专利名称：新的特异性切割存活素的核酶及其药物组合物和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域，具体地说，本发明涉及新的专一性的抗存活素核酶、含有该核酶的药物组合物及其在抗肿瘤基因治疗领域中的应用。
背景技术：
多细胞生命体的结构和功能的完整性的有效维持是通过对细胞的增殖以及细胞凋亡两个相关过程中的精细平衡来获得。细胞增殖亢起与凋亡锐减的最终后果是相同的，即肿瘤的形成。细胞凋亡这一复杂的生物学过程受到多个环节，涉及到正或负的效应因子的控制。存活素(Survivin，NCBI Database，登录号NO.BC008718)就是新进发现一个细胞凋亡的拮抗性蛋白质[1]，它在细胞周期的G2期和M期含量最高，并与参与细胞分裂的细胞骨架系统直接结合[2，3]。鉴于该存活素的启动子的活性在G2期远较在G1期为高，这一蛋白的细胞周期性表达似乎主要是在转录水平上受控。
大量依据表明存活素的表达在肿瘤细胞中异常升高，这与肿瘤细胞的凋亡速率极低呈正相关[1，9]。用反义RNA[2]或用显性负调存活素[6，8]，强制性抑制存活素的表达，可引起肿瘤细胞的凋亡和瘤体消退。
一种很有前景的可下调RNA水平的方法涉及到特异性切割目标蛋白的mRNA的核酶。核酶是具有顺序特异性切割RNA分子的能力的核糖核酸酶[5]。核糖核酸(RNA)是它的唯一成分。由于它是一个酶，因此与反义RNA相比，它抑制基因表达的效率更为高。锤头型(Hammerhead)的核酶是最小的一种核酶，它仅含有37个核苷酸的单链，从而也是最广泛应用的核酶[4，5]。
鉴于锤头型核酶的上述特征，本领域中迫切需要有特异性切割存活素RNA的核酶。
发明内容
本发明的一个目的是提供对存活素有专一性核酶活性的锤头型核酶(下简称核酶)。
本发明的另一个目的是用本发明核酶来加速存活素表达过度的肿瘤细胞的凋亡。
本发明还有一个目的是用本发明的核酶或其重组表达载体来制备治疗与存活素过度表达相关的疾病的药物。
本发明还有一个目的是提供一种含有本发明核酶的药物组合物。
本发明还有一个目的是利用本发明所发现的存活素RNA编码区中的特定位点来设计能特异性切割存活素RNA的核酶。
本发明一方面涉及一种分离的多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码特异性切割存活素RNA的锤头型核酶，该核酶具有选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示的多核苷酸序列。
本发明另一方面涉及一种重组表达载体，该载体含有一种或多种上述多核苷酸序列的腺病毒及腺病毒相关病毒表达质粒或逆转录病毒表达质粒。
在一个较佳的实施方案中，所述载体是含有一种或多种上述多核苷酸序列的腺病毒或逆转录病毒表达质粒。
本发明另一方面涉及一种促进存活素表达过度的细胞的凋亡的方法，该方法包括将上述重组表达载体导入所述存活素表达过度的细胞。
在一个较佳的实施方案中，所述重组表达载体是通过腺病毒、腺病毒相关病毒或逆转录病毒介导来导入所述细胞的。
在另一较佳的实施方案中，所述存活素表达过度的细胞是肿瘤细胞，更佳的是，所述存活素表达过度的细胞是肝癌细胞。
本发明另一方面涉及一种药物组合物，它包含特异性切割存活素编码区61、83、232、294或358位点的核酶或含有该核酶的重组表达载体以及药学上可接受的载体。
在一个较佳的实施方案中，所述特异性切割存活素编码区61、83、232、294或358位点的核酶是锤头型核酶，它具有选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示的多核苷酸序列。
本发明还有一方面涉及上述多核苷酸序列或重组表达载体在制备治疗与存活素过度表达相关的疾病的药物中的应用。
在一个较佳的实施方案中，所述与存活素过度表达相关的疾病是癌症。
本发明还有一个方面涉及存活素mRNA编码区61、83、232、294或358位点的应用，所述位点可用来设计或筛选特异性切割存活素RNA的核酶。
本发明提供了对存活素mRNA不同位点有专一性核酶活性的锤头型的核酶。这些核酶通过逆转录病毒或腺病毒载体运载入受体细胞内表达后，致使存活素的表达在RNA、蛋白质水平上降低，从而使细胞的凋亡过程去抑制而引起细胞死亡。
本发明的其它目的和优点将在下文的详细描述中有进一步揭示。
附图简述
图1显示了肿瘤细胞和肿瘤组织样本中存活素表达水平的RT-PCR结果。
图2显示了预测的存活素mRNA的二级结构，其中箭头表示候选的核酶酶切位点。
图3是用来构建核酶表达质粒的pGVal以及回文区(loop)中插入了核酶序列的pGVal-Rz的示意图。
图4显示了用于进行体外实验的存活素表达质粒pcDNA-HA-存活素以及加入了检测标记萤光素酶片段的表达质粒pcDNA-HA-存活素-萤光素酶的示意图。
图5显示了本发明中采用的5种针对存活素RNA的核酶的序列，其中箭头表示切点位置。
图6显示了用引物延伸法检测活性的结果和切割位点。其中，图6A是引物和预计的切割位点的示意图；图6B是引物延伸实验的结果，箭头表示存活素RNA经核酶切割产生的片段。
图7A显示了核酶体外切割活性实验中萤光素酶活性检测的结果。
图7B显示了核酶切割产物经体外翻译后的Western印迹结果。
图8是含有核酶序列Rz的逆转录病毒表达质粒的示意图。
图9显示了逆转录病毒介导的核酶导入的实验结果。其中图9A是RT-PCR结果，以β-肌动蛋白作为内对照；图9B是Western印迹结果，以PCNA作为内对照。
图10显示了MTT试验的结果。
图11是显示了腺病毒介导的核酶导入的实验结果。RT-PCR结果，以β-肌动蛋白作为内对照。
具体实施方案核酶切割RNA的效率取决于以下多个因素a)核酶的构型，它的酶活性中心是否外露；b)底物RNA分子的二级结构，有关的核酶酶切位点是否充分暴露和c)核酶在细胞内表达的水平[4]。
Lieber利用腺病毒的VA I和RNA分子作为支架，将其中设计有暴露性结构的核酶插入[4]。VA I属pol III酶的基因家族，pol III在生长迅速的细胞中活性极高，从而这一系统可以很好的解决上述三个问题中的第一和第三个问题。对底物RNA的核酶位点的暴露性问题的解决方式有两种1)根据自由能计算来对其二级结构进行预测；2)对所预期到的核酶可切性进行试验。
本发明者通过对存活素RNA分子处于暴露区的核酶切点进行选择，设计并合成了5种具有特异性切割存活素活性的核酶，并以腺病毒和逆转录病毒等作为常用载体进行了细胞水平的试验，证实了所合成的核酶具有预期的可切性，从而完成了本发明。
本发明一方面涉及一种分离的多核苷酸序列，该多核苷酸序列编码特异性切割存活素RNA的锤头型核酶，它具有选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示的多核苷酸序列。
具体地说，所述核酶具有选自下列的多核苷酸序列CUUGAAUGCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGAGAUGC(SEQ ID NO1)AGCCCUCCCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGAAGGGC(SEQ ID NO2)AUGCUUUUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAUGUUCCU(SEQ ID NO3)AAUUCACCCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGGGUUAA(SEQ ID NO4)UUUCUUCUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAUUGUUGG(SEQ ID NO5)。
它们在与存活素的mRNA序列特异性结合时呈现出如图5所示的结构。
本文所用的术语“分离的”在用于核酸时，表示核酸基本上不含其它在天然状态下相关的细胞成分，其最好呈均质状态，但也可以是干的或水溶液。纯度和均一性通常可用分析化学方法如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法来测定。
本文所用的术语“锤头核酶”具有本领域技术人员众所周知的含义，它是仅含约37个核苷酸的单链RNA。
本发明中的核酶可用几种方法获得。例如，直接用化学方法合成DNA序列，然后利用DNA重组技术连接到重组质粒中转录制得。另外，可用PCR技术来扩增RNA(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)。
在得到了所述制得的核酶后，可用本领域技术人员熟知的各种技术，例如Sanger等人的双脱氧链终止法(PNAS，1977，745463-5467)等来进行测序。
本发明另一方面涉及一种重组表达载体，该载体含有一种或多种上述多核苷酸序列以及与所述多核苷酸序列操作性相连的表达调控序列。
本文所用的术语“重组表达载体”指本领域熟知的质粒、粘粒、噬菌体、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体，例如但不局限于，在细菌中表达的基于T7的表达载体；在哺乳动物细胞中表达的pMSXND表达载体和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。然而，本发明范围并不局限于该载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。
这里所用的术语“表达调控序列”通常指参与控制核苷酸序列转录表达的序列。表达调控序列包括与目标核苷酸序列操作性相连的启动子和终止信号。典型的启动子例如有pol III启动子、T7启动子等。“操作性相连”是指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果启动子或增强子增加了编码序列的转录，则它与编码序列是操作性相连的。在上述重组表达载体中也可根据需要加入选择性标记基因。
由于本发明的核酶对存活素基因mRNA的位点有特异性切割活性，而存活素又与细胞凋亡的速度降低呈正相关，因此本发明还涉及一种促进存活素表达过度的细胞凋亡的方法，该方法包括将上述重组表达载体导入所述存活素表达过度的细胞。
所述“存活素表达过度的细胞”通常是真核细胞，更通常的是肿瘤细胞，例如肝肿瘤细胞。
可将多种含有上述相同或不同核酶多核苷酸序列的重组表达载体分别或同时导入存活素表达过度的细胞中。
将上述重组表达载体导入目标细胞的技术是本领域普通技术人员所熟知的的，例如，采用腺病毒和逆转录病毒介导的导入方法。然而，利用其它病毒载体或是利用其它方式来导入上述重组载体对于本领域技术人员来说是显而易见的。
本发明另一方面涉及一种药物组合物，它包含特异性切割存活素编码区61、83、232、294或358位点的核酶或含有该核酶的重组表达载体以及药学上可接受的载体。
在一个较佳的实施方案中，所述特异性切割存活素编码区61、83、232、294或358位点的核酶是锤头型核酶，它具有选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示的多核苷酸序列。存活素编码区61、83、232、294或358位点如图5所示。
本文所用的术语“药学上可接受的”是指当该载体以及组合物适当地给予动物或人时，它们不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。通常，可作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如Tween；润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。
本发明还涉及用上述多核苷酸序列或重组表达载体来制备治疗与存活素过度表达相关的疾病的药物。
在这里，所用的术语“疾病”表示可从上述处理获益的与存活素表达过度有关的任何病征，例如包括癌症。“癌症”是指哺乳动物中以无控制性细胞生长为典型特征的生理性症状。可从本发明获益的癌症例子包括，但不局限于，鳞状细胞癌、肺癌、肠胃癌、胰癌、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳房癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌等。
本发明还有一个方面涉及存活素mRNA编码区61、83、232、294或358位点的应用，所述位点可用来设计或筛选特异性切割存活素RNA的核酶。尽管本发明中仅仅描述了根据存活素mRNA编码区61、83、232、294或358位点来设计合成锤头型核酶，但是本领域技术人员也很容易根据这些位点来设计或筛选其它更复杂的且可能更有效切割这些位点的核酶。
下面结合具体实施例进一步详细描述本发明。本领域技术人员应当理解，这些实施例仅用于描述本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例存活素基因在肿瘤细胞和肿瘤组织样本中的过度表达存活素在肿瘤细胞中的过度表达与所述细胞的高度增殖的特征密切相关。
以肝癌为对象对存活素在肝癌组织，癌旁正常组织以及健康人的正常肝组织细胞中在稳定态RNA水平上的表达RT-PCR的方法进行了比较。
1)RNA的抽提组织RNA的抽提取125-250毫克磨碎的组织，加入2.5毫升Trizol(Gibco)。加入氯仿，剧烈震荡。室温静置5分钟，4℃ 10,000rpm离心15分钟。上清转移到一个无RNA酶的50毫升离心管，加入6毫升异丙醇，在离心管上标记沉淀所在的位置，4℃ 10,000rpm离心10分钟。轻轻倒去上清，用5毫升75％乙醇洗涤。室温下干燥5分钟。加入100微升DEPC水，转移至1.5毫升离心管，-80℃保存。
细胞RNA的抽提取一瓶细胞(T25cm2)，倒去培液，用PBS洗2遍，每瓶细胞中加入0.5毫升Trizol。其余试剂等比例缩小，具体步骤同组织RNA抽提。
2)反转录取RNA 5微克，加入10mM dNTP，OligodT(0.5微克/微升)各1微升，再补加DEPC H2O至总体积为10微升。将Eppendorf管置于65℃，5分钟。然后置于冰上1分钟。在同一管中加入10×缓冲液2微升，0.1mM DTT 2微升，RNase抑制剂1微升。轻轻混匀后置于42℃，2分钟。再加入反转录酶(50U/微升)1微升。置于42℃，50分钟。然后置70℃，15分钟，灭活RTase。所用反转录试剂盒是购自GIBICO的用于第一链cDNA合成的SuperScript预扩增系统。
3)半定量PCR扩增以反转录cDNA为模板，在一个反应体系中同时扩增存活素和β-肌动蛋白(β-肌动蛋白作为内对照)。所使用的引物为β-肌动蛋白上游引物(5’-AAGTACTCCGTGTGGATCGG-3’)(SEQ ID NO6)，下游引物(5’-TCAAGTTGGGGGACAAAAAG-3’)(SEQ ID NO7)，PCR产物为641bp；存活素上游引物(5’-TTTGCCACTGCTGTGTGATT-3’)(SEQ ID NO8)，下游引物(5’-ATTTCTCAGGAACAGCCGAG-3’)(SEQ ID NO9)，PCR产物为372bp。
反应条件为94℃ 3分钟1轮94℃ 30秒60℃ 30秒 25轮72℃ 30秒72℃ 5分钟1轮分别取健康正常人的肝组织、肝癌患者的癌组织及其毗邻的正常肝组织，用上述步骤抽提出细胞/组织中的RNA，反转录并用半定量RT-PCR方法测定RNA在各组织中的表达水平。如图1所示，半定量RT-PCR方法检验的结果表明，正常肝和癌旁组织中的存活素水平远较肝癌组织中低。另外，在包括正常原代的人胚纤维母细胞株在内的多种细胞株中，存活素均有相关水平的表达。
存活素基因特异性核酶表达质粒的构建对存活素基因mRNA序列进行二级结构分析，并根据锤头型核酶特异性切割位点的NUH(N表示任何一种核苷酸，U为尿嘧啶，H表示除G以外的任何一种核苷酸，切点位于H后)规律[5]，在mRNA单链区选择出五个合适的位点(分别为存活素基因编码区61、83、232、294或358位点)。图2中显示了根据能量最低原则来预计的存活素RNA的二级结构，其中候选的5个核酶特异性切割位点位于环状区。
如下所示，设计并合成针对这五个位点的核酶片段。另外，为了构建克隆，还在核酶片段两端分别加上了SalI和PstI酶切位点R1U(5’TCGACCTTGAATGCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAAGAGATGCATGCA3’)(SEQ ID NO10)R1D(5’TGCATCTCTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGCATTCAAGG3’)(SEQID NO11)
R2U(5’TCGACAGCCCTCCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAAGAAGGGCATGCA3’)(SEQ ID NO12)R2D(5’TGCCCTTCTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGGGAGGGCTG3’)(SEQID NO13)R3U(5’TCGACATGCTTTTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAATGTTCCTATGCA3’)(SEQ ID NO14)R3D(5’TAGGAACATTTCGTCCTCACGGACTCATCAGAAAAGCATG3’)(SEQID NO15)R4U(5’TCGACAATTCACCCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAAGGGTTAAATGCA3’)(SEQ ID NO16)R4D(5’TTTAACCCTTTCGTCCTCCTCACGGACTCATCAGGGTGAATTG3’)(SEQ ID NO17)R5U(5’TCGACTTTCTTCTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAATTGTTGGATGCA3’)(SEQ ID NO18)R5D(5’TCCAACAATTTCGTCCTCACGGACTCATCAGAGAAGAAAG3’)(SEQID NO19)将上述合成的核酶片段加磷退火后，连接到pGVaL的SalI和PstI酶切位点中。pGaL质粒的酶切图如图3所示。该质粒具有以下特点，即其中的VAI基因中间加入了一个迴文结构的顺序(loop)，从而使核酶插入其中后，能够得以充分暴露。VAI基因的上游有poll III启动子，该启动子可使该基因有效地在真核细胞中表达。另外，VAI基因地上游还有一个T7启动子，使得在试管内验证该核酶的机制成为可能。
经测序证实后，将重组质粒命名为pGVaL-R1，pGVaL-R2，pGVaL-R3，pGVaL-R4，pGVaL-R5，统称为pGVaL-Rz(图3)。本实验中核酶表达质粒pGVaL-Rz在体外由T7RNA聚合酶转录，而在细胞内则由真核RNA聚合酶III转录。
存活素表达质粒的构建存活素基因片段用RT-PCR方法从BEL7402人肝癌细胞株(购自中国库，上海生化细胞所)cDNA中扩增，PCR引物为上游引物(5’CCGCTCGAGATGGGTGCCCCGACG 3’)(SEQ ID NO20)，下游引物(5’GAAGATCTATCCATGGCAGCCAGCT 3’)(SEQ ID NO21)。
PCR产物经BglII和XhoI消化、纯化后，克隆到pCDNA-HA3载体的同样位点中。pCDNA-HA3载体是是以pcDNA(invitrogen，CA，USA)为基本骨架、在其多克隆位点区中的EcoRI和XhoI之间插入了三个流感病毒血凝素抗原决定簇(HA)多肽序列构建而成的真核细胞表达载体。经测序证实后，存活素基因表达质粒命名为pCDNA-HA-存活素(图4)，简称为HA-Sur。
为了检测的需要，我们将pGL-3 control质粒(Promega，USA)中的萤光素酶片段克隆到HA-Sur的BglII和XbaI位点，形成可表达存活素和萤光素酶融合蛋白的质粒，命名为pCDNA-HA-存活素-荧光素(图4)，简称HA-Sur-Luc。
体外转录1)核酶的体外制备质粒pGVaL-R1，pGVaL-R2，pGVaL-R3，pGVaL-R4，pGVaL-R5经HindIII线性化后，用T7 RNA聚合酶分别进行体外转录。2微克线性质粒，2.5微升10×缓冲液，2.5微升50mM DTT，10单位RNase抑制剂，2.5微升5mMNTPs和50单位T7 RNA聚合酶(Takara)，总体积25微升，37℃反应1小时，再加入20单位DnaseI，37℃10分钟。体外转录产物用无水乙醇沉淀纯化后，溶解于20微升DEPC水中，用RT-PCR方法，以已知量的质粒模板扩增产物为标准，对体外转录产物进行定量，以pGVaL作为对照。
2)目的片段的体外转录质粒HA-Sur和HA-Sur-Luc经Xba I线性化后，体外转录及定量过程同上。
核酶体外切割活性检测取等摩尔数的核酶和目的片段RNA，在50mM Iris(pH7.5)和1mM EDTA条件下，95℃90秒后，立即放入冰中，再加入MgCl2至终浓度10mM，37℃反应1小时，反应总体积10微升。反应结束后，用无水乙醇沉淀，沉淀产物溶于10微升DEPC水，进行下面的检测。
引物延伸实验确定核酶切割位点引物SPE1(5’TGAAGCAGAAGAAACACTGGGCCAAGTCTG 3’)(SEQ ID NO22)，SPE2(5’GCAATTTTGTTCTTGGCTCTTTCTCTGTCCAG 3’)(SEQ ID NO23)，SPE3(5’ATCCATGGCAGCCAGCTGCTCGATG 3’)(SEQ ID NO24)各0.5pm用32P进行5’末端标记。用同样的引物以质粒HA-Sur和HA-Sur-Luc为模板进行测序反应。引物延伸产物和测序产物经6％尿素变性胶电泳，放射自显影分析结果，确定每个核酶在存活素RNA上的切割位点。
如图5(B)所示，引物延伸实验结果表明，经本发明设计的核酶处理过的底物均在预期位置上有切点。这表明这些切割确实是本发明所设计的核酶活性的佐证。
萤光素酶活性检测取3微升HA-Sur-Luc RNA的核酶切割产物进行体外翻译(Rabbit Reticulocyte Lysate System，Promega)，反应总体积10微升。2微升的翻译产物用于检测萤光素酶活性，同时以pGVaL转录产物作为核酶的阴性对照。结果显示在图6(A)中。
Western印迹杂交将存活素RNA分别与5个核酶进行体外切割反应的产物进行体外翻译，方法同上。各2微升体外翻译产物经7.5％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转膜，用抗HA抗体(Santa Cruz，USA)1∶5000检测切割后的存活素表达情况。结果显示在图6(B)中。
萤光素酶活性检测和核酶切割产物经体外翻译后的Western印迹杂交结果均证实上述所得的结果是一致的。
如上所述，本发明所设计和检测的5个核酶中，以1，3和5号的活性最高。所观察到的各单一的核酶仅能部分地切割存活素RNA，可能是以下几个原因所致a，其中仅部分存活素RNA分子呈对某一核酶敏感的二级构象，b，核酶分子的稳定性和效率等等。由于试管内存活素RNA构象与细胞内可能不同，因此本发明者将所有5种核酶分别克隆到逆转录病毒(pFB，Stratagne)或腺病毒载体，以存活素过度表达的肿瘤细胞BEL7402为受体细胞进行核酶效率的检测。
核酶逆转录病毒载体的构建pGVaL-Rz系列质粒经XbaI酶切，用Klenow酶补平，再经MluI酶切后，回收570bp核酶片段(其中包括帮助核酶维持活性结构的vaI、vaII、loop序列)。将此核酶片段克隆至pFB-neo质粒的5’EcoRI(补平)和3’MluI位点，酶切鉴定后，重组质粒命名为pFB-R1，pFB-R2，pFB-R3，pFB-R4，pFB-R5，统称为pFB-Rz。图8中显示了核酶逆转录病毒表达质粒pFB-Rz的示意图。
对照质粒pFB-VaL用同样方法，从pGVaL质粒中切出VaL片段(仅含有vaI、vaII、loop序列)，克隆到pFB-neo质粒中获得。
细胞转染及逆转录病毒病毒颗粒的收获将上述获得的pFB-Rz系列质粒和对照pFB-VaL各10微克用磷酸钙沉淀法转染5×106 PA317细胞，2星期后，用200毫克/毫升G418筛选。扩增转入pFB-Rz和pFB-VaL的PA317细胞克隆，收获细胞培液，用0.22um孔径的滤器过滤，4℃保存。将含病毒上清按10倍梯度稀释，感染NIH3T3细胞，用G418 200毫克/毫升筛克隆，2周后，根据克隆数计算病毒滴度。
细胞内核酶活性检测1)细胞培养及逆转录病毒介导核酶导入用病毒上清10倍稀释液5毫升感染1×106人肝癌细胞BEL7402细胞，并加入硫酸鱼精蛋白(Protamine sulfate)至5微克/毫升，37℃，5％CO2条件下培养24小时后，弃去培养液，换新鲜完全培养液(含10％新生小牛血清，青霉素、链霉素各100U/毫升的DMEM)，继续培养24小时后，收获细胞，用于RT-PCR检测和Western印迹分析。
2)RT-PCR检测存活素在细胞内的表达用Trizol(Gibco)抽提分别转入了5种核酶病毒和对照病毒的BEL7402细胞的总RNA，cDNA制备如前所述。用PCR扩增存活素片段，以β-肌动蛋白作为内参照，引物序列及反应条件同1.3)所述。用Smartview凝胶成像分析系统测定条带灰度，检测五种核酶对存活素mRNA的切割作用及其效率，其结果显示在图9(a)和下表1中。
表1 五种核酶的切割效率
3)Western印迹法检测存活素在细胞内的表达用细胞裂解液裂解收获的BEL7402细胞，细胞总蛋白量用BCA试剂盒(PIERCE)测定。15％的SDS-聚丙烯酰胺胶分离蛋白，用半干法将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用存活素抗体(AlpaDiagnostic International)1∶2000检测存活素表达，用抗PCNA抗体(Santa Cruz)1∶5000检测PCNA表达，作为内参照。分析转入不同核酶的BEL7402细胞中存活素表达情况，其结果显示在图9(b)和表2中。
表2 转入不同核酶的BEL7402细胞中存活素表达情况
核酶腺病毒载体的构建用Stratagene公司的AdeasyTM adenoviral vector system.pGVaL-Rz系列质粒经XbaI酶切，Klenow酶补平，再经HindIII酶切后，回收570bp核酶片段(包括帮助核酶维持活性结构的vaI、vaII、loop序列)。将此核酶片段克隆至pShuttle-CMV质粒的5’SalI(补平)和3’HindIII位点，酶切鉴定后，重组质粒命名为pShuttle-R1，pShuttle-R2，pShuttle-R3，pShuttle-R4，pShuttle-R5，统称为pShuttle-Rz。对照质粒pShuttle-VaL用同样的方法，从pGVaL质粒中切出VaL片段(仅含有vaI、vaII、loop序列)，克隆到pShuttle-CMV质粒中获得。
pShuttle-Rz系列质粒和pShuttle-VaL各1微克经PmeI线性化，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀纯化后，与0.1微克pAdEasy质粒共转E.coli BJ5183电转感受态。克隆用50微克/毫升的卡那霉素筛选。挑取单克隆，抽质粒，用PacI酶切鉴定，所得到的重组质粒命名为pAd-R1，pAd-R2，pAd-R3，pAd-R4，pAd-R5，统称为pAd-Rz，以及对照pAd-VaL。
细胞转染及腺病毒病毒颗粒的收获pAd-Rz系列质粒和对照pAd-VaL各10微克经PacI酶切线性化后，用磷酸钙沉淀法转染5×106HEK293细胞，7-8天后细胞发生病变，收获细胞，反复冻融4次后，离心收集上清。2毫升上清液再用于感染5×106 HEK293细胞，2-3天后收获病毒。为了提高病毒滴度，这一过程需反复4次。用空斑实验测定每种病毒的滴度，同时用PCR方法检测病毒颗粒数。
细胞内核酶活性检测细胞培养及腺病毒介导的核酶导入按MOI为50的比例在人肝癌细胞BEL7402细胞中加入核酶腺病毒，37℃，5％CO2条件下8小时后，弃去培养液，换新鲜的含10％新生小牛血清，青霉素、链霉素各100U/毫升的DMEM，继续培养48小时后，收获细胞，用于RT-PCR检测分析。
用上述相同方法，用RT-PCR检测存活素在细胞内的表达，其结果显示在图10中和下表3中。
表3 存活素在细胞内的表达结果
进行MTT实验检测核酶活性。在96孔板中接种BEL7402细胞4×103/孔，5小时后，按MOI为50的量分别加入不同核酶及对照的腺病毒，每种平行作3孔。8小时后，弃去培养液，换新鲜的DMEM全培液。在37℃，5％CO2的条件下继续培养48小时后，加入30微升MTT溶液(5毫克/毫升)，4小时后，弃去培养液，用100微升DMSO将Formosan结晶完全溶解，加入显色液(0.1M甘氨酸，NaCl，pH10)25微升显色，570nm测OD。重复3次，结果显示在图11中。
本发明中核酶1，3和5在试管内和细胞内均为最有效。这提示在相当程度上试管内的实验结果对有关何种核酶为优有很高的预见力。
虽然，任一有效的核酶并非能够完全抑制存活素的表达，但或许可以通过联合使用2个或更多的核酶来提高疗效。譬如，核酶1，3和5可以串联的方式放入腺病毒，腺相关病毒或逆转录病毒载体中，而用这种含有复合核酶基因的病毒来感染肿瘤细胞，可以通过对细胞中存活素的表达抑制来杀死肿瘤细胞。
下面列出了在本发明中提及的所有参考文献，所有这些文献均纳入本文作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种变化或修改，这些变化或修改均包括在本申请所附权利要求书所限定的范围内。
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序列表<110>上海市肿瘤研究所<120>新的特异性切割存活素的核酶及其药物组合物和应用<130>023028<160>24<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>合成的核酶RNA<400>1cttgaatgct gatgagtccg tgaggacgaa agagatgc 38<210>2<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>合成的核酶RNA<400>2agccctccct gatgagtccg tgaggacgaa agaagggc 38<210>3<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>合成的核酶RNA<400>3atgcttttct gatgagtccg tgaggacgaa atgttcct 38<210>4<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>合成的核酶RNA<400>4aattcaccct gatgagtccg tgaggacgaa agggttaa 38<210>5<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>合成的核酶RNA<400>5tttcttctct gatgagtccg tgaggacgaa attgttgg 38<210>6<211>20<212>DNA<213>引物<400>6aagtactccg tgtggatcgg 20<210>7<211>20<212>DNA<213>引物<400>7tcaagttggg ggacaaaaag 20<210>8<211>20<212>DNA<213>引物<400>8tttgccactg ctgtgtgatt 20<210>9<211>20<212>DNA<213>引物<400>9atttctcagg aacagccgag 20<210>10<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>用于合成核酶R1的上链DNA<400>10tcgaccttga atgctgatga gtccgtgagg acgaaagaga tgcatgca 48<210>11<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>用于合成核酶R1的下链DNA<400>11tgcatctctt tcgtcctcac ggactcatca gcattcaagg 40<210>12<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>用于合成核酶R2的上链DNA<400>12tcgacagccc tccctgatga gtccgtgagg acgaaagaag ggcatgca 48<210>13<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>用于合成核酶R2的下链DNA<400>13tgcccttctt tcgtcctcac ggactcatca gggagggctg 40<210>14<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>用于合成核酶R3的上链DNA<400>14tcgacatgct tttctgatga gtccgtgagg acgaaatgtt cctatgca 48<210>15<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>用于合成核酶R3的下链DNA<400>15taggaacatt tcgtcctcac ggactcatca gaaaagcatg 40<210>16<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>用于合成核酶R4的上链DNA<400>16tcgacaattc accctgatga gtccgtgagg acgaaagggt taaatgca 48<210>17<211>43<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>用于合成核酶R4的下链DNA<400>17tttaaccctt tcgtcctcct cacggactca tcagggtgaa ttg 43<210>18<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>用于合成核酶R5的上链DNA<400>18tcgactttct tctctgatga gtccgtgagg acgaaattgt tggatgca 48<210>19<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc_feature<223>用于合成核酶R5的下链DNA<400>19tccaacaatt tcgtcctcac ggactcatca gagaagaaag 40<210>20<211>24<212>DNA<213>引物<400>20ccgctcgaga tgggtgcccc gacg24<210>21<211>25<212>DNA<213>引物<400>21gaagatctat ccatggcagc cagct 25<210>22<211>30<212>DNA<213>引物<400>22tgaagcagaa gaaacactgg gccaagtctg 30<210>23<211>32<212>DNA<213>引物<400>23gcaattttgt tcttggctct ttctctgtcc ag 32<210>24<211>25<212>DNA<213>引物<400>24atccatggca gccagctgct cgatg 2权利要求
1.一种分离的多核苷酸序列，它编码特异性切割存活素RNA的锤头型核酶，其特征在于，该核酶具有选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ IDNO4或SEQ ID NO5所示的多核苷酸序列。
2.一种重组表达载体，其特征在于，该载体含有权利要求1所述的一种或多种多核苷酸序列以及与所述多核苷酸序列操作性相连的表达调控序列。
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述载体是含有权利要求1所述的一种或多种多核苷酸序列的腺病毒及腺病毒相关病毒表达质粒或逆转录病毒表达质粒。
4.一种促进存活素表达过度的细胞的凋亡的方法，其特征在于，将权利要求2所述的重组表达载体导入所述存活素表达过度的细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，通过腺病毒、腺病毒相关病毒或逆转录病毒介导将所述重组表达载体导入所述细胞。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述存活素表达过度的细胞是肿瘤细胞。
7.一种药物组合物，其特征在于，它包含特异性切割存活素编码区61、83、232、294或358位点的核酶或含有该核酶的重组表达载体以及药学上可接受的载体。
8.权利要求1所述的多核苷酸序列、权利要求2所述的重组表达载体在制备治疗与存活素过度表达相关的疾病的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述与存活素过度表达相关的疾病是癌症。
10.存活素mRNA编码区61、83、232、294或358位点的应用，其特征在于，所述位点可用来设计或筛选特异性切割存活素RNA的核酶。
全文摘要
本发明提供了特异性切割存活素RNA的锤头型核酶，它具有选自SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示的多核苷酸序列。本发明还提供了含有该核酶的重组表达载体、用该载体来促进存活素表达过度的细胞凋亡的方法以及上述核酶或重组表达载体在制备治疗与存活素过度表达相关的疾病的药物中的应用。
文档编号C12N15/63GK1465701SQ0211195
公开日2004年1月7日 申请日期2002年6月5日 优先权日2002年6月5日
发明者朱景德, 倪敏 申请人:上海市肿瘤研究所