专利名称：中华蜜蜂镇静肽前体基因及其编码的多肽和制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种新的蜂毒基因核苷酸序列。更具体地说，本发明涉及中华蜜蜂蜂毒镇静肽前体(Preprosecapin)基因的cDNA序列，该cDNA序列编码的多肽是意大利蜜蜂Preprosecapin蛋白的同系物，该多肽经过翻译后加工所得到的多肽(成熟肽)是意大利蜜蜂镇静肽(Secapin)的同系物。本发明还涉及有该核苷酸序列编码的多肽，这些多核苷酸和多肽的应用，以及所述多核苷酸和所述多肽的制备方法。
背景技术：
意大利蜜蜂(Apis mellifera)蜂毒镇静肽(Bee venomous Secapin)是意大利蜜蜂蜂毒的四个多肽之一，约占蜂毒干重的1％，由25个氨基酸组成(Eur.J.Biochem.1978，83405-410；Abstr.15 Eur.Pepetide.Symp.1978，p84)。按来源和生化性质，它属碱性多肽，Secapin其生物活性与溶血肽相似，具有消炎、抗菌、降压、镇静等作用(Eur.T.Biochem.1978，83405-410)。
1984，Vlask和Kreil将意蜂蜂王毒腺cDNA插入pBR322的pst I和Cla I位点，用32P标记的cDNA探针筛选出阳性克隆(PUM9/24，PBMC1)，酶切后再亚隆到PUC8，得到了蜂毒Preprosecapin基因，对该基因的测序结果进行氨基酸序列推导，获77个氨基酸残基，其中最后25个氨基酸残基与已知Secapin氨基酸序列一致，前32个氨基酸残基为信号肽，中间20个氨基酸为极性肽前体，Preprosecapin基因经过翻译后加工，即在蜜蜂的毒囊中经过蜜蜂体内一种水解酶的裂解便得到了活性多肽Secapin(Eur.J.Biochem.1984，145279～242.)。Secapin与其他几种蜂毒多肽在医学与生物物理学上有重要的应用价值。
发明内容
本发明目的之一是提供一种中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin基因的多核苷酸，该多核苷酸编码意大利蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的一个同系物，该前体蛋白经加工后得到的活性多肽为意大利蜜蜂Secapin多肽的一个同系物。
本发明目的之二是提供一种新的意大利蜜蜂Preprosecapin蛋白的同系物，该多肽为中华蜜蜂Preprosecapin蛋白。
本发明目的还提供了这种制备中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin核苷酸探针、含中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin核苷酸的重组载体、含重组载体的宿主细胞，以及多肽抗体的方法。
在本发明，提供了一种分离出的DNA分子，它包括编码具有中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.5中从核苷酸1～234位的核苷酸序列有至少70％同源性，或者所述的核苷酸序列能在中度严谨条件下与SEQ ID No.5中从核苷酸1～234位的核苷酸杂交，较佳地，该多肽具有SEQ ID No.6所示的序列。更佳地，该序列具有SEQ ID No.5中从核苷酸1～234位的核苷酸序列。
在本发明还提供了一种分离的中华蜜蜂蜂毒Secapin蛋白活性多肽，它包括具有SEQ ID No.6中53～77氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID No.6中53～77氨基酸序列的多肽。本发明还提供了一种载体，它含有上述分离出的DNA；一种所述载体转化的宿主细胞。
本发明还提供了一种制备具有中华蜜蜂蜂毒Secapin活性多肽的方法，该方法包括(a)将编码具有中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin基因的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.5核苷酸1～234位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞，形成中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的重组细胞；(c)在适合表达中华蜜蜂蜂毒Preproecapin蛋白多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有中华蜜蜂蜂毒Secapin蛋白活性的多肽。
本发明发现了一种编码中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白基因，该基因所编码的Preprosecapin多肽(中华蜜蜂蜂毒镇静肽前体)经过中华蜜蜂体内一种水解酶的裂解便得到了活性多肽Secapin，此活性多肽是一种生物活性物质，可应用于医学上的关节炎、神经性疾病、吸毒等的辅助治疗，可作为抗原用于蜂毒免疫制剂的制备，可作为生物学研究的工具酶。中华蜜蜂Preprosecapin基因可为研究中华蜜蜂蜂毒免疫的分子机理，为开发利用中华蜜蜂蜂毒资源提供新的依据。
具体实施例方式
在本发明的一个具体实施方案中，本发明的分离的多核苷酸全长为234个核苷酸，其详细序列见SEQ ID No.5，开放读框位于1～234位核苷酸。
在本发明中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来；还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。
在本发明中，术语“中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白(或多肽)的核苷酸序列，如SEQ IDNo.5中1～234位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指位于SEQ ID No.5序列的编码框1～234位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID No.5中1～234位核苷酸序列同源性低至约70％简并序列也能编码出SEQ ID No.6所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳地在高度严紧条件下，与SEQ ID No.5中从核苷酸1～234位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID No.5中从核苷酸1～234位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
该术语还包括能编码具有与中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin相同功能的蛋白的、SEQ ID No.6序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个核苷酸的缺失、插入和或取代，以及在5’和/或3’端添加数个核苷酸。
在本发明中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层折、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。
在本发明中，术语“中华蜜蜂蜂毒Secapin蛋白多肽”指具有中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白活性的SEQ ID No.6序列53-77的多肽。该术语还包括具有与中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白相同功能的、SEQ ID No.6序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、等位变异体、天然突变体，诱导突变体，在高或低的严谨度条件下能与中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin多肽的可溶性片段。
发明还提供中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白或多肽的类似物，这些类似物与天然中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括；体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
本发明还包括中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin多肽编码序列及其片段的反义序列，这种反义序列可用于抑制细胞内中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin的表达。
本发明还包括一种探针分子，该分子通常具有中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin多肽编码序列的8～100个，较佳地1～50个连续核苷酸。该探针可用于检测样品中是否存在编码中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin核苷酸分子。
本发明还包括检测中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin核苷酸序列的方法，它包括用上述的探针与样品进行杂交，然后检测探针是否发生了结合，较佳地，该样品是PCR扩增后的产物，其中PCR扩增引物对应于中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin多肽的编码序列，并可位于该编码序列的两侧或中间，引物长度一般为15-50个核苷酸。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌，枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞，较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如Tn细胞、CHO细胞、COS细胞等。
另一方面，本发明还包括对中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin或是其片段编码的多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin基因产物或片段。较佳地，指那些能与中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的分子，也包括那些并不影响中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin基因产物结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自中华蜜蜂的抗体部分的抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备，例如，纯化的中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来制备抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol，6511，1976；Kohler等人，EurJJmmunol，6292，1976；Hammerling等人，In MonoclonalAntibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本发明的抗体包括能阻断中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin功能的抗体以及不影响中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术而获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.coli)中制备的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。
在本发明的一个实施例中，中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin基因的cDNA核苷酸序列是如此获得的，以中华蜜蜂毒腺和毒囊总RNA反转录的cDNA为模板，用一对寡核苷酸为引物-A5’-GCTCGAGATGAAGAACTATTCAAAAAATGCA-3’为正向向引物，寡核苷酸B5’-GAAGCTTTTAAGGCACTATGACTCTACTACA-3’为反向引物，进行PCR。对扩增产物进行测序后得到SEQ ID No.5的全长cDNA序列。
中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin为中华蜜蜂毒腺表达的蛋白，本发明的中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin为研究中华蜜蜂蜂毒相关的分子机理提供了基础。
下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明范围。
实施例1，中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin的cDNA的克隆和测定1.引物扩增以中华蜜蜂毒腺、毒囊总RNA反转录的cDNA为模板，用一对寡核苷酸为引物—A5’-GCTCGAGATGAAGAACTATTCAAAAAATGCA-3’(SEQ IDNo.1)为正向引物，寡核苷酸B5’-GAAGCTTTTAAGGCACTATGACTCTACTACA-3’(SEQ ID No.2)为反向引物，进行PCR。A/B的PCR条件为94℃ 1分钟，随之以94℃40秒钟，54℃40秒钟和72℃60秒钟进行35个循环，最后72℃延伸10分钟，电泳检测得到约250bp的目的片段。
2.PCR产物的测序将上述PCR扩增产物A/B与pGEM-T Easy载体(Promega)连接，转化大肠杆菌JM109，用碱法提取质粒，用BigDye terminator v2.0。测序试剂盒(Epicentre Teclnologies)对抽提的质粒进行测序，获得cDNA序列，全长共234bp，详细序列见SEQ ID No.5，其中开放读框位于1～234位核苷酸。
根据得到的全长cDNA序列推导出中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的氨基酸序列，共77个氨基酸残基(包括25个氨基酸的成熟肽、32个氨基酸的信号肽和20个氨基酸的前体肽)，其氨基酸序列详见SEQ ID No.6。
实施例2，同源比较用本发明的中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin的全长cDNA序列及其编码蛋白，在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库及Non-redundantGenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR数据库中，用Blast程序进行核酸和蛋白同源检索。结果发现，它与意大利蜜蜂蜂毒Preprosecapin有显著的同源性。用Blast软件分析可以看出，它们蛋白的同源性为85％(见附表1)。因此，可以推测本发明的中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白为意大利蜜蜂蜂毒Preprosecapin的同系物，并具有类似的功能。
1984，Vlask和Kreil将意蜂蜂王毒腺cDNA插入pBR322的pst I和Cla I位点，用32p标记的cDNA探针筛选出阳性克隆(PUM9/24，PBMC1)，酶切后再亚隆到PUC8，对测序结果进行氨基酸序列推导，获得了编码意大利蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的新基因。该cDNA所编码的Preprosecapin成熟肽Secapin、信号肽和前原肽为77个氨基酸残基。Secapin和另外的几种蜂毒肽混合物，目前在医学上应用于心血管、支气管、肿瘤等辅助治疗的生物活性物质，也是一类抗菌抗辐射生物活性物质。另外Secapin和另外的几种蜂毒肽还是一类提高人免疫功能的生物活性物质。本发明人的中华蜜蜂Preprosecapin基因为研究中华蜜蜂蜂毒过敏、免疫的分子机理，为开发利用中华蜜蜂蜂毒资源提供了新的依据。
实施例3，中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin成熟肽Secapin在真核细胞(Tn细胞株，即粉纹野蛾细胞株)中的表达在该实施例中，以实施例1中PCR扩增产物作为插入片段。
PCR反应中使用的5’寡核苷酸引物序列为5’-GCTCGAGATGAAGAACTATTCAAAAAATGCA-3’(SEQ ID No.1)，该引物含有Xhol I限制性内切酶的酶切位点，在该酶切位点之后是起始密码子开始的中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin编码序列的24个核苷酸；3’端引物序列为5’-GAAGCTTTTAAGGCACTATGACTCTACTACA-3’(SEQ ID No.2)，该引物含有Hind III限制性内切酶的酶切位点，翻译终止子和中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin的部分编码序列。
引物上限制性内切酶酶切位点对应于Tn细胞表达载体pBacFastHTb上的限制性内切酶酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr和Gmr)，一个噬菌体复制起点(Ori)、一个病毒复制起点(SV40)、一个T7启动子、一个病毒启动子(P-CMV)，一个SV40启动子、一个SV40加尾信号和相应的polyA顺序、一个BGH加尾信号和相应的polyA顺序。
用Xhol I和Hind III消化pBacFastHTa载体及插入片段，随后用连结混合物转化E.coli TG I菌株，在含有Ampr和Gmr的LB培养皿上筛选转化子，补加Ampr和Gmr的LB液体培养基中培养(O/N)含所需构建物的克隆，抽提质粒，测序验证中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin的cDNA片段已正确插入了载体。随后用重组质粒转化E.coli DH10Bac菌株，在含有Ampr、Gmr、四环素的LB培养皿上筛选转化子，在补加Ampr、Gmr、四环素的LB液体培养基中培养(O/N)含所需构建物的克隆，抽提质粒，经Sepharose 2B柱纯化，回收质粒-70℃保存。2B柱纯化，回收质粒-70℃保存。
质粒转染Tn细胞是采用脂转染法，用Lipofectin(GiBco Life)进行的。转染48小时后，收集细胞及细胞上清，含重组病毒粒子的细胞上清用于下一轮感染。经2-3周的TC-100连续传代培养，收集细胞，用超声裂解法破碎细胞，以含NaCl0.5mM、imidazola 5mM、PMSF 1mM的20mM Tris-CI(PH8.0)溶液为平衡液及洗脱液，蛋白液用经预平衡的Ni2+Sepharose 6B柱过柱；再用含imdazola50mM、NaCl 0.5mM、PMSF 1mM的20mM Tris-CI(PH8.0)的溶液，洗去杂蛋白，专一性的吸附的6×His的融合蛋白，再用含imdazola 500mM、NaCl 0.5mM、PMSF 1mM的20mM Tris-CI(PH8.0)的溶液进行洗脱，然后以PBS(PH7.4)为透析液对表达蛋白溶液进行透析。最后冻干保存。
用10％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达蛋白的分子量大小约为2.8KDa。
此外，用常规方法对表达蛋白的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID No.6序列的53～77(成熟肽)一致。实施例4，中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin蛋白的成熟肽Secapin在大肠杆菌中的表达在该实施例中，以SEQ ID No.5中的核苷酸1～234位的核苷酸杂交PCR反应中使用的5’寡核苷酸引物序列为5’-GGATCCTTACATTATTGATGTTCCT-3’(SEQ ID No.5)，该引物含有BamH I限制性内切酶的酶切位点，中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin编码的成熟肽序列的18个核苷酸；3’端引物序列为5’-CGGGAATTAAGGCACTATGACTCT-3’(SEQ ID No.6)该引物含有EcoR I限制性内切酶的酶切位点，翻译终止子和中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin的部分编码序列。
引物上的限制性内切酶的酶切位点对应于细菌表达载体pGEX-4T-3上的限制性内切酶的酶切位点，该质粒载体编码抗生素抗性(Ampr)、一个细菌复制起点(Ori)、一个IPTG可调启动子/操纵子(P/O)，一个凝血酶识别位点，一个谷光甘肽S转移酶(GST)融和蛋白标记物以及限制性内切酶克隆位点。
用BamH I和EcoR I消化pGEX-4T-3载体及插入片段，随后将插入片段连接到pGEX-4T-3载体并保持开放读框在凝血酶识别位点起始。随后用连接混合物转化商品名为JM105的E.coli菌株，JM105含有多拷贝的重组质粒，其表达lacIq阻遏物并携带抗性(Ampr)，在含有Ampr的LB培养皿上筛选转化子，抽提质粒，测序验证中华蜜蜂蜂毒Secapin的cDNA片段，该序列为SEQ ID No.5序列的160～234，与已正确插入了载体。
在补加Ampr(100μg/ml)的LB液体培养基中过夜培养(O/N)含所需构建物的阳性转化子克隆。过夜(O/N)培养物以1∶10的稀释率稀释，然后接种到大体积LB液体培养基中，培养细胞生长至600光密度(OD600)为0.6-1.0时，加IPTG(“异丙基硫代-β-D半乳糖苷”)至终浓度为1.0mM。通过使lacI阻遏物失活，IPTG诱导启动P/O导致基因表达水平提高。继续培养细胞3-5小时，离心收集细胞沉淀，重悬于1/20体积比的PBS中，通过超声波裂解细胞，加入TritonX-100到终浓度1％30min溶解蛋白。低温离心粗提物(10000g)5min，上清物用谷光甘肽S转移酶(GST)纯化单元从溶液中纯化溶解的谷光甘肽-中华蜜蜂蜂毒Secapin融合蛋白，并将中华蜜蜂蜂毒Secapin从融和蛋白上切割下来。中华蜜蜂蜂毒Secapin蛋白用15％的SDS-PAGE胶进行电泳，鉴定表达该蛋白的分子量大小为约2.8KDa。
此外，用常规方法对表达蛋白的氨基酸进行测序，发现与SEQ ID No.6序列的53～77(成熟肽)一致。
权利要求
1.一种分离出的DNA分子，其特征在于，它包括编码具有中华蜜蜂蜂毒镇静肽前体蛋白的核苷酸序列；所述的核苷酸序列与SEQ ID No.5中从核苷酸1～234位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID No.5中从核苷酸1～234的核苷酸序列杂交。
2.如权利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列编码一多肽，该多肽具有SEQ No.6所示的序列；该序列具有SEQ ID No.5中从核苷酸1～234位的核苷酸序列。
3.一种分离的中华蜜蜂蜂毒镇静肽前体蛋白，其特征在于，它具有SEQ IDNo.6氨基酸序列的多肽、或其活性片段，或其活性衍生物，该多肽具有SEQ IDNo.6序列。
4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA。
5.一种宿主细胞，其特征在于，它是用权利要求4所述载体转化的宿主细胞。
6.一种具有中华蜜蜂蜂毒镇静肽前体基因产物活性多肽的制备方法，其特征在于，该方法包括(a)将编码具有中华蜜蜂蜂毒镇静肽前体蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成中华蜜蜂蜂毒镇静肽前体蛋白多肽表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID No.5中从核苷酸1～234位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)将步骤(a)中表达的载体转入宿主细胞，形成中华蜜蜂蜂毒镇静肽前体蛋白的重组细胞；(c)在适合表达中华蜜蜂蜂毒镇静肽前体基因产物多肽的条件下，培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有中华蜜蜂蜂毒镇静肽前体蛋白基因产物活性多肽镇静肽。
7.一种抗体，其特征在于，它是能与权利要求3所述的中华蜜蜂蜂毒镇静肽前体蛋白特异性结合的抗体。
8.一种探针分子，其特征在于，它含有权利要求1所述的DNA分子中8～100个连续核苷酸。
9.根据权利要求8所述的探针分子；其特征在于是指能与中华蜜蜂蜂毒镇静肽前体基因产物或片断结合但不识别和结合与其它不相关抗原分子的抗体。
10.根据权利要求8所述的探针分子，其特征在于，它具有中华蜜蜂蜂毒镇静肽前体多肽编码序列中15～20个连续的核苷酸。
全文摘要
本发明公开了一种中华蜜蜂蜂毒镇静肽前体(Preprosecapin)基因序列及其编码的多肽和该基因经过翻译后加工产物镇静肽(Secapin)的制备方法。该cDNA序列编码的蛋白是意大利蜜蜂蜂毒Preprosecapin的一个同系物,它与SEQ ID No.5中从核苷酸1～234位的核苷酸序列有至少70%的同源性。所述序列编码—具有SEQ ID No.6所示序列的多肽。此外,还提出了含中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin基因的载体、宿主细胞,与中华蜜蜂蜂毒Preprosecapin基因相关的抗体,具有蛋白活性中华蜜蜂蜂毒Secapin的多肽、相关抗体的制备方法。本发明为进一步研究Secapin相关的多肽活性分子机理,开发与Secapin相关的生物医药、诊断试剂及生物试剂打下了基础。
文档编号C12P19/34GK1377963SQ0211074
公开日2002年11月6日 申请日期2002年2月1日 优先权日2002年2月1日
发明者张素方, 张传溪, 施婉君, 程家安 申请人:浙江大学