一种通过浸泡法诱导无籽刺梨四倍体产生的方法
【专利摘要】本发明公开了一种通过浸泡法诱导无籽刺梨四倍体产生的方法，包括如下步骤：步骤一：材料准备,无菌苗茎段去除叶片和顶端，截成0.8?3cm长，每段至少保留一个叶腋；步骤二：预培养：培养基MS+0.5mg/L 6?BA中预培养，2?3d；步骤三：避光震荡：将预处理后的材料，浸泡于含200?500mg/L秋水仙素的无菌水中，于摇床上以120r/min，25?30℃避光震荡，处理时间分别12?72h；步骤四：光照培养：材料经浸泡处理后，转入未附加秋水仙素的MS+ 0.15mg/L NAA+ 0.5mg/L 6?BA培养基中继续培养；步骤五：变异芽的同质化处理：上述培养40d后，选培养得到的变异明显的芽苗，在培养基MS+ 0.15mg/L NAA+ 0.5mg/L 6?BA中，间隔40d反复培养5次。本发明的诱导方法,获得了四倍体无籽刺梨新种质，可增加无籽刺梨果实营养成分如Vc、VE和SOD等，同时使其果径和可食用部分增多。
【专利说明】
一种通过浸泡法诱导无籽刺梨四倍体产生的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及浸泡法使无籽刺梨四倍体产生的诱导方法技术领域，特别是涉及一种 通过浸泡法诱导无籽刺梨四倍体产生的方法。
【背景技术】
[0002] 无籽刺梨(RosasterilisS.D. Shi)是蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa)的多年生攀 援小灌木。为中国特有种之一，是刺梨(R.roxbunghii)的近缘种。其野生资源主要分布在贵 州安顺市北部和贵阳市南部，近年来多地大量进行引种种植。无籽刺梨具有较高的药用保 健、观光、生态保护和经济价值。与普通刺梨相比，无籽刺梨单果无籽或有1-2粒籽，单宁含 量较少，糖含量更高，肉厚且果味香甜，无明显涩味，鲜果售卖更有优势。其无籽或瘦籽的特 性，可以减少加工成本。但是，无籽刺梨果实营养成分如Vc、VE和S0D含量比刺梨少，果径比 刺梨小，可食用部分也较少。这在一定程度上大大影响了这一特色植物的生产利用价值。因 此，利用现代生物技术选育果实大，营养成分含量高的无籽刺梨，成为其产业开发，提高无 籽刺梨经济价值的当务之急。而在诸多的植物育种手段中，倍性育种所选育的多倍体品种 能显著增加果实体积及营养成分含量。所以，对无籽刺梨进行多倍体育种，选育较高倍性的 无籽刺梨，无疑是解决上述问题的有效方法之一。无籽刺梨品种改良，仅见韦景楓等对其进 行了单株选优方面的研究，而在倍性育种方面未见报道。本发明以无籽刺梨幼嫩茎段为材 料，利用"浸泡法"进行无籽刺梨四体的诱导，并对变异材料的倍性进行鉴定。该发明技术， 可为无籽刺梨，乃至林木多倍体育种提供理论参考及实践指导。
【发明内容】
[0003] 为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种浸泡法诱导无籽刺梨四倍体产 生的方法，对无籽刺梨进行多倍体育种，选育四倍体无籽刺梨，可增加了无籽刺梨果实营养 成分如Vc、VE和S0D等，同时增加了其果径和可食用部分。
[0004] 本发明所采用的技术方案是：一种通过浸泡法使无籽刺梨四倍体产生的诱导方 法，包括如下步骤：
[0005] 步骤一:材料准备，无菌苗茎段去除叶片和顶端，截成0.8-3cm长，每段至少保留一 个叶腋；
[0006] 步骤二:预培养:培养基MS+0.5mg/L 6-BA中预培养，l-3d;
[0007] 步骤三:避光震荡：茎段转入分别含有200-500mg//L秋水仙素的无菌水中，置于摇 床上以120r/min，25-30 °C避光震荡，处理时间分别12-72h;
[0008] 步骤四：光照培养:转入MS+0.15mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA未附加秋水仙素的培养 基中继续培养；
[0009] 步骤五:变异芽的同质化处理:上述培养40d后，选培养得到的变明显的芽苗，在培 养基MS+0.15mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA中，间隔40d反复培养5次；
[0010] 其中避光震荡结束后，需将茎段在超净工作台上，用无菌过滤纸吸尽表面残留液 体，再进行步骤四。
[0011]进一步地，步骤二预培养Id后，再在400mg/L秋水仙素培养基中浸泡并避光震荡 Mlo
[0012] 进一步地，步骤二预培养3d后，再在300mg/L秋水仙素培养基中浸泡12h。
[0013] 进一步地，倍性鉴定:步骤五完成后，当同质化处理的芽长至2-3cm时，将变异明显 的无籽刺梨芽苗转入1/2MS+0. lmg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+0.3g/L活性炭的培养基中生根； 待根长lcm时，截取根尖材料，利用常规制片法进行染色体计数，确定其倍性。
[0014] 进一步地，步骤一中材料准备，无菌苗茎段去除叶片和顶端，截成lcm长，每段至少 保留一个叶腋。
[0015] 与现有技术相比，本发明的有益效果是:将经过秋水仙素处理的单株苗转至未附 加秋水仙素的培养基中培养一段时间后，与对照相比，大部分表现出叶片浓绿且明显增厚， 茎杆变粗等现象，表现为多倍化材料相对于二倍体材料在生长方面的优势。本发明的诱导 方法，对无籽刺梨进行多倍体育种，选育四倍体的无籽刺梨，可增加了无籽刺梨果实营养 成分如Vc、VE和S0D等，同时增加了果径和可食用部分。
【附图说明】
[0016] 图1为一种通过浸泡法使无籽刺梨四倍体产生的诱导方法的诱导过程的流程图；
[0017] 图2为一种通过混培法使无籽刺梨四倍体产生的诱导方法的诱导过程的流程图。
【具体实施方式】
[0018] 为了加深对本发明的理解，下面结合实施例对本发明进一步说明，该实施例仅用 于解释本发明，并不对本发明的保护范围构成限定。
[0019] 实施例选用某大学生物多样性保育重点实验室所建立的无籽刺梨无菌苗进行多 倍体的诱导试验以及倍性鉴定
[0020] 1材料与方法
[0021] 1.1试验材料
[0022]试验材料选用西南林业大学生物多样性保育重点实验室所建立的无籽刺梨无菌 苗。
[0023] 1.2试验方法
[0024] 1.2.1浸泡法，如图1所示。
[0025]将无菌苗茎段去除叶片和顶端，截成lcm长左右，每段至少保留一个叶腋，转入培 养基MS+0.5mg/L 6-BA中预培养，预培养时间分别为1、2和3d。预培养结束后进行光照培养。 光培养期间，先将预培养后的茎段分别浸泡于含不同浓度秋水仙素(200、300、400、500mg/ L)的无菌水中，并置于摇床上以120r/min，25-30 °C避光震荡，处理时间分别12、24、48和 72h。对照组的茎段置于无菌水中避光震荡培养处理12、24、48和72h，方法同上。处理完毕 后，将茎段在超净工作台上，用无菌过滤纸吸尽表面残留液体，再转入MS+0.15mg/L NAA+ 0.5mg/L 6-BA(未附加秋水仙素）的培养基中继续培养。上述处理共计52组，每组处理接种 20瓶，每瓶接种茎段5枚，重复3次。
[0026] 1.2.2混培法，如图2所示。
[0027] 将无菌苗茎段去除叶片和顶端，截成lcm长左右，每段至少保留一个叶腋，在培养 基MS+0.5mg/L 6-BA中预培养0、1、2、3d。预培养后的茎段转入分别附加有0、50、100、150、 200mg/L秋水仙素的MS+0.5mg/L 6-BA+培养基中，茎段略浸没于培养基，使腋芽与培养基充 分接触。7d后，转未附加秋水仙素的MS+0.5mg/L 6-BA培养基中继续培养。对照组设1组，接 种于腋芽诱导培养基中。上述处理共计13个，每组处理接种20瓶，每瓶接种茎段5枚，重复3 次。1.2.3变异芽的同质化处理
[0028] 40d后，选上述1 · 2 · 1和1 · 2 · 2中变明显的芽苗，在培养基MS+0 · 15mg/L ΝΑΑ+0 · 5mg/ L 6-BA中，间隔40d反复培养5次。
[0029] 1.2.4倍性鉴定
[0030] 当同质化处理的芽长至2-3cm时，与对照组比较，将变异明显的无籽刺梨芽苗转入 l/2MS+0.1mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+0.3g/L活性炭的培养基中生根。并采用林源等提出的 方，对变异的无籽刺梨组培苗及二倍体材料根尖染色体数目进行计数，以确定其倍性。
[0031] 2.结果与分析
[0032] 2.1浸渍法
[0033]预培养时间、秋水仙素浓度和处理时间对无籽刺梨多倍体的产生有明显的影响 (表 2)。
[0034]
[0035]
[0036]
[0037] 表1秋水仙素浓度与处理时间对茎段诱导多倍体的影响
[0038]由表1可知，不同处理下，无籽刺梨的诱变率差异显著。总体上，在相同预处理时间 下，随着处理浓度的增加，相同处理天数内，诱变率有上升趋势；而在相同预处理时间和相 同浓度处理但26号处理，即：预培养Id后，再在400mg/L秋水仙素溶液中浸泡24h，其平均诱 变率最高（为30.0 % )，其次为预培养3d后，用300mg/L秋水仙素处理12h，其诱变为26.7 % (21号处理）。所有对照中，均未出现变异材料。多重比较结果显示，21号处理与26号处理间 差异不显著。因此，21号与26号处理均适合于茎段浸泡法诱导无籽刺梨多倍体不定芽的产 生。但是，从试剂的用量等方面考虑，应以21号处理为优，也即：预培养3d后，用300mg/L秋 水仙素处理12h，为无籽刺梨浸泡法处理诱导多倍体产生的较佳诱导方案。
[0039] 2.2混培法，如图1所示。
[0040] 利用混培法，对茎段进行不同处理后，其诱变效果列于表2。
[0041]
[0042] 表2秋水仙素浓度与处理时间对茎段诱导多倍体的影响
[0043]由表2可知，混培法诱导茎段的方法诱变率普遍较低，方差分析表明，不同的处理 间，存在显著差异。不进行任何处理的对照组，其诱变率为〇.〇%，随着处理浓度的增加，诱 变率显著下降。当预培养Id可不进行预培养时，接种于附加有100mg/L秋水仙素的培养基中 的材料，诱变率较高，分别为5.8%和5.6% (处理1和2)。且这2个处理间差异不显著。这说 明，在附加l〇〇mg/L秋水仙素的处理中，预处理的有无，对诱变效果影响并不大。考虑实验的 简便性认为，不进行预处理，而直接将茎段接入附加l〇〇mg/L秋水仙素的培养基中，为利用 混培法诱导无籽刺梨多倍体产生的较理想方法。
[0044] 2.3倍性鉴定
[0045] 经5次同质化处理后，对无籽刺梨生根组培苗的根尖染色体数目进行观察。结果表 明，无籽刺梨二倍体染色体数目是2n = 2x = 14。变异植株中，部分材料其根尖染色体数目均 为28条，可判定为四倍体;而部分材料中，既有14条染色体细胞，又有28条染色体细胞，可断 定为嵌合体。实验中未发现有三倍体细胞的产生。
[0046] 本发明的实施例公布的是较佳的实施例，但并不局限于此，本领域的普通技术人 员，极易根据上述实施例，领会本发明的精神，并做出不同的引申和变化，但只要不脱离本 发明的精神，都在本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 一种通过浸泡法诱导无籽刺梨四倍体产生的方法，其特征在于，包括如下步骤： 步骤一:材料准备，无菌苗茎段去除叶片和顶端，截成〇.8-3cm长，每段至少保留一个叶 腋； 步骤二:预培养:培养基MS+0.5mg/L 6-BA中预培养，l-3d; 步骤三:避光震荡：将预处理后的材料，浸泡含200-500mg/L秋水仙素的无菌水中，于摇 床上以120r/min，25-30 °C避光震荡，处理时间分别12-72h; 步骤四：光照培养：材料经浸泡处理后，转入未附加秋水仙素的MS+ 0.15mg/L NAA+ 0.5mg/L 6-BA培养基中继续培养； 步骤五:变异芽的同质化处理:上述培养40d后，选培养得到的变明显的芽苗，在培养基 MS+ 0.15mg/L NAA+ 0.5mg/L 6-BA中，间隔40d反复培养5次； 其中避光震荡结束后，需将茎段在超净工作台上，用无菌过滤纸吸尽表面残留液体，再 进行步骤四。2. 根据权利要求1所述的一种通过浸泡法诱导无籽刺梨四倍体产生的方法，其特征在 于，步骤二预培养Id后，再在400mg/L秋水仙素培养基中浸泡并避光震荡24h。3. 根据权利要求1所述的一种通过浸泡法诱导无籽刺梨四倍体产生的方法，其特征在 于，步骤二预培养3d后，再在300mg/L秋水仙素培养基中浸泡12h。4. 根据权利要求2所述的一种通过浸泡法使无籽刺梨四倍体产生的诱导方法，其特征 在于，倍性鉴定:步骤五完成后，当同质化处理的芽长至2-3cm时，将变异明显的无籽刺梨芽 苗转入1/2MS +0.1mg/L 6-BA+0.2mg/L IBA+0.3g/L活性炭的培养基中生根;待根长lcm时， 截取根尖材料，利用常规制片法进行染色体计数，确定其倍性。5. 根据权利要求1所述的一种通过浸泡法使无籽刺梨四倍体产生的诱导方法，其特征 在于，所述步骤一中材料准备，无菌苗茎段去除叶片和顶端，截成lcm长，每段至少保留一个 叶腋。
【文档编号】A01H1/08GK106035076SQ201610440273
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年6月20日
【发明人】辛培尧, 辛亚龙, 林 源, 唐军荣, 李斌, 何承忠, 韩国伟
【申请人】西南林业大学