柿树组织培养培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及组织培养基，尤其涉及一种柿树组织培养培养基。
【背景技术】
[0002] 柿子是柿树科浆果类温带落叶果树，原产我国，在我国已有一千多年的种植历史。 目前我国种植面积最大，而且柿果产量最多。柿子柔嫩多汁、甘甜爽口、营养丰富。有甜柿 和涩柿两种，涩柿不可直接食用，需要经过脱涩处理，甜柿可以鲜食。柿子的营养成分十分 丰富，含有丰富的蔗糖、葡萄糖、果糖、蛋白质、胡萝卜素、维生素C、瓜氨酸、碘、钙、磷、铁。 新鲜柿子含碘很高，能够防治地方性甲状腺肿大。柿子性味性寒，味甘涩，归经肺经，有润 肺生津，清热止血，涩肠健脾，解酒降压等功效。柿子含有大量的单宁。单宁又叫鞣酸，是 一种多酚的聚合物，是一种由儿茶酚等聚合而成多酚聚合物，含有许多邻位的酚羟基，因而 有许多功能。Seguin于1796年定义了一个专门术语Tannin (单宁）来表示植物水浸提物 中能使生皮转化为革的化学成分。后来通过研宄逐渐认识到，植物浸提物中能产生鞣制作 用的是一系列多酷类化合物，其有效成分的分子量在500-3000之间。单宁又称親酸，淡黄 色至浅棕色无晶粉末，属于多元苯酚的复杂化合物。将植物单宁又改称为植物多酚（plant polyphonies)，即存在于柿果使其呈湿味的酷类物质称为柿单宁（kaki tannin)。柿单宁具 有防晒保湿、抗皱美容、防腐杀菌、预防心血管疾病、吸附金属离子以及和蛋白质相互作用 等诸多功能。
[0003] 目前柿树繁殖育苗主要采用以下几种方法：（1)分株繁殖：3-4月挖取母株支根上 萌发的幼株进行移植，此时幼株叶片尚未展开，但长有须根，挖取时要保证幼株有约l〇cm 长的支根和较完整的须根；（2)分根繁殖：春季气温回升时，在支根上出现许多突起的白色 不定芽，把这种支根挖出，按长l〇-15cm切成根段，斜插或平埋于沙床中，淋水保湿，半个月 后根段即可长成幼株；（3)种子繁殖：果实成熟呈橙红色或红色时采收，取出种子用沙覆盖 保存，或播入苗床，行距20cm，株距5-7cm，播后除草。种子长出2片叶后，移入营养袋育苗， 营养土用腐熟的农家肥与泥土、草皮灰混合而成，苗期淋水和施浓度稍淡的肥料；(4)无性 繁殖：主要是用长穗一茎带两节间一叶长约8-lOcm，土壤选用石灰消毒，再铺心土、用生根 剂浸泡的育苗方法。
[0004] 目前采用繁殖育苗方法有一定的效果，但是成活率等不稳定，这就大大制约了柿 树的繁殖，成为加快开发利用柿子的瓶颈。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种柿树组织培养培养基，该培养基 包括继代培养基和生根培养基，其中：
[0006] 每升（L)继代培养基的组分及各组分的含量如下：
[0007] (1)大量元素：硝酸钾1260mg/L、硝酸铵1320mg/L、二水氯化钙440mg/L、七水硫酸 镁370mg/L、磷酸二氢钾170mg/L、七水硫酸亚铁27. 8mg/L、乙二胺四乙酸二钠37. 3mg/L ;
[0008] (2)微量元素：四水硫酸锰22. 3mg/L、七水硫酸锌8. 6mg/L、硼酸6. 2mg/L、二水钼 酸钠0? 25mg/L、碘化钾0? 83mg/L、五水硫酸铜0? 025mg/L、六水氯化钴0? 025mg/L;
[0009] (3)有机物：肌醇l〇〇mg/L、甘氨酸2. Omg/L、盐酸吡哆醇（VB6) 0? 5mg/L、烟酸 0? 5mg/L、盐酸硫胺素（VBjO. lmg/L、半胱氨酸15mg/L ;
[0010] (4)植物生长调节剂：6_苄基腺嘌呤0? 3-1. Omg/L、萘乙酸0? l-o. 2mg/L、荔枝汁 0. 3-〇. 5mg/L ；
[0011] 余量为蒸馏水；
[0012] 每升（L)生根培养基的组分及各组分的含量如下：
[0013] (1)大量元素：硝酸钾475mg/L、硝酸铵412. 5mg/L、二水氯化钙110mg/L、七水硫 酸镁92. 5mg/L、磷酸二氢钾42. 5mg/L、乙二胺四乙酸二钠37. 3mg/L、七水硫酸亚铁27. 8mg/ L ；
[0014] (2)微量元素：四水硫酸锰22. 3mg/L、七水硫酸锌8. 6mg/L、硼酸6. 2mg/L、二水钼 酸钠0? 25mg/L、碘化钾0? 83mg/L、五水硫酸铜0? 025mg/L、六水氯化钴0? 025mg/L;
[0015] (3)有机物：肌醇100mg/L、甘氨酸2. 0mg/L、盐酸吡哆醇（VB6) 0? 5mg/L、烟酸 0? 5mg/L、盐酸硫胺素（VBjO. lmg/ ;
[0016] (4)植物生长调节剂：ABT6号0? 4-0. 6mg/L、吲哚乙酸0? 1-0. 3mg/L、荔枝汁 0. 3-〇. 5mg/L ；
[0017] 余量为蒸馏水。
[0018] 本发明所述荔枝汁为新鲜荔枝去除枝叶、病虫果、烂果、腐果、未成熟果，清洗、去 除果皮果核，果肉压榨，得到的果汁，灭菌得到。
[0019] 本发明柿树组织培养基中的继代、生根培养基的配制方法为：
[0020] 1母液的配制与保存
[0021] 1. 1为便于取样，宜先配制各种母液，分为大量元素母液、微量元素母液、有机物母 液和各种植物生长调节剂母液。蔗糖、琼脂不宜配成母液，需要时直接称样；
[0022] 1. 2大量元素母液浓度成100倍溶液，有机物、微量元素母液配成200倍溶液，植物 生长调节试剂母液的浓度配成lmg/ml;
[0023] 1. 3母液选用无菌的蒸馏水、去离子水或超纯水配制，大量生产时用煮沸过的水；
[0024] 1.4配制大量元素母液时，每个组分应单独溶解，后按氮、钙、镁、磷的顺序逐个混 合，否则容易引起沉淀；
[0025] 1. 5微量元素、有机物、植物生长调节剂母液应用棕色瓶装好并置于冰箱中保存；
[0026] 1. 6母液配制后应及时使用，贮存时间不宜超过1个月；
[0027] 1. 7发现母液有沉淀，或有微生物生长，或有藻类生长，应废弃不用。
[0028] 2培养基的配制
[0029] 2. 1依照培养基配方，按比例量取各种母液；
[0030] 2. 2在定量容器内放入准备配制培养基总量的约1/2以上的纯净水，并加入适量 的糖，然后边搅拌边逐一加入所需量的母液；
[0031] 2. 3琼脂可加热熔化后加入，如有搅拌设备时也可直接加入琼脂粉，然后用纯净水 补足所需配制培养基的总量，搅拌均匀即可；
[0032] 2. 4培养基中的糖，在大量组培苗生产中，一般可用市售白糖，但最好是用蔗糖而 不要用甜菜糖；
[0033] 2. 5用1.0摩尔/升的盐酸或1.0摩尔/升的氢氧化钠调节培养基的pH值至5.8 ;
[0034] 2. 6配制好的培养基要尽快分装到培养容器中，以免培养基凝固或变稠而难以分 装；
[0035] 2. 7分装培养基时应注意避免培养基粘在瓶口上，如果粘有培养基，在盖瓶盖或瓶 塞前必须用干净纱布擦净瓶口。
[0036] 3培养基消毒灭菌
[0037] 3. 1将分装好的培养基装于高压灭菌锅内消毒；
[0038] 3. 2加热初期，当消毒锅消毒室的气压达0. 05Mpa时，打开冷凝阀，排尽消毒室内 冷空气；
[0039] 3. 3当消毒室内气压达到0.llMpa、温度达121°C时，开始计时，保持温度与压力消 毒15_20分钟；
[0040] 3. 4关闭加热电源开关，按慢排气方式排放热气，待消毒室内的气压降至大气压时 打开消毒锅盖或门，取出培养基；
[0041] 3. 5培养基应置于空气少流动和少灰尘的干净环境冷却，否则在降温进气过程中 导致霉菌孢子进入培养器皿，产生霉菌污染。
[0042] 4培养基储藏
[0043] 4. 1培养基应尽量现配现用；
[0044] 4. 2可在空气干净且不流动的环境短时间储藏培养基，但储藏超过1个月的培养 基应废弃不用。
[0045] 本发明柿树组织培养的方法为：
[0046]1.无菌芽的获取
[0047] 柿树果实为肉质果，7-8月份成熟，当果实由青色转为黄色带红，果肉变软时采摘， 将果实揉搓，用清水洗净后得种子，并将其及时置于阴凉处晾干，剥去外壳。在超净台上用 75%酒精浸泡消毒10s，无菌水漂洗2-3次，再用0. 1 %升汞溶液消毒15min，无菌水漂洗5 次。将经消毒处理的种子接种在诱导培养基上进行初始培养，诱导种子发芽以获取无菌材 料。外植体初次培养时，需全暗培养10天左右，再放到弱光下进行培养，大约经过20天左 右的种子开始萌芽，然后再移至见光的地方培养。
[0048]2.芽的增殖培养
[0049] 将诱导获得的无菌芽接种至继代培养基上进行芽的继代增殖，一般40天继代 一次，继代材料均放在培养室内培养，培养室温度为（25±2) °C，光照12h. cf1，光照度 20001x〇
[0050] 3?生根的诱导
[0051] 芽条长至约2-3cm时，将较健壮的芽苗由丛生芽上单个切下转至生根培养基上诱 导生根，其余芽苗转至继代培养基上继续进行增殖培养。生根培养需要在弱光下培养15天 左右，此时小苗的基部形成白色突起，并逐渐伸长，20天后可形成明显根系，逐渐长成完整 的小植株，此时期宜逐步增加光照使小苗变得粗壮。
[0052] 4.生根苗的移栽
[0053] 待生根小苗充分木质化，叶片舒展，叶色浓绿，莖轴伸长，苗高约3_4cm时即可进 行大棚移栽。移栽时先取出小苗，洗净基部的培养基后，移栽于经0. 1%高锰酸钾消毒过用 营养袋装好的育苗基质上，移栽后浇透定根水，保持一定的温度和湿度，并要定期进行喷药 进行防病处理。
[0054] 与目前现有技术相比，本发明的优点是：
[0055] 1、增殖和生根培养通过添加合适量的荔枝汁，能促进甜茶