遗传修饰的编码雪花莲凝集素的dna序列及抗蚜转基因植物的制作方法

专利名称：遗传修饰的编码雪花莲凝集素的dna序列及抗蚜转基因植物的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体的说，本发明涉及遗传修饰的编码植物凝集素GNA前体蛋白的DNA序列，包含所说的DNA序列与组织特异性启动子的融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体，以及由所说的表达载体转化植物外植体所产生的具有显著抑制同翅目害虫的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织。
植物凝集素(lectin)是一种蛋白或糖蛋白，具有一个或多个能结合特定糖基的位点。Peumans和Van Damme(Plant Physiology.109347-～352.1995)将凝集素(lectin)定义为含有至少一个非催化结构域并能可逆结合特异单糖或寡糖的蛋白质的总称。此外，“Agglutinin”作为lectin的同义词，是指能通过特异性结合细胞表面的糖类物质而使细胞凝集的所有蛋白质。Lectin广泛存在于各种植物中，虽然在分子结构和结合性质方面有很大差异，但根据其糖结合性质大体上可分为三类①植物血凝素类，可凝集哺乳动物的血红细胞，如菜豆PHA，菜豆素(arcdin)等；②结合几丁质的lectin，如麦胚凝集素(WGA)等来源于禾本科的lectin；③结合甘露糖的lectin，如来自石蒜科、葱科和天南星科的lectin。
雪花莲凝集素(Galanthus nivalis Agglutinin，以下简称GNA)基因来自石蒜科的雪花莲植物。Van Damme等人(Planta Vol 18635～43.1991European Journal of Biochemistry Vol 20223～30.1991)发现GNA是由多基因家族编码的，基因内没有内含子，它具有较好的抗虫效果，对具有刺吸式口器的害虫如蚜虫、稻飞虱和叶蝉等具有较好抗性，对咀嚼式害虫也具有中等抗性。此外，由于GNA专一识别并结合α-1，3和α-1，6甘露糖，而人和绝大多数动物细胞表面甘露糖残基很少，所以对人畜几乎无害，是目前所知的最适于转基因植物研究的植物凝集素之一。GNA为同源四聚体，由四个相同的亚基以非共价键结合而成，不含糖基。其中每个亚基由105个氨基酸组成，分子量为12.5KD(Annick Barre和VanDamme等，Plant Physiology，1121511～1540，1996)。在植物体内，GNA基因的cDNA首先编码一个前体蛋白原，包括5’-信号肽、成熟GNA和3’-末端多肽。5’-信号肽和3’-末端多肽分别在翻译的同时和翻译之后被加工除去，形成一个由105个氨基酸残基组成的成熟蛋白单体。每个单体含有3个相同的由四个氨基酸残基组成的甘露糖结合位点。四个GNA单体相当于四条β折叠片(亚结构域)，它们通过Ω环连成一个β折叠桶式的四聚体，具有充分暴露的甘露糖结合位点。
GNA的抗虫作用机制还不十分清楚，但可能与它特异地结合昆虫肠道某些位置上的糖基有关。GNA结合后可能改变了昆虫的味觉从而使昆虫营养不良，生长发育受阻或导致死亡。
同翅目的某些刺吸式昆虫严重危害农作物，一方面它们吸食农作物，造成直接的危害，特别是蚜虫对棉苗期的棉花危害严重。据估计1994年在我国新疆棉区，蚜虫造成的损失就达150公斤籽棉/亩；另一方面它们可以作为植物病源载体，尤其是作为植物病毒的载体，通过在植物间传播病毒而间接地危害农作物。利用转基因技术将抗虫基因导入植物可获得具有抗虫能力的转基因植物，可以避免使用化学杀虫剂造成的诸如环境污染，危害人体健康，杀死益虫，破坏生态平衡等副作用。所以寻找可以抗同翅目害虫的蛋白质，通过基因工程技术培育抗这类害虫的转基因植物应该是减轻或消除这类害虫危害的一条有效的途径。为此，Powell等人(Entomologia Experimental et Applicata.7551～59，1995)对一系列外源凝集素(lectin)进行了抗虫性研究，其结果表明，小麦外源凝集素(WGA)和雪花莲凝集素(GNA)在0.1％浓度下对稻飞虱的致死亡率可达80％，同时发现GNA对稻绿叶蝉有强烈的毒性。Hilder等人(TransgeneResearch，418～25，1995)证实GNA不仅能抑制桃蚜的生长，而且能抑制其繁殖力。在含0.1％GNA的人工饲料条件下，蚜虫的死亡率增加了33％，存活的蚜虫无论大小还是体重都比对照都有明显下降。他们用表达GNA的转基因烟草证明桃蚜在一些植株上的虫口密度增长降低了50％左右。我们用表达GNA的转基因烟草进行蚜虫试验也得到了类似结果(周岩等，生物工程学报，Vol.14(1)1998)。除烟草外，转GNA基因的马铃薯(Gatehouse等，Mol.Breeding，349-63，1999)，小麦(Stoger等，Mol.Breeding 565-73，1999)和水稻(Rao等，Plant J.15(4)469-77，1998)也表现出对蚜虫的一定抗性。
但已报道的转GNA基因植物只能抑制50％左右的蚜虫虫口密度，其抗蚜性的实用价值还很有限。虽然GNA是来自高等植物的一个基因，但其eDNA序列中仍然存在一些对大多数植物不太适合的密码子，所以对GNA基因进行遗传修饰，改变其在一般植物中使用频率低的密码子以提高转GNA基因植物的抗蚜效果。本发明对天然GNA基因的序列进行遗传修饰后产生一种修饰的GNA基因，该基因更适合在植物中表达，并进一步构建了高效且具有组织特异性的植物表达载体。该表达载体通过一定的方法转入植物后，可赋予植物对害虫，尤其是从植物韧皮部组织危害植物的同翅目害虫的抗虫性。
除了甲硫氨酸和色氨酸外，所有其他氨基酸都是由2～6个密码子编码。在迄今所研究的绝大多数物种中，同义密码子的使用不是随机的。Murray等人(Murray，E.E.et al，Nucl.Acids Res.17477-498，1989)研究了207种植物基因(53种单子叶植物基因和154种双子叶植物基因)的使用频率，发现NCG(N代表任何一种碱基)在双子叶植物中为最稀有的密码子，而在单子叶植物和双子叶植物之中NTA是最稀有的密码子。对天然GNA基因的序列分析表明，该基因中有些密码子在双子叶植物中或在单子叶和双子叶植物中都是使用频率很低的最稀有密码子。若将天然GNA基因转入植物，由于其含有的使用频率较低的稀有密码子与植物体内蛋白翻译体系不协调，将导致目的蛋白的表达量较低，从而影响转基因植物的抗虫效果。在本发明中，我们使用定点突变方法对天然的编码GNA前体蛋白的DNA序列进行了遗传修饰，将其含有的最稀有密码子改成植物常用密码子。本发明将编码GNA成熟蛋白的DNA序列命名为GNA12，将编码GNA前体蛋白的DNA序列命名为GNA34，而遗传修饰后的编码GNA前体蛋白的DNA序列则命名为GNA34m。GNA34m具有如图1所示的核苷酸序列，共483bp，编码160个氨基酸，包括由26个氨基酸残基组成的5’-信号肽和由29个氨基酸残基组成的3’-末端多肽，以及由105个氨基酸残基组成的GNA成熟蛋白。GNA34m序列所编码的蛋白质的氨基酸序列如图2所示。遗传修饰后的GNA编码序列适合在植物中高效表达从而赋予植物对蚜虫等同翅目害虫的较高抗性。此外，本领域研究人员也可以采用人工合成方法得到与本发明图1所示核苷酸序列完全相同的编码雪花莲凝集素GNA的DNA序列或其功能等同序列。
本发明使用编码GNA前体蛋白的DNA序列而未使用编码GNA成熟蛋白的DNA序列，是考虑到转GNA成熟蛋白基因植物中，由于没有5’-信号肽，GNA不能穿过内质网膜，又由于没有3’-末端多肽，GNA蛋白不能定向运输到液泡，因此该蛋白只能停留在细胞质内，很容易被细胞内蛋白酶将它们作为外源蛋白降解，所产生的转基因植物的抗虫性将受到影响。
适于与GNA34m序列构建嵌合基因从而驱动GNA34m在转基因植物中表达的启动子可以是组成型、诱导型、组织或器官特异性或发育阶段特异性启动子。本发明使用一种在植物韧皮部特异和高效的病毒启动子竹节花黄斑驳病毒(Comellina yellow mottle virus)启动子(以下简称CoYMV启动子)(Medberry S.L.等，Plant Cell.4 185-192，1992)来驱动GNA34m的表达。采用这一策略是考虑到组成型表达启动子驱动目的片段在植物体内各部位平均表达，难以在受侵害组织形成较高的作用浓度，而在非侵害部位表达对植物本身是一种额外负担和能源及养分的浪费；而使用韧皮部组织特异表达启动子可使目的基因在韧皮部组织特异地高效表达，可以更有效、更经济地发挥目的基因的作用，有针对性地防治从韧皮部取食的蚜虫等同翅目害虫的危害，同时降低对害虫的选择压从而避免或延缓昆虫对这种转基因植物产生抗性，还可减轻植物对抗虫基因产物的代谢负担。
本发明构建的带有GNA34m嵌合基因表达盒的融合表达载体pBCGm已转化到大肠杆菌DH5α并已于2000年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC NO0451。
本发明所构建的表达载体pBCGm只是本发明的一个优选实施例，并未限制本发明。其它一些转录或翻译的调控序列，如35S增强子、Ω序列、3′UTR序列、MAR序列和终止序列都可以在适当部位加到该基因构建体上以进一步提高其表达水平。凡是应用本发明所描述的GNA34m序列所构建的任何表达载体均包括在本发明之内。
本发明所描述的GNA34m序列还可以用于与其它任何杀虫基因重组、融合或协同构建表达载体转化植物，以获得杀虫能力更强、杀虫范围更广或这两方面都得到加强了的转基因植物。此外，本发明的GNA34m序列还可以与其它可用于改良作物的目的基因重组、融合或协同，以获得既具有抗虫性同时又具有其它优良农艺性状的转基因植物。
本发明使用根癌土壤杆菌介导转化法将按上述方法制备的携带本发明的GNA34m嵌合基因的重组表达载体转化到植物体内。此外，还有许多为本领域技术人员所熟知的植物转化方法都可用于携带有本发明所描述的GNA34m序列的嵌合基因的重组表达载体的植物转化。这些方法包括但并不限于基因枪法、激光微束法、显微注射法、超声波法、电击融合法、炭化硅纤维介导法、脂质体介导转化法、花粉介导法，花粉管通道法、子房注射法、浸泡法以及花椰菜花叶病毒(CaMV)、双生病毒(Geminiviruses)或RNA病毒等病毒所介导的转化法。
我们选择烟草和棉花作为本发明所描述的GNA34m嵌合基因的转化受体植物。因为烟草是一个普遍使用的模式植物，而棉花主要作为纺织工业原料，具有重要的经济价值而且每年因虫害对广泛种植的棉花所造成的经济损失是十分巨大的。
因而，本发明涉及遗传修饰的编码雪花莲凝集素(GNA)前体蛋白质的DNA序列，包含所说的DNA序列的高效且具有植物组织特异性表达特点的植物表达载体，用所说的表达载体转化植物细胞、组织或整株植物所产生的对植物害虫有抗性的转基因植物，特别是对蚜虫等同翅目昆虫有显著抗性作用的转基因棉花。含有本发明的GNA34m序列的嵌合基因的重组表达载体还可用于转化任何植物或其组织或细胞，由此而获得的具有抗害虫能力的转基因植物，其子代及其种子均包括在本发明之内。


图1遗传修饰后的编码雪花莲凝集素(GNA)前体蛋白的DNA序列。黑体的为突变碱基。
图2雪花莲凝集素(GNA)前体蛋白的氨基酸序列；箭头“↓”所指处为5′-信号肽及3′-末端多肽的加工位点。
图3用于对编码雪花莲凝集素(GNA)前体蛋白的DNA序列进行遗传修饰的六条突变引物。黑体的为突变碱基。
图4用于对编码雪花莲凝集素(GNA)前体蛋白的DNA序列进行遗传修饰的两条选择引物。黑体的为突变碱基。
图5用于对转嵌合的雪花莲凝集素(GNA)基因植物进行PCR检测的两条引物。
图6含有嵌合基因GNA34和GNA34m的植物表达载体pBCG和pBCGm的T-DNA区结构注RB T-DNA的右边界序列；LB T-DNA的左边界序列；CoYMV Pro.
CoYMV启动子的882bp片段；GNA34编码雪花莲凝集素(GNA)前体蛋白质的DNA序列；GNA34m遗传修饰后的编码雪花莲凝集素(GNA)前体蛋白质的DNA序列；Nos Pro.章鱼碱合酶基因启动子；Nos 3’章鱼碱合酶基因终止子；P1 PstI；Sp SphI；H3 HindIII；B1 BamH；R1 EcoRI图7部分转基因植株的PCR检测结果。
上图对转嵌合GNA34m或GNA34基因烟草植株进行PCR检测的结果MDNA分子量标准1以非转基因烟草DNA为模板的阴性对照2以质粒pBCGm为模板的阳性对照3～11以不同的转嵌合GNA基因烟草植株DNA为模板的PCR结果下图对转嵌合GNA34m基因棉花植株进行PCR检测的结果MDNA分子量标准1～5以不同的转嵌合GNA基因棉花植株DNA为模板的PCR结果6以质粒pBCGm为模板的阳性对照7以非转基因烟草或棉花DNA为模板的阴性对照图8转嵌合GNA基因烟草的Southern杂交检测结果。
MDNA分子量标准1HindIII和BamHI双酶解的非转基因烟草DNA2CoYMV启动子的882bp(-870～+12)片段3～6HindIII和BamHI双酶解的转嵌合GNA基因的不同烟草植株的DNA图9转嵌合GNA基因烟草的Western杂交检测结果M蛋白分子量标准1GNA成熟蛋白标准品50ng2非转基因烟草植株的蛋白样品3～8转嵌合GNA基因的不同烟草植株的蛋白样品图10不同抗蚜活性的转嵌合GNA基因烟草的百分数分布试验植株数非转基因烟草(CK)10株；转嵌合GNA34基因烟草(pBCG)48株；转嵌合GNA34m基因烟草(pBCGm)84株蚜口密度抑制百分率的计算方法(非转基因烟草叶片上蚜虫数-转基因烟草叶片上蚜虫数)/非转基因烟草叶片上蚜虫数]×100％。
图11转嵌合GNA基因烟草对蚜虫繁殖的抑制作用用于计算平均蚜口密度的试验植株数非转基因烟草(CK)5株；转嵌合GNA34基因烟草(GNA34)9株；转嵌合GNA34m基因烟草(GNA34m)13株图12转基因植株的抗蚜试验上图转嵌合GNA34m基因烟草植株叶片的抗蚜试验Control非转基因烟草叶片；GNA34m转嵌合GNA34m基因烟草叶片下图转嵌合GNA34m基因棉花植株的田间抗蚜试验A大田试验概貌；B转基因和非转基因棉株的对照“抗蚜”转嵌合GNA34m基因棉株；“不抗蚜”非转基因棉株实施例编码雪花莲凝集素(GNA)前体蛋白的DNA序列的遗传修饰及修饰后序列的嵌合基因在转基因植物中的抗虫性研究一.采用定点突变技术对克隆的编码雪花莲凝集素(GNA)前体蛋白的DNA序列进行了遗传修饰。1.引物设计与制备1.1寡核苷酸引物的设计，合成及纯化根据定点突变的技术要求设计了6条突变引物P1、P2、P3、P4、P5和P6以及两条选择引物ScaI/StuI和StuI/ScaI。六条突变引物及两条选择引物的序列分别如图3和图4所示。用Applied BiosystemsInc.的380A DNA合成仪(中科院微生物所技术中心)分别合成上述8条寡核苷酸引物片段并经C18柱纯化，然后以氯仿抽提和2.5倍95％的乙醇在-80℃沉淀1小时，离心(10,000rpm，30min.)收集寡核苷酸沉淀，真空干燥后溶于一定体积的无菌蒸馏水中，经测在260nm的光密度来计算引物的浓度。贮存于-20℃冰箱。1.2寡核苷酸引物的磷酸化取上述纯化的寡核苷酸引物1μg在含有4.0μl5×Kinase Forward Buffer，1.0μl T4 Polynucleotide Kinase(10u/μl)，2μlATP(10mmol/μl)和补加剩余体积的无菌蒸馏水的20μl体系中，混匀，置37℃水浴1～1.5hrs，65℃加热10min.终止其反应，然后置-20℃冰箱保存。每个突变反应使用2μl(6.0pmol/μl)磷酸化引物。2.编码雪花莲凝集素(GNA)前体蛋白的DNA序列的遗传修饰编码雪花莲凝集素(GNA)前体蛋白的DNA序列(GNA34)中含有九个植物中最稀有的密码子。为了使GNA34能够在转基因植物中以较高的水平表达，获得具有更强抗蚜活性的转基因植物，我们对GNA34序列进行了遗传修饰，在不改变氨基酸残基组成的前提下，将这九个密码子替换成植物的优化密码子，同时去除该序列中存在的Hind III限制性酶切位点，以使其可用于与其它基因构建多价植物表达载体。
具体步骤为2.1质粒DNA的提取碱法(Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T，著．金冬雁，黎孟枫等译．分子克隆实验操作指南(第二版)，北京科学出版社，1993)提取含有GNA34片段的质粒pGna34(周岩等，生物工程学报，Vol.14(1)1998)。2.2模板DNA的变性取2μl质粒DNA(100ng)，2μl复性缓冲溶液(10×)，2μl选择引物(100ng)，2μl突变引物(100ng)和12.0μl重蒸水混匀，置100℃水中煮沸3分钟，然后取出迅速置于冰浴中5分钟。2.3突变DNA链的合成在以上溶液中，加入3.0μl合成缓冲溶液(10×100mmol/L TrisHCl，pH7.5；5mmol/L dNTP；10mmol/L ATP；20mmol/LDTT)，1.0μl T4 DNA Polymerase(3u/μl)，1.0μl T4 DNA ligase(5u/μl)和5.0μl重蒸水，混匀，置于37℃水浴1-2hrs。合成反应结束后，将合成混合液置于70℃加热5分钟使酶灭活。2.4限制性酶解的第一次选择这里使用的限制性内切酶依赖于所使用的选择引物。乙醇沉淀上述合成混合液中的DNA，离心收集DNA沉淀，真空干燥后，加入20μl重蒸水溶解，然后加入1.5μl限制性内切酶ScaI(当使用ScaI/StuI作选择引物时)或StuI(当使用StuI/ScaI作选择引物时)，用重蒸水补至30μl，37℃酶解6-12hrs。第一次酶解结束后，置于70℃加热5分钟使酶灭活。2.5第一次转化取以上第一次酶解的混合液5-10μl转化E.coli BMG71-18nutS感受态细胞，具体方法参照Sambrook等(Sambrook J，Fritsch EF，Maniatis T，著．金冬雁，黎孟枫等译．分子克隆实验操作指南(第二版)，北京科学出版社，1993)。将转化混合液加到4ml含50μg/ml四环素和50μg/ml氨苄青霉素的LB培养液(trypton 10g/L，yeast extract 5g/L，NaCl10g/L，pH7.0)中，37℃摇床培养过夜。2.6混合质粒库的分离用碱法提取第一次转化后培养的质粒。2.7限制性酶解的第二次选择取5μl步骤2.6制备的质粒(约100ng)，加入与第一次选择酶解相同的限制性酶1.5-2.0μl和3.0μl限制酶缓冲液(10×)，用DDW调整反应系统到30μl，混匀，置37℃酶解2hrs；补加另一份1.0μl同样的限制酶，37℃继续酶解3-5hrs。2.8第二次转化使用E.coli DH5α感受态细胞作第二次转化。取以上第二次酶切的质粒5μl，转化E.coli DH5α。转化结束后，取100μl和800μl转化液分别均匀涂布于含氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养12hrs。2.9突变质粒的筛选挑取转化子菌落，提取质粒，用与第一、二次酶切相对应的酶(如第一、二次酶切使用ScaI或StuI，这里就用StuI或ScaI)酶切检查，能被切开的质粒，说明选则引物上的酶切位点已改变过来，最后通过对被改造的DNA片段的测序检查设计的突变位点是否已被遗传修饰。
按如上所述方法完成了对所克隆的GNA34序列的遗传修饰。遗传修饰前后GNA34序列在植物中密码子使用频率的变化如下表一所示。GNA34m的序列附图1所示。表一 遗传修饰前后GNA34序列在植物中密码子使用频率的变化引物 密码子的变化 植物密码子使用频率的变化(％) 编码的氨基酸P1 ACG→ACC8→30ThrP2 GTA→GTG12→29 ValCCG→CCA9→42ProP3 TCG→TCC6→18SerCCG→CCA9→42ProP4 CTA→CTC6→19LeuP5 TCG→TCC6→18SerP6 ATA→ATC18→37 IleACG→ACC8→30Thr二.转基因植物研究1.表达载体的构建用竹节花黄斑驳病毒(Commelina yellow mottle virus，CoYMV)启动子的882bp(-870－+12)片段Copdl(吴标等.微生物学报，39(1)15-21，1999，)替换pBin438载体(李太元等，中国科学24(3)276-282，1994)上的CaMV 35S启动子片段和Ω片段，产生一个新的植物表达载体pBinC。用BamHI和SalI双酶切pBinC，回收载体DNA大片段，与经BamHI和XhoI双酶切含有GNA34片段的pGna34质粒或含有GNA34m片段的pGna34m质粒后分离、回收的GNA34或GNA34m片段连接，所产生的含有嵌合基因CoYMV-GNA34或CoYMV-GNA34m的两种植物表达载体分别命名为pBCG和pBCGm。分别以pBCG和pBCGm转化E.coli DH5α感受态细胞，挑取转化子菌落，制备质粒，通过酶切分析和测序筛选阳性克隆。植物表达载体pBCG和pBCGm质粒的T-DNA区结构如附图6所示。含pBCGm的E.coli DH5α转化子pBCGm/DH5α已于2000年5月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC NO 0451。2.植物转化以碱变性法(Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T，著.金冬雁，黎孟枫等译.分子克隆实验操作指南(第二版)，北京科学出版社，1993)从pBCG或pBCGm的E.coli DH5α转化子制备pBCG和pBCGm质粒，用液氮冻融转化法(贾盘兴等，微生物遗传学实验技术，北京科学出版社，108-109，1992)将所制备的质粒转入根癌土壤杆菌LBA4404，然后以PCR和酶切筛选阳性克隆。用叶盘法(Horsch等.，Science 227,1229-1231，1985)将含有植物表达载体pBCG和pBCGm的根癌土壤杆菌分别转化烟草(K326)，通过卡那霉素抗性筛选分别获得了转嵌合基因pBCG和pBCGm的烟草再生植株49株和102株。棉花的转化采用根癌土壤杆菌介导转化法。用无菌培养的棉花(Gossypium hirsutum L.)幼苗的下胚轴作为携带有植物表达载体pBCG或pBCGm的根癌土壤杆菌LBA4404侵染的外植体。棉花转化及再生植株获得的详细方法参见文献(李燕娥等，棉花学报，10237-243 1998)，结果获得了一批能结实的转嵌合基因pBCG或pBCGm的棉花植株。3.转基因植物的PCR检测3.1植物基因组DNA的小制备参考核抽提裂解法(Paterson等，Plant Molecular Biology Reporter，Vol11(2)122-127，1993)制备烟草或棉花的基因组DNA。具体步骤为取新鲜转基因或非转基因烟草(Nicotiana tobacum)或棉花(Gossypiumhirsutum L.)的叶片约50毫克，在液氮中研成粉，加入1.0ml核提取缓冲液(0.35mol/l葡萄糖，0.1mol/l Tris-HCl，pH8.0，5mmol/l Na2-EDTA，pH8.0，2％(w/v)polyvinylpyrolidone (PVP40)和0.1％(w/v)diethyldithiocarbamic acid(DIECA)，用前加入0.2％(w/v)巯基乙醇和0.5％(w/v)Triton-x-100)，混匀，4℃离心(5,000rpm，5min.)，弃上清，往沉淀(含有解析出来的细胞核)中加入0.7ml核裂解缓冲液(0.1mol/lTris-HCl(pH8.0)，1.4mol/l NaCl，20mmol/l Na2-EDTA(pH8.0)，2％(w/v)hexadecyl triammonium bromide(CTAB)，2％(w/v)P Triton-x-100)，充分悬浮，在65℃水浴保温30分钟，加入0.7ml氯仿∶异戊醇(24∶1)，上下巅倒离心管10～50次抽提蛋白，4℃离心(6,000rpm，5min.)，吸取上清，在上清中加入0.6倍体积的异丙醇，缓慢地上下巅倒离心管10—20次直至絮丝状DNA沉淀产生；4℃离心(10,000rpm，5min.)沉淀DNA，以70％乙醇洗涤DNA沉淀2次，室温(或37℃)使DNA干燥。加入20ulTE(10mmol/l Tris-HCl，pH8.0，0.1mmol/l EDTA),65℃保温30分钟以充分溶解DNA，冷却至室温后用于PCR试验或贮存于-20℃。3.2 PCR检测取1μl(约0.1μg)小制备的烟草或棉花植物的DNA作为扩增模板，在含有1×扩增缓冲液，1μmol/L扩增引物(正链引物为GNA34m序列特异性的P1引物；负链引物为嵌合基因CoYMV-GNA34-Nos或CoYMV-GNA34m-Nos中所含有的Nos终止子序列特异性的Nos-引物，这两条引物的序列见附图5所示)，0.2mmol/L dNTPs，0.5单位Taq DNA聚合酶的20μl扩增体系中进行PCR扩增反应。扩增条件为94℃预变性3分钟；然后以94℃变性30秒，54℃复性30秒，70℃延伸1分钟，循环30次。取10μl PCR扩增反应混合物，在0.8％的琼脂糖胶上电泳。结果表明约70％的烟草转化再生植株以及部分棉花转化再生植株为PCR阳性，即产生了特异性的约500bp的扩增靶DNA带，而非转化植株未产生任何扩增DNA带。PCR扩增结果初步说明嵌合GNA基因已转入了转化再生烟草及棉花植株。部分转基因植株的PCR扩增结果见附图7所示。4.转基因植物的抗蚜试验4.1转GNA基因烟草的抗蚜试验当转基因烟草和非转基因烟草长到3-5片叶时，取植株的中层叶片，插到40ml分装至100ml容积三角瓶中的无糖MS固体培养基[MS基础培养基粉(Sigma产品)4.5g/L；B5 Vitamins(inositol 100mg/L，nicotinic acid1mg/L，pyridoxin 10mg/L，thiamin 1mg/L)；phytagel凝固剂1.6g/L；调节pH至5.6-5.8。8磅灭菌30分钟，在培养基温度降至约42℃时加入抗细菌的羧苄青霉素及抗真菌的Nicomycin抗生素至终浓度分别为500mg/L和100mg/L]上，在植物光照培养箱中进行培养。培养条件为每日光照16小时，温度25℃；黑暗8小时，温度22℃。每个培养瓶中放置一片叶片，用软毛笔小心接入5只一龄桃蚜(Myzus persicae)，隔日记录每片叶片上所有蚜虫的数量，直至第十四天。抗蚜试验重复两次。转基因烟草的抗蚜效果用抑制蚜口密度来表示，其计算方法为[(非转基因烟草叶片上蚜虫数-转基因烟草叶片上蚜虫数)/非转基因烟草叶片上蚜虫数]×100％。对48株转嵌合GNA34基因烟草再生植株和84株转嵌合GNA34m基因烟草再生植株进行了抗蚜虫试。结果前者的平均抑制蚜口密度为63.7％，而后者为71.5％，比前者高7.8％。统计分析(t检验)表明，两者的差异是显著的。转嵌合GNA34m基因烟草叶片的抗蚜试验见附图12所示。对不同抗蚜水平的植株在总试验植株中分布的统计分析表明抑制蚜口密度在50％以下的低抗植株中，转GNA34基因的植株百分数高于转GNA34m基因的，而抑制蚜口密度在50％以上的植株的百分数是GNA34m基因高于GNA34基因(附图10)。这一结果也表明遗传修饰后的GNA34m基因具有了更高的抗蚜活性。对部分植株的虫口密度作了连续观察记录，结果表明转嵌合GNA基因烟草的虫口密度增长缓慢，而非转基因对照烟草的虫口密度增长迅速(附图11)。可见GNA对抑制蚜虫繁殖具有很好的效果。此外，从附图11所示的抗蚜曲线可见转嵌合GNA34m基因的烟草抑制蚜虫繁殖的效果比嵌合GNA34基因更好。4.2转嵌合GNA34m基因棉花的抗蚜性试验转嵌合GNA34m基因棉花在田间进行了自然感虫、抗虫试验。在99年棉蚜严重流行的年份，转嵌合GNA34m基因棉花植株子代中有部分植株表现出一定的抗蚜性。在调查的1000株棉株中有71株上无蚜虫，叶片平展，329株上有蚜虫，但叶片正常，不表现虫害症状，有95株上有蚜虫，叶片呈微卷状态，但后期可恢复正常；其余505株有大量蚜虫，叶片卷曲严重，后期也难以恢复。由于试验棉株不是纯合的，其子代棉株会发生基因分离，部分子代株中不再含有GNA34m基因从而不具备对棉蚜的抗性；此外，由于转基因植株中普遍存在的位置效应的影响，目的蛋白GNA的表达量在不同的转基因植株中会差别很大，GNA表达量较低的棉株对棉蚜抗性很低或没有抗性。通过子代分离或杂交技术，完全可以筛选到稳定地高表达GNA蛋白从而具有对棉蚜较高抗性的转嵌合GNA34m基因棉花纯合系。这些结果表明，转嵌合GNA34m基因棉花对棉蚜有较好的抗性。转嵌合GNA34m基因棉花的田间抗蚜试验见附图12所示。5.转基因植物的Southem杂交分析烟草基因组DNA的制备采用核抽提裂解法[Paterson等，PlantMolecular Biology Reporter，2122-127，1993].用HindIII和BamHI双酶解转基因烟草及非转基因烟草的基因组DNA各约30ug，以32P标记CoYMV启动子的882bp片段(即Copd1)作为探针进行Southern杂交分析。按Amersham LIFE SCIENCE公司的杂交尼龙膜操作说明书(HybondTM-N+)进行DNA的转移及杂交。Southern杂交结果(附图8)表明，经PCR和抗蚜虫试验均为阳性的转嵌合基因GNA34烟草T0代植株G15和G42及转嵌合GNA34m基因烟草T0代植株Gm28、Gm39和Gm52的基因组DNA中均含有与CoYMV启动子探针片段特异杂交的杂交带，而对照非转基因烟草植株的基因组DNA中未检测到上述片段.根据以上结果可以肯定嵌合基因CoYMV-GNA34及CoYMV-GNA34m已转入了转化再生的烟草植株体内并整合到了其基因组DNA中。6.转基因植株子代的卡那霉素抗性分析取转嵌合GNA34基因T0代植株G42及转嵌合GNA34m基因T0代植株Gm39的种子置于55℃水中，自然冷却到室温后，再放置3-4hr，然后用70％的酒精洗1～2min，在含有10％的次氯酸钠和0.02％Tween中，灭菌10min，用灭菌水洗3～4次，每次洗3～4min，将种子摆在含有300mg/L卡那霉素的无激素MS培养基上[MS基础培养基盐(Sigma产品)4.5g/L；B5Vitamins(inositol 100mg/L，nicotinic acid 1 mg/L，pyridoxin 1 0mg/L，thiamin1mg/L)；蔗糖30g/L；phytagel凝固剂1.6g/L；调节pH至5.6-5.8。8磅灭菌30分钟，在培养基温度降至约42℃时加入卡那霉素抗生素至终浓度为300mg/L]平板上，每日光照16hr，25℃培养。当幼苗长出1～2片真叶时观察计算绿苗(卡那霉素抗性苗)数和白化苗(卡那霉素敏感苗)数。结果G42植株的49株T1代植株中绿苗数为36，白化苗数为13；Gm39植株的105株T1代植株中绿苗数为76，白化苗数为29。X2统计分析表明，G42和Gm39植株的子一代卡那霉素抗性分离比皆符合3∶1，由此可知这两株植株的染色体中分别含有单拷贝数的卡那霉素抗性基因NptII，并由此推测与NptII基因紧密连锁的嵌合GNA34或GNA34m基因在植物染色体上也皆为单拷贝数插入。7.转基因烟草的Westem blot检测。
取经PCR检测和抗蚜虫试验均为阳性的转GNA34及GNA34m基因烟草T0代植株进行Western blot分析。样品制备取100mg新鲜叶片，液氮研磨后加入100ul2×上样缓冲液，100℃煮3-5min后，10,000rpm离心5min，取20μl上清液进行电泳。电泳，转膜、杂交及显色均按文献(Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T著.金冬雁，黎孟枫等译.分子克隆实验操作指南(第二版)，北京科学出版社，1993)所述进行。所用一抗为兔抗GNA抗血清，稀释度1∶5000。在转嵌合GNA34及GNA34m基因烟草植株中皆检测到了GNA成熟蛋白的存在，说明所转GNA基因能正常表达出前体GNA蛋白，然后经过细胞内运输及正确加工产生了成熟的GNA蛋白。部分转基因烟草的Westem blot检测结果见附图9所示。
权利要求
1.一种遗传修饰的编码雪花莲凝集素(GNA)或其部分的DNA序列，其特征在于具有下列1至483bp的核苷酸序列及其功能等同序列。1 ATG GCT AAG GCA AGT CTC CTC ATT TTG GCC GCC ATC TTC CTT GGT GTC ATC ACA CCA TCT61 TCA CCA TCT TGC CTG AGT GAC AAT ATT TTG TAC TCC GGT GAG ACT CTC TCT ACC GGG GAA121 TTT CTC AAC TAC GGA AGT TTC GTT TTT ATC ATG CAA GAG GAC TGC AAT CTG GTC TTG TAC181 GAC GTG GAC AAG CCA ATC TGG GCA ACA AAC ACA GGT GGT CTC TCC CGT AGC TGC TTC CTC241 AGC ATG CAG ACT GAT GGG AAC CTC GTG GTG TAC AAC CCA TCC AAC AAA CCA ATT TGG GCA301 AGC AAC ACT GGA GGC CAA AAT GGG AAT TAC GTG TGC ATC CTC CAG AAG GAT AGG AAC GTT361 GTG ATC TAC GGA ACT GAT CGT TGG GCT ACT GGA ACT CAC ACC GGA CTT GTT GGA ATT CCC421 GCA TCC CCA CCC TCA GAG AAA TAT CCT ACT GCT GGA AAG ATC AAG CTC GTG ACC GCA AAG481 TAA-3’
2.根据权利要求1的核苷酸序列，特征在于其编码具有下列所示的由160个氨基酸残基组成的雪花莲凝集素前体蛋白的氨基酸序列或其部分及其功能等同蛋白质。Met Ala Lys Ala Ser Leu Leu Ile Leu Ala Ala Ile Phe Leu Gly Val Ile Thr Pro SerSer Pro Ser Cys Leu Ser Asp Asn Ile Leu Tyr Ser Gly Glu Thr Leu Ser Thr Gly GluPhe Leu Asn Tyr Gly Ser Phe Val Phe Ile Met Gln Glu Asp Cys Asn Leu Val Leu TyrAsp Val Asp Lys Pro Ile Trp Ala Thr Asn Thr Gly Gly Leu Ser Arg Ser Cys Phe LeuSer Met Gln Thr Asp Gly Asn Leu Val Val Tyr Asn Pro Ser Asn Lys Pro Ile Trp AlaSer Asn Thr Gly Gly Gln Asn Gly Asn Tyr Val Cys Ile Leu Gln Lys Asp Arg Asn ValVal Ile Tyr Gly Thr Asp Arg Trp Ala Thr Gly Thr His Thr Gly Leu Val Gly Ile ProAla Ser Pro Pro Ser Glu Lys Tyr Pro Thr Ala Gly Lys Ile Lys Leu Val Thr Ala Lys
3.重组质粒，其特征在于含有权利要求1所述的核苷酸序列的全部或部分片段。
4.能在植物韧皮部组织特异表达的重组质粒，特征在于其含有权利要求1所述的核苷酸序列的全部或部分片段。
5.根据权利要求4所述的重组质粒，它是pBCGm。
6.一种重组微生物，是由权利要求5所述重组质粒转化微生物所获得的。
7.根据权利要求6所述的重组微生物，其特征在于所述微生物是埃西氏大肠杆菌(Escherichia coli)，保藏登记号为CGMCC No.0451。
8.重组微生物，含有权利要求4和5所述的重组质粒。
9.根据权利要求8所述的重组微生物，其中所述重组微生物是根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)。
10.用权利要求3～5及8～9所述的重组质粒或重组微生物转化植物所产生的转基因植物。
全文摘要
本发明提供了用定点突变方法进行遗传修饰的雪花莲凝集素(GNA)的编码区DNA序列。涉及包含所说DNA序列的融合基因构建体;携带该构建体的新的重组表达载体。该表达载体具有在植物中特异和高效表达的特性。还涉及被所说的表达载体转化的植物细胞,以及由所说的转化细胞产生的对同翅目害虫的繁殖有显著抑制作用的转基因植物及其后代,包括植物种子及植物组织。本发明尤其涉及了抗蚜虫转基因棉花。
文档编号C12N15/11GK1327053SQ00109089
公开日2001年12月19日 申请日期2000年6月6日 优先权日2000年6月6日
发明者田颖川, 袁正强 申请人:中国科学院微生物研究所