，表明这些病原菌随后经由滋生的蟑螂的正常找寻行为转移到粮食上。除了细菌引起的食物中毒和疾病如伤寒和痢疾有报道外，也有报道说许多其它人类疾病与从蟑螂分离出的微生物有关。这些疾病包括麻痹性脊髓灰质炎、贾第虫病、真菌性耳炎、肺霉菌病和各种蠕虫病如钩虫病和绦虫病。
除了蟑螂作为致病微生物媒介的可能作用外，还知道，仅仅是蟑螂的存在就可以以另一种方式促成人的病态。或许最无意中加剧的心理冲击是蟑螂滋生而引起的焦虑和紧张，这种焦虑和紧张在某些情况下会呈现反常的程度。再者，蟑螂种群间的防卫性分泌物可在不期与蟑螂接触的个别人中引起灼伤感、晕眩或呕吐。
目前在建筑物中的蟑螂防治方法包括预防和灭除方法。预防措施强调环境卫生以消除躲藏处和食物源，封住进入途径，和在建筑期间在墙空隙里施用硼酸或吸附粉而产生不利的环境(Ebeling，W.Ann.Rev.Entomol.16123-158；Ebeling.W.Urban Entomology，BerkeleyUniv.Calif Div.Agric.Sci.695pp)。然而，这些措施的实施困难，因而限制其有效性(Thomos，E.M，W.H.RobinsonJ.Econ.Entomol.80131-135)。用来压制已建立好的滋生种群的灭除措施强调施用杀虫剂。通常采用的技术是以固定的时间间隔喷酒长残效的杀虫剂于蟑螂经常出没的场所(Schal，C.，R.I，HamiltonAnn.Rev.Entomol.35521-551)。尽管短期压制住了蟑螂种群，但毒性残留和杀虫剂抗性的增长(Cochran，D.G.J.Econ.Entomol.82336-341)使得完全依赖于此项技术不现实。替代的灭除措施如放置毒饵捕集器在适当的条件下可提供令人满意的防治(Thoms&Robinson，同上)。
业已对天敌生物防治蟑螂的应用作了各种程度的试验。虽然曾建议过用生物防治剂的捕集器，但这些捕集器只与所使用的生物制剂效果相同。USP5,057,315和5,057,316，大田释放美洲蟑螂和褐带蟑螂的拟寄生生物，导致高达95％的寄生率，因而产生对其潜在应用的某些乐观态度(Coler，R.R.，Van Driesche，R.G.，Elkinton，J.S.Environ.Entomol.13603-606；Hagenbuch，B.E.，R.S.Patterson，P.G.KoehlerJ.Econ.Entomol 8290-94)。从实验室蟑螂群落分离出的致病酵母也曾建议来作为可能的生物防治剂，但需要更多的研究来评价其可能性(Archbold，E.F.，M.K.Rust，D.A.ReiersonJ.Med.Enfomol.24269-272；Archbold，E.F.，M.K.Rust，D.A.Reierson，K.D.AtkinsonEnviron.Entomol.15221-226；Verrett，J.M.，K.B.Green，L.M.Gamble，F.C.CrochenJ.Econ.Entomol.801205-1212)。曾有报道，许多其它真菌、细菌、原虫和线虫与蟑螂有关联，但它们作为生物防治剂的潜在可能不明显，或未作全面评价(Roth和WillisSmithsonian Misc.Coll.Vol.141；Tsai，Y.H.，K.M.CahillJ.Parasitol.56375-377；Zervos，S.N.Z.J.Zool.10329-334；Rahmet-Alla，M.，A.F.Rowley J.Invert.Path.53190-196)。因此，防治蟑螂的更有效和更安全的方式是人们明显且长期渴望的。
木工蚁(Camponotus spp.)分布整个北美洲。一些通常和/或研究的种类包括见于太平洋西北部的C.modoc，南加州的C.Clarithorax，佛罗里达州的C.floridanus，见于东部的黑木工蚁(C.pennsylvanicms)、C.naveboracensis和佛州木工蚁(C.abdominalis)(Ebeling，W.Urban Entomology，Univ CalifBerkeley p.209-213)。由于郊区开发延伸至这些蚂蚁的森林栖生地而使建筑物滋生蚂蚁有更大的可能性，因此公众对木工蚁的关注日益增加。
木工蚁的有害种类会被当作烦人的害虫，因为它们有藏匿于家中的习性。当木工蚁将其巢穴延伸至结实的木头时，会出现更为明显的损害。巢穴的地点可能位于活和死的树木，有时导致对遮阴树木的损害。巢穴也可能设在墙中和建筑物的承重梁中，或在门、墙和家具的缝隙中。有报道说，木工蚁喜欢潮湿或腐坏的木材，但巢穴的位点不限于此类场所。木工蚁的种群发展相对缓慢，对于不同的种类，繁殖300-2,000只工蚁的群落要经2年或更长的时间。已有报道，母体的繁殖只来自已固定好的群落，因此，母体随群落的缓慢发展而出现(Hansen，L.D.，R.D.Akre″Biology of carpenter ants in Washington state(Hymenoptera；FomicidaeCamponotus)，″Melanderia 4362pp；Pricer，IIBiot.Bull.14177-128)。尽管群落生长缓慢，业已发现带有卫星群落的大群落。工蚁的迁移出现于主群落和卫星群落间，这之间作进一步的种群发展和群落扩张的场所(Hansen和Akre，同上)。
目前的防治建筑物木工蚁滋生的方法包括将潜在和已有的巢穴位点作卫生清理，尽量减少通达建筑物的途径(例如，防止树枝与建筑物的接触)，和施用杀虫剂驱避(周边喷酒障碍物)和/或消灭木工蚁。有报道说，使用硼酸粉于干的墙缝隙有效期达20年(Hansen和Arke，同上)。
推荐化学防治家中已安居好的建筑物滋生蚁，通常伴随着对用户以及孩子和宠物的可能危害的警告。另一种防治方法如有效的生物防治未曾见到(Akre，R.D.，L.D.Hansen，A.I.Antonell；Ext.Bull.Washington State Univ.Coop.Ext.Serv.1989 rev.no.EB0818，6pp)。显然需要一种用于木工蚁的安全有效的生物防治剂。
小家蚁(Monomorium pharaonis)被描述成“...所有住宅滋生蚁中最难防治或铲除的”(Smith，M.R.USDA-ARS Tech.Bull.No.1326105pp)。它是一种热带种，但其活动范围延伸至较温和的区域，在加热的建筑中建立群落。小家蚁频繁滋生于准备有食物的建筑，且已发现携带病原微生物(Beatson.S.H.Lancet 1425-427)。
防治小家蚁之所以困难，可能是由于其难以达到的巢穴位置。迅速的种群生长和群落扩散。其小的身体让其在任何适合的位置建立群落，包括在如书本间和贮藏的衣物里这样的不寻常地方。若是多蚁王群落且有适于小家蚁的温(30℃)湿(63-80％RH)条件，大的群落可以迅速发展。或者是由于过份拥挤和不利的微环境条件，这些大群落的多个部分可扩散，在任何时间形成新的群落。不象其它的蚂蚁种类，小家蚁不表现群落间敌对行为，这使得接纳来自其它群落的小家蚁，并可能进一步有促于新群落的建立和再滋生。小家蚁找寻食物可离巢超过35米的距离，而没有明显的蚁径可循，这使得难以找到到和铲除蚁巢。
防治小家蚁的方法强调使用昆虫生长调节剂(IGR)或掺入饵料中的毒剂。正确地实施的诱饵方案是行之有效的，然而它可能要花费一个月的时间来获得所需的防治。杀虫剂施用虽然作用快，但通常不能消灭群落，且可能在关注毒性残留的某些区域是不能接受的。此外，杀虫剂施用一般不能与诱饵方案相容。因此，人们需要防治小家蚁的安全有效的生物防治剂。
USP4,925,663业已被授予专利权给一种显示出对火蚁有高活性的真菌。这种分离菌，标示为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)分离菌No.477，保藏于公共保藏点。除了对火蚁的有活性外，以前从未有报道这种分离菌有其它生物活性，且从此信息推断不出对其它害虫的可能活性。本发明涉及球孢白僵菌No.477的新用途。
本发明涉及高致病力球孢白僵菌分离菌防治某些害虫包括蟑螂、木工蚁、火蚁和小家蚁的应用。具体地说，本文例示的是含有球孢白球菌分离菌No.477和SP111的制剂。这些分离菌优越地显示出出人意外的对某些害虫包括蟑螂、木工蚁、火蚁和小家蚁的高致病力，并且不产生与化学防治剂相关的环境危害。本文描述的真菌生物农药可施用于这些害虫正常栖生地之任一中的各种种类。该真菌也可例如直接以捕集器施用于害虫，或施用于其周围，或这些害虫成问题的任何地方。本发明也包括例示分离菌的基本上保留母菌株高效病力的突变体。
本发明的另一方面涉及可以有效地释放生物防治剂于靶害虫的独特制剂。在优选实施方案中，生物防治剂在制剂中被释放，而该制剂很易被靶害虫找寻到并粘附于害虫的身体上，本文具体例示了一种制剂，该制剂业已发现对火蚁和其它害虫无驱避性。此项发现是非常意外的，因为已知害虫被微生物药剂的许多制剂所驱避。本发明制剂特别优越，因为业已发现它在释放生物防治剂于靶害虫上非常有效。本发明的制剂包含食物源和真菌生物防治剂的独特混合。在优选实施方案中，还采用干燥剂。这些成份以干粉出现。
图1显示木工蚁暴露于球孢白僵菌分离菌No.447的累积百分死亡率。
图2显示木工蚁暴露于球孢白僵菌分离菌Sp111的累积百分死亡率。
图3显示小家蚁暴露于球孢白僵菌分离菌No.447的累积百分死亡率。
图4显示德国蠊暴露于球孢白僵菌分离菌No.447的累积百分死亡率。
图5显示美洲蠊暴露于球孢白僵菌分离菌No.447的螺积百分死亡率。
图6显示德国蠊暴露于球孢白僵菌分离菌SP111的累积百分死亡率。
图7显示因真菌制剂而致的火蚁死亡率与用于市售捕集器的化学品的相比较。
图8显示取自捕集器的化学饵料与真菌制剂防治小家蚁的比较。
图9显示取自捕集器的化学饵料与真菌制剂防治家褐蚁之比较。
图10显示取自捕集器的化学饵料与真菌制剂防治木工蚁之比较。
图11显示大田农药与真菌制剂防治火蚁的比较。
本发明涉及真菌生物防治剂防治某些害虫的应用。本文具体例示的是球孢白僵菌分离菌No.477和SP111。球孢白僵菌Sp111是新颖的分离菌。本发明的另一方面包括高效率释放该生物防治剂于靶害虫的制剂。
球孢白僵菌No.477和球孢白僵菌Sp111的生物纯培养物已保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(12301 Parklawn Drive，Rockville，MD20852)。保藏信息和保藏号如下
培养物 保藏号 保藏日期球孢白僵菌No.447 ATCC 20872 1987年12月29日球孢白僵菌SP111ATCC 74308 1991年5月5日本发明培养物业已在本专利申请至由专利商标局长根据37CFR14和35U.S.C.122条款决定是否授权的未决期间可以得到此培养物的条件下保藏。当本申请的相应件或其后续申请呈交的国家的此国专利法有要求时，此保藏物也是可以得到的。然而，应当理解，此保藏物的可得性不构成许可剥夺政府授予的专利权而实施本发明。
此外，根据微生物保藏的布达佩斯条约的规定，即，微生物须悉心保藏，保持其存活并不受污染自最近一次请求提供保存样本起至少五年的时间，且无论任何情况下，保持其存活并不受污染自交存日起至少30年，或者在专利实施期间发放公开的培养物。本培养保藏物将根据上述规定保藏并使公众可得。由于保藏物的状态如果当有要求而保藏处不能提供样本，保藏者明白其有替换保藏物的责任。当一项公开它们的专利授权时，所有对公众可得到培养保藏物的限制将不可改变地被去除。
虫生真菌球孢白僵菌是半知菌亚门(Deuteromycotonia)中的一种半知菌(Fungi Imperfecti)。白僵菌属属于半知菌纲，该属与其它的属的不同点在于，该属的分生孢子单个产生而不是成链状产生，且分子孢子梗的能育部分呈之字形并在顶端伸出。球孢白僵菌具有球形而非椭圆形的分生孢子。为2-3μm×2-2.5μm，分子孢子梗形成密集的簇。
对于实施水平有效的防治蟑螂，木工蚁和小家蚁的生物防治剂而言，必要的是不但生物防治剂对这些害虫表现出致病性，而且还必须有致病力。致病力愈强，生物防治剂就愈好。虽然有一些真菌分离菌已显示出对这些害虫有一些致病性，但这些分离菌不具备作为生物防治剂功用的必要的致病力。还未有已知的方式将病原无致病力真菌分离菌转化成病原致病力分离菌。作用方式和致病力象许多虫生真菌一样，球孢白僵菌通过萌生的孢子(分生孢生)附着于昆虫寄主而进行初始感染，并随后穿透昆虫寄主的表皮。优越且出人意外的是，所要求保护的球孢白僵菌分离菌非常牢固地附着于蟑螂和蚂蚁的表皮，并一般不为昆虫的清洁行为所去除。这可能在某种程序上归功于该真菌的高致病力。当真菌穿透昆虫表皮时，入侵菌丝开始进入寄主的组织并成网状在整个血腔生长。菌丝或菌丝节分布于整个血腔，菌丝体充满待死的昆虫。突出体菌丝穿出昆虫体壁而生长出来并在该寄主的外表面产生孢子。这些孢子或分子孢子扩散并能够侵染新寄主昆虫。球孢白僵菌可以由害虫的活动在巢内扩散。制剂已发现本发明制剂对防治火蚁和其它害虫特别有效。在优选实施方案中，该制剂包含有真菌生物防治剂的干粉和食物组分。优选的是，该制剂还包含干燥剂。可选择地，该制剂也可以包含引诱剂。优选的制剂是非驱避性的且包括食物源，这样靶害虫会找寻并招集其它的同巢者进行找寻活动。再者，业已发现，本发明制剂优异地粘附于靶害虫的身体，因此有利于真菌生物防治剂在害虫中形成群落。粘附于害虫的能力使得本发明制剂明显区别于用于施用化学农药的其它制剂。
在一种实施方案中，本发明制剂由约25-40％的花生料、约45-60％的玉米淀粉、约2-20％的真菌生物防治剂、和约0-15％的干燥剂组成。在一具体实施方案中，制剂可以包含约35％的花生料、约50％玉米淀粉、约5％干燥剂和约10％的真菌。干燥剂可以是本领域熟练技术人员已知的许多材料之任何一种，这些干燥剂是小颗粒的，但具有很高的表面与体积比，这样它们可以有效地去除制剂中的水或油而成为干粉状。优选的是，干燥剂可以是硅藻土或合成硅的钙如Micro-Cel。
本制剂的花生组分优选由研磨烤过的花生而制备，这样可以得到粉状。为获取干粉，最好是将花生与玉米淀粉和/或干燥剂一起研磨。优选的是，制剂的组分是小颗粒并能通过60目筛。典型的是，玉米淀粉和干燥剂通过更小的筛，如300目。优选的是，制剂是可自由流动的粉未但不结成块。根据本发明，除了花生或玉米淀粉外的食物源也可以被采用。食物源的选择取决于具体的要防治的靶害虫。此外，各种本领域熟练技术人员已知的引诱剂也可采用。这些引诱剂可以是例如激素或各种提取物。
在优选实施方案中，真菌病原菌是球孢白僵菌No.477或球孢白僵菌SP111。然而，也可采用其它微生物作为其它的生物防治剂。例如，苏云金杆菌也可与本发明制剂一起使用。
为评价采用本发明的材料和方法获得的防治效果，作了一些试验以将获得的害虫防治效果与某些市售农药作比较。如下文所描述的，这些试验证实本发明的真菌制剂在防治害虫上是非常有效的。
下面是说明实施本发明过程包括最佳方式的实施例。所有的百分率是按重量计，且所有溶剂混合物比例是按体积计，除非另有指明。实施例1真菌的制备本发明真菌可以在装有稻米基培养基的盘中生产，一真菌种菌的分离菌用于起始在盘中的真菌生长。
原始种菌在培替氏培养皿中制备。然后将纯孢子转移入含有消毒无外皮白米的广口瓶中。
盘中的培养基如下制备1.将大米预煮10分钟。
2.将750克煮过的大米置于聚乙烯袋中并在120℃下高温消毒30分钟。
3.在层流通风橱中，将一汤匙取自种菌广口瓶的孢子和大米加入每袋制备消毒培养基中。
4.将各袋通过折叠并钉住而紧紧密封好。
5.将袋转移至正压、温度为25.0-27.0℃、相对湿度高于70％和16小时光照的消毒室中。该室被称作“环境室”。
在环境室中3天后，选出含有菌丝体的袋将其内含物转移至塑料盘。盘的大小为正好每盘可容纳2-3袋的内含物。将盘和其内含物留在环境室12-15天。在12-15天这段时间结束时，将盘转移至有冷却(10-20℃)干净气流的房间。将盘留于此室直至冷却空气已将大米和真菌混合物干燥。
可以收集和制备未污染盘的被真菌覆盖的大米用于施用或贮存。如果真菌在生产后1-2周内施用于蟑螂或蚂蚁，可以通过振荡和筛选采集分生孢子。所得的粉末含有孢子和一些菌丝体，且可以直接用于靶害虫或用来制备液体，粉状或饵料制剂。？ 如果欲贮藏真菌，可将混合物与玉米淀粉或滑石混合，并放置入紧紧密封的消毒塑料容器中，4℃下贮藏于冰箱或无直接日光照射的10-25℃温度范围的室内，球孢白僵菌的高致病力会受细菌或真菌污染而损害，因此，在制备真菌的整个过程中，必须十分小心以保持所有器械和设备的无菌性。
如下列实施例所证实的，含真菌的产品可以以液体、粉末施用于靶害虫和其巢穴，或以放饵料的捕集器放置，让害虫找寻并由此感污而携带种菌回到巢穴。实施例2喷雾施用可以采用喷雾处理个别的蚂蚁或蟑螂或一小群这些害虫。每毫升水含10×107至10×109孢子的真菌悬浮液，可以采用喷枪或其它施药器喷洒于靶害虫。实施例3粉剂施用真菌孢子和菌丝体混合物可以与玉米淀粉或滑石混合，并以干粉施于害虫的四周。
干粉的制备如上述实施例1。含有大米、孢子和菌丝体的筛分过的球孢白僵菌粉与玉米淀粉或滑石粉混合。将此粉末施于巢穴或直接施于害虫，可利于在巢穴内或害虫上迅速生长真菌并扩散之。
施用也可采用带用附件的压缩空气施药器来实现，将混合物分布入害虫栖生的建筑的裂缝和孔隙中。在施药期间和之后，观察到覆盖有白粉的害虫。这些被感染的害虫将在1-5天内死亡，并且它们产生的孢子含感染其它害虫。这将在1-3天显著降低害虫的活性，并会在施药后1-2周内出现死亡。活性孢子仍将留在巢穴位点的四周，因此提供感染其它蟑螂或蚂蚁的种菌。实施例4诱饵捕集器施用真菌粉末可以用于捕集器中，在该捕集器的入口搀上真菌种菌。优选采用真菌孢子。含在捕集器内的诱饵引诱剂会被蟑螂或蚂蚁找寻到，并且找寻者会被感染。这些感染个体会受污染地回到巢穴，因此将真菌病害引入巢穴。植物油或其它液体物质可以加到捕集器的诱饵中，以便它更吸引害虫。各种引诱剂，包括激素化合物，是本领域熟练技术人员熟知的，放诱饵的捕集器应放在柜橱中或沿踢脚板、窗槛等放置。各捕集器中应含有0.5-2.0克量的含孢子和菌丝的真菌混合物。在区域中使用捕集器的数量将取决于受害的范围。实施例5用球孢白僵菌No.447处理木工蚁将木工蚁(Camponotus folridanns)暴露于球孢白僵菌No.447。每个处理确保将两组各50只蚁暴露于分离菌的分生孢子。通过将木工蚁和孢子一起在盖好的容器中轻轻地摇晃，将蚁涂布上分生孢子/玉米淀粉混合物。对照处理只由玉米淀粉组成。随后将蚁拿到含有一巢室(100mm盖着的培替氏培养皿，底培养皿铺上四周用水润湿的石膏)和供食用的蜂密水的开口塑料盒中。
暴露之后第2天开始每天记录死亡率，记录18天。试验28天后结束。死蚁单个地拿到高湿度下，并检查孢子形成以确定感染率。
暴露于球孢白僵菌的木工蚁蒙受超过95％的死亡率(
图1)。至少49％的死蚁形成它们所暴露于的真菌的孢子形成体，表明这些分离菌可以在木工蚁上生长并再繁殖。实施例6用球孢白僵菌SP111处理木工蚁将木工蚁(Camponotus floridanus)暴露于球孢白僵菌SP111。每个处理确保将两组各50只蚁暴露于分离菌的分生孢子。通过将木工蚁和孢子一起在盖好的容器中轻轻摇晃，将蚁涂布上分生孢子/玉米淀粉的混合物。对照处理只由玉米淀粉组成。随后将蚁拿到含有一巢室(100mm盖着的培替氏培养皿，底培养皿铺上四周用水润湿的石膏)和供食用的蜂蜜水的开口塑料盒中。
暴露之后第2天开始，每天记录死亡率，记录18天。试验28天后结束。死蚁单个地拿到高湿条件下，并检查孢子形成，以确定感染率。
暴露于球孢白僵菌SP111的木工蚁蒙受超过75％的死亡率(图2)。至少49％的死蚁形成它们所暴露于的真菌的孢子形成体，表明这些分离菌可以在木工蚁上生长和产生孢子。实施例7用球孢白僵菌No.447处理小家蚁将小家蚁暴露于会有球孢白僵菌No.447分生孢子作为活性成分的混合物。在培替氏培养皿中将三个大致100-200只蚁的群落分别用此分生孢子喷粉，并让它们爬入一巢室中(15×40mm塑料培替氏培养皿，皿底铺上石膏，入口在盖上)。对照由三个不喷粉的群落组成。分别将蚁群落与巢室和蜂密水一起拿到更大的培替氏培养皿中。每日记录死亡率，记录25天。死蚁单个地表面消毒并拿到高湿下以计算感染率。
8天后暴露于球孢白僵菌No.447的小家蚁导致90％的死亡率(图3)。再者，所有的死虫被确认具有真菌孢子，表明真菌可以成功地在小家蚁口发育。实施例8用球孢白僵菌No.447处理蟑螂对于德国蠊(Blattella germanica)用球孢白僵菌No.447测试其分子孢子染染和杀死寄主的能力。在盖好的容器(8盎司)内，50只雄性蟑螂一组用CO2麻醉，然后用分生孢子喷粉。对照20只蟑螂一组。将喷过粉的蟑螂单个地转移入分别的含有润湿滤纸的培替氏培养皿(10×35mm)。从分生孢子施用的第2天起记录死亡率，此后每日作记录。死蟑螂单个地拿到湿度培养室中，放置10天，确定孢子形成真菌。
对于美洲蠊(Periplaneta americana)，通过涂刷分生孢子将球孢白僵菌No.447施到麻醉的蟑螂身上。然后将蟑螂拿到上述的26℃培替氏培养皿中。
用德国蠊的试验中，接触孢子后，球孢白僵菌No.447接触孢子后，真菌分离菌造成其100％死亡率(图4)。死蟑螂的82％明显有真菌孢子形成。对于暴露的美洲蠊，球孢白僵菌8天后造成90％或更大的死亡率(图5)。所有的死美洲蠊上均出现真菌孢子形成。实施例9用球孢白僵菌SP111处理蟑螂对于德国蠊(Blattella germanica)，用球孢白僵菌SP111测试其分生孢子感染和杀死寄主的能力。在盖好的容器(8盎司)内，将50只雄性蟑螂一组用分生孢子喷粉。对照组由一组20只蟑螂组成。暴露于分生孢子之后，将蟑螂用CO2麻醉，并单个地转移入分别的含有润湿滤纸的培替氏培养皿(10×35mm)。从分生孢子施用的第2天起记录死亡率。此后每日作纪录。死蟑螂单个地拿到湿度培养箱中，放置10天，确定孢子形成真菌。
用德国蠊的试验中，接触孢子后，球孢白僵菌SP111真菌分离菌造成其100％死亡率(图6)。死蟑螂的82％有真菌孢子形成。实施例10球孢白僵菌诱饵剂剂防治火蚁评价带有研磨花生料的诱饵剂提供给在塑料盒(20×12×10cm)中的火蚁群落，该塑料盒含有一小碟水和塑料培替氏培养皿(60mm直径)，作为巢室。群落在实验前2-4天建立，让火蚁适应其新环境。将制剂(0.5g)放在称重纸(1平方英寸)或小碟上，并将其留在盒中3-4天。采用两个对照，一个干净的对照，设有制剂，只有水；和诱饵对照，只供给诱饵制剂，而无任何真菌。处理后14天，观察到含有10％球孢白僵菌No.447的真菌分离菌的Abbott校正死亡率大于70％。实施例11取自捕集器的化学诱饵与真菌制剂防治火蚁之比较。
用作比较的化学诱饵取自MAX蚂蚁捕集器、RAID蚂蚁捕集器和COMBAT蚂蚁捕集器。将化学诱饵从捕集器取出并提供给纸上的蚂蚁。对照接受与真菌处理一样的制剂，但没有分生孢子。真菌制剂含有花生料和玉米淀粉和10％的球孢白僵菌No.447分生孢子。MAX和真菌制剂具有相同的死亡率，但如所预料的，MAX造成的死亡率增加的比真菌的要快许多，因为真菌需要3-4天来感染和杀死火蚁。如图7中所示的，COMBAT和RAID效果要差于MAX和球孢白僵菌。实施例12取自捕集器的化学诱饵与真菌制剂防治小家蚁之比较用作比较的化学诱饵取自MAX蚂蚁捕集器、RAID蚂蚁捕集器和COMBAT蚂蚁捕集器。化学诱饵从捕集器取出并提供给纸上的蚂蚁。对照接受与真菌处理一样的制剂，但没有分生孢子。真菌制剂含有花生料和玉米淀粉和10％球孢白僵菌No.447分生孢子。此实验的结果示于图8中。实施例13取自捕集器的化学诱饵与真菌制剂防治家褐蚁之比较用作比较的化学诱饵取自MAX蚂蚁捕集器、RAID蚂蚁捕集器和COMBAT蚂蚁捕集器。化学诱饵从捕集器取出并提供给纸上的蚂蚁。对照接受与真菌处理一样的制剂，但没有分生孢子。真菌制剂含有花生料和玉米淀粉和10％球孢白僵菌No.447分生孢子。在所有实验中，带有球孢白僵菌的诱饵造成的死亡率与化学诱饵的相同或比后者更大。结果参见图9。实施例14取自捕集器的化学诱饵真菌制剂防治木工蚁之比较用作比较的化学诱饵取自MAX蚂蚁捕集器，RAID蚂蚁捕集器和COMBAT蚂蚁捕集器。将化学诱饵从捕集器取出并提供给纸上的蚂蚁。对照接受与真菌处理一样的制剂，但没有分生孢子。真菌制剂含有花生料和玉米淀粉和10％球孢白僵菌No.447分生孢子。如可从
图10见到的，真菌制剂的实施效果与MAX和RAID诱饵相同或稍好，但稍逊于COMBAT。COMBAT和真菌的效果滞后于RAID和MAX，但真菌的效果滞后比COMBAT的更长。实施例15 大田农药与真菌制剂防治火蚁之比较对AMDRO化学诱饵作了评价。在一实验中，此诱饵还含有10％的乙酰甲胺磷火蚁粉状杀虫剂。在各处理中，称重纸上的每一场地提供半克制剂。4天后将制剂取走。对照接受与真菌处理相同的制剂，但不含分生孢子。真菌制剂含有花生料，玉米淀粉和10％球孢白僵菌No.447分生孢子。
乙酰甲胺磷(通常不是诱饵剂)几乎立刻杀死火蚁。使用AMDRO的死亡率增加的没那么迅速，但4天后，约80％的种群死亡。使用真菌的死亡率以较缓慢的速率增加，但2-4周后的最终死亡率与使用化学农药所获得的相同(
图11)。
应当理解，本文描述的实施例和实施方案只作说明性的目的，本领域熟练技术人员据此可提出各种修改或变化，且这些都将包括在本申请的精神和范围的及所附权利要求的范围内。
权利要求
1.一种防治蟑螂的方法，所述的方法包含将球孢白僵菌施到所述蟑螂上或其周围，其中所述的球孢白僵菌选自由具有ATCC 20872特征的球孢白僵菌No.447和具有ATCC 74038特征的球孢白僵菌SP111组成的物质组。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的球孢白僵菌是具有ATCC 20872特征的分离菌No.447。
3.根据权利要求1的方法，其中所述的球孢白僵菌是具有ATCC 74038特征的分离菌SP111。
4.一种防治木工蚁的方法，所述的方法包含将球孢白僵菌施到所述木工蚁上或其周围，其中所述的球孢白僵菌选自由具有ATCC 20872特征的球孢白僵菌No.447和具有ATCC 74038特征的球孢白僵菌SP111。
5.根据权利要求4的方法，其中所述的球孢白僵菌是具有ATCC 20872特征的分离菌No.447。
6.根据权利要求4的方法，其中所述的球孢白僵菌是具有ATCC 74038特征的分离菌SP111。
7.防治小家蚁的方法，所述的方法包含将球孢白僵菌施用所述的小家蚁或其周围，其中所述的球孢白僵菌是具有ATCC 20872特征的球孢白僵菌No.447。
8.一种施用杀虫真菌于靶害虫的捕集器，其中所述的捕集器包含杀虫量的球孢白僵菌，其中所述的球孢白僵菌是选自由具有ATCC 20872特征的球孢白僵菌No.447和具有ATCC 74038特征的球孢白僵菌SP111组成的物质组。
9.根据权利要求8的方法，其中所述的球孢白僵菌是具有ATCC 20872特征的分离菌No.447。
10.根据权利要求8的方法，其中所述的球孢白僵菌是具有ATCC 74038特征的分离菌SP111。
11.一种球孢白僵菌，当其基本上是生物纯形式时，对蟑螂和木工蚁具有致病力，具有球孢白僵菌SP111培养保藏物ATCC 74038及其突变体的特征。
12.一种防治蟑螂或蚂蚁的组合物，其中所述的组合物包含食物源和生物防治剂，其中所述的组合物是能够通过65目筛的干粉。
13.根据权利要求12的组合物，其中包含花生料，玉米淀粉和真菌生物防治剂。
14.根据权利要求13的组合物，其中所述的生物防治剂选自由具有ATCC 20872特征的球孢白僵菌No.447和具有ATCC 74038特征的球孢白僵菌SP111组成的物质组。
15.根据权利要求14的组合物，其中所述的球孢白僵菌是具有ATCC20872特征的分离菌No.447。
16.根据权利要求14的组合物，其中所述的球孢白僵菌是具有ATCC74038特征的分离菌SP111。
17.根据权利要求14的组合物，它还包含干燥剂。
18.根据权利要求14的组合物，它包含约30-40％的花生料、约45-55％的玉米淀粉、约10％的干燥剂和约10％的球孢白僵菌分离菌No.447。
全文摘要
本发明涉及新颖的生物农药及其防治蟑螂、木工蚁和小家蚁的应用。具体地说，涉及要以用来有效地防治上述害虫的高致病力球孢白僵菌分离菌的农用组合物，其范例是球孢白僵菌No.447，ATCC20872，和球孢白僵菌SP111，ATCC74038。本发明还描述了非常有效地释放生物防治剂于靶害虫的独特制剂。通过使用这些新颖的组合物，可以防治靶害虫，而无使用化学防治剂所带来的环境和公共安全危害。
文档编号A01N25/00GK1147754SQ95192183
公开日1997年4月16日 申请日期1995年3月21日 优先权日1994年3月21日
发明者杰丽·L·斯坦麦克, 罗伯托·珀艾尔 申请人:佛罗里达大学