专利名称：细胞核糖核酸孚儿根染色方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞核糖核酸孚儿根(DNA-Feulgen)染色方法，特别是涉及一种改良了的细胞核糖核酸孚儿根染色方法。
应用扫描显微分光光度计和流式分光光度计及荧光光度术，通过孚儿根(Feulgen)染色反应，是目前精确测定细胞DNA特异性吸收光谱物质含量最为有力的手段之一。在测定DNA含量之前，Feulgen染色反应的好坏是极其重要的，要求其染色反应一定要与所检查物质含量之间具有恒定的比例关系。目前，此项技术已在细胞学、肿瘤生物学、药理学、免疫学以及临床上广泛应用。
传统的细胞核糖核酸孚儿根(DNA-Feulgen)染色方法是把样品(组织切片或细胞涂片)按以下的步骤操作的①入冷的1NHCL片刻(2-10秒钟)；②入60℃的1NHCL中8-10分钟；③入冷的1NHCL片刻，取出用蒸馏水洗数次；④入Schiff试剂(染液)内作用0.5-1小时(室温)；⑤样品在亚硫酸中通过3次，每次1分钟；⑥自来水冲洗，未冲前样品呈淡红色，冲洗后颜色可以加深；⑦脱水，用二甲苯透明处理，用树胶封固处理。结果，因脱氧核糖核酸主要存在于核的染色体内，细胞核呈紫红色。由于传统的染色方法是把样品直接从60℃的高温盐酸中直接放入冷的低温盐酸中，这就造成从冷HCL溶液中取出水洗时，样品经常脱片的现象，至使经常反复切片重染，造成浪费和误事。另外，由于传统的染色时间短，洗涤时间短，造成组织标本淡染，洗涤时间不充分，标本易留杂色，标本保留时间不长，易褪色等现象。
本发明的目的在于提供一种改良的细胞核糖核酸孚儿根染色方法，以改善染色效果，在DNA检测中获得更好更稳定的测量效果。
本发明的技术方案在于采用了一种细胞核糖核酸孚儿根染色方法，该染色方法依次包括如下步骤(A)样品在10％甲醛液中固定1-2小时，然后挥发干；(B)蒸馏水水洗1-2分钟；(C)放入1NHCL中2-10秒钟；(D)放入5NHCL中室温30-40分钟；(E)放入1NHCL中2-10秒钟；
(F)放入Schiff试剂染液，室温1.5-2小时；(G)用SO2溶液洗3次，每次5-15分钟；(H)脱水、透明、封固处理。
所述的10％甲醛为PH7.0的中性甲醛液。
本发明的染色方法采用5NHCL溶液对样品水解，能最大限度地与碱性品红(Pararosaniline)结合，在SO2的酸性溶液中形成无色的Schiff染液，定位于组织，且结合牢固。采用5NHCL水解，还解决了传统方法的从1NHCL60℃高温中直接放入低温1NHCL至水中冲洗数次时的易脱片现象，减少了反复切片复染，又可以使脱氧核糖的醛基充分游离，具有特异性地与染料结合，获得更好的稳定性测量结果。本发明改把样品放入Schiff试剂内作用室温0.5-1小时为室温2小时，使醛基与碱性品红充分接触，染色更深，以便于在SO2溶液中充分水洗而不褪色，同时也洗去组织标本上的杂色成分，在显微镜下观察更清晰、洁净，不影响DNA的光谱测量结果，更重要的是，作用时间长可以使结合更充分，使组织标本保留时间更长、不褪色，易重复性检测，解决了科研工作中的回顾性研究。本发明的水洗过程改用SO2洗3次，每次1分钟为水洗3次，每次10分钟，能够充分洗去标本中的杂质部分，使标本更干净、清晰、透亮，解决了DNA测量时标本中的杂质污染问题，更精确了DNA的纯度含量。
下面结合实施例对本发明做进一步的解释和说明实施例1(1)细胞涂片(注意涂片细胞标片应均匀)；(2)样品在10％中性甲醛(PH7.0)液中固定0.5小时，然后挥发干；(3)蒸馏水水洗2分钟；(4)入1NHCL5秒钟；(5)入5NHCL中，室温40分钟；(6)入1NHCL中10秒钟；(7)放入Schiff试剂中室温1.5小时；(8)在SO2溶液中洗3次，每次5分钟；(9)脱水、透明、封固处理即可得到干净、清晰、透明、稳定、染色持久、深度适宜的细胞涂片标本。
实施例2(1)组织切片脱蜡入水处理；(2)样品在10％中性甲醛(PH7.0)液中固定1小时，然后挥发干；
(3)蒸馏水水洗1分钟；(4)放入1NHCL中3秒钟；(5)放入5NHCL中室温30分钟；(6)放入1NHCL中6秒钟；(7)放入Schiff染液中室温2小时；(8)用SO2溶液洗3次，每次10分钟；(9)脱水、透明、封固处理即可得到干净、清晰、透明、稳定、染色持久适宜的组织切片标本。
本发明中，Schiff染液的配制可依以下步骤进行利用一小气体发生器，加入20g偏重亚硫酸钠(钾)，通过分液漏斗，徐徐滴入硫酸或盐酸，于是瓶内持续发生SO2气体，引出通过一蒸馏水洗瓶后，直接通入碱性品红的水溶液内(取1g碱性品红加入200ml沸水中，溶解后冷却至室温)，一般半小时左右，碱性品红被脱色形成无色品红。此时，溶液中仍含有杂质而呈棕黄色，再加入2g活性炭，将杂质吸附过滤后即得无色透明的Schiff试剂染液。
权利要求
1.一种细胞核糖核酸孚儿根染色方法，其特征在于该染色方法依次包括如下步骤(A)样品在10％甲醛液中固定1-2小时，然后挥发干；(B)蒸馏水水洗1-2分钟；(C)放入1NHCL中2-10秒钟；(D)放入5NHCL中室温30-40分钟；(E)放入1NHCL中2-10秒钟；(F)放入Schiff试剂染液，室温1.5-2小时；(G)用SO2溶液洗3次，每次5-15分钟；(H)脱水、透明、封固处理。
2.根据权利要求1所述的染色方法，其特征在于所述的10％甲醛为PH7.0的中性甲醛液。
全文摘要
本发明涉及一种细胞核糖核酸孚儿根染色方法,该方法包括以下步骤:(A)样品在10%中性甲醛液中固定1－2小时,然后挥发干;(B)蒸馏水水洗1－2分钟;(C)放入1NHCl中2－10秒钟;(D)放入5NHCl中室温30－40分钟;(E)放入1NHCl中2－10秒种;(F)放入Schiff试剂染液,室温1.5－2小时;(G)用SO
文档编号C12Q1/00GK1304033SQ00100100
公开日2001年7月18日 申请日期2000年1月10日 优先权日2000年1月10日
发明者程爱明, 李金陵, 楚广民, 刘华 申请人:程爱明, 李金陵, 楚广民, 刘华