专利名称：抗人端粒重复序列结合因子(trf1的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术领域，涉及一种抗人端粒重复序列结合因子单克隆抗体的制备，尤其是涉及抗人端粒重复序列结合因子(TRF133-277)单克隆抗体的制备及应用。
当正常人体细胞的端粒缩短至一定程度时，启动停止细胞分裂的信号。正常人的细胞开始衰老死亡，称之为第一死亡期(M1)或危险期(crisis)。而另一些组织细胞由于癌基因、抑癌基因p53和Rb的突变等能逃逸M1期，获得一定的额外增殖能力，进入第二死亡期(M2)。此时端粒酶仍为阴性，端粒进一步缩短。大部分细胞寿命达到极限而死亡，而生存下来的细胞具有无限增殖的能力，端粒酶检测阳性，成为永生化细胞。
研究表明，端粒序列的复制依赖与一种特殊的DNA聚合酶即端粒酶(telomerase)的作用。该酶是由RNA和蛋白质组成的一种核糖核蛋白复合物(RNP)。目前研究普遍认为通常DNA复制后，起始复制的RNA引物被降解，引物段留下的空缺有上游引物延伸合成的DNA序列填补替代。但与模板3’端配对的引物降解后，则没有上游引物延伸序列填补。因此，DNA每复制一次，其子链即缩短一次。经若干次分裂周期后，当染色体端粒缩短至临界长度时，细胞即进入“程序性死亡”。但癌细胞则是在某些机制的作用下启动端粒酶表达而使染色体端粒稳定地维持在一定长度，从而使癌细胞得以持续增殖、转移并获得永生化。
研究表明有超过85％的恶性肿瘤，其端粒酶活性高于正常组织，而且增高的程度与疾病预后有关。目前，人们已克隆的人端粒酶基因组密码，主要有人端粒酶RNA部分(telomerase RNA component hTR)、人端粒酶逆转录酶(telomerasereverse transcriptase hTERT)及端粒酶相关结合蛋白(telomerase-associatedprotein TEP1)。1995年Chong首次在Science杂志报道了人端粒重复序列结合因子(Telomere Repeat Binding Factor hTRF)，并克隆了cDNA序列。迄今为止，人们已发现的端粒重复序列结合因子有TRF1、TRF2、tankyrase、PinX等，它们与细胞周期、细胞恶变、衰老等有关。现已明确hTRF1全长为439个氨基酸，羧基端与Myb原癌基因DNA结合区同源，具有HTH(helix-turn-helix)结构，称Myb区。蛋白质的中间约包含200个氨基酸，比较保守，称TRF特异保守区。TRF1蛋白可特异地结合于端粒TTAGGG重复片断。近年来，国外对TRF的结构和及相关基因进行了大量的研究，现一般认为TRF1通过抑制端粒酶活性而起负调控作用。在体外实验中，Elizabeth等发现TRF1蛋白也参与了端粒长度的调节，它通过与DNA双链的结合而阻断了端粒C末端的合成，从而起到使端粒逐渐缩短，维持正常的细胞周期的作用。有研究表明，在急性白血病中TRF1和TRF2 mRNA的表达明显低于正常细胞。对HL-60细胞株应用肿瘤坏死因子471和全反式维甲酸促其分化，随着细胞分化，端粒酶活性明显降低，TRF1和TRF2mRNA的表达增加。2000年，Aragona等应用TRF1多克隆抗体对消化道肿瘤进行免疫组织化学染色，结果发现，TRF1的表达在恶性肿瘤中的表达明显低正常、炎症组织及良性肿瘤；次年，Aragona等对颅脑肿瘤进行了检测，也得到了相同的实验结果。
但迄今为止，对抗TRF1单克隆抗体的研究国内外均未见报道。同时，对TRF1蛋白表达也仅有少数的应用抗TRF1多克隆抗体进行免疫组织化学定性研究的报道，而无定量检测的报道。
本发明目的通过以下方案实现运用杂交瘤技术，以谷胱甘肽S转移酶-端粒重复序列结合因子133-277(GST-TRF133-277)融合蛋白为抗原，制备抗人端粒重复序列结合因子(TRF133-277)单克隆抗体，并应用该单抗作Western-blot及免疫组化对临床标本进行检测。
本发明的抗人端粒重复序列结合因子(TRF133-277)单克隆抗体的制备主要有以下步骤①以GST-TRF133-277融合蛋白免疫Balb/c小鼠后予细胞融合，融合时脾细胞数量为1.38×108个，骨髓瘤细胞数量为3.0×107个。
②细胞融合后，接种于96孔板，共接种192孔，融合率达98％。以TRF1蛋白包被作ELISA筛选阳性克隆细胞，获得一株杂交瘤细胞株，部分液氮冻存，部分进行有限稀释克隆化培养，连续亚克隆3次，第3次亚克隆阳性反应率达100％。此株杂交瘤细胞液氮冻存一年，复苏后仍生长良好，并能持续稳定分泌单克隆抗体。
③诱生腹水，杂交瘤细胞株(1×104～1×105/只)接种Balb/c小鼠腹腔诱生腹水，约2周后采集腹水，均呈血性。
本发明的抗人端粒重复序列结合因子(TRF133-277)单克隆抗体的一个应用是以TRF1单克隆抗体对临床标本作组织免疫印迹法(Western-blot)，设纯化GST蛋白为阴性对照，纯化的TRF1为阳性对照，结果显示TRF1单克隆抗体对TRF1蛋白具有高度特异性，可用于定量检测组织细胞表达的TRF1蛋白。
本发明的抗人端粒重复序列结合因子单克隆抗体的另一个应用是用TRF1单克隆抗体对临床待检组织标本作免疫组织化学法，不经胰酶及微波修复，直接进行染色(Envision法)，一抗为1∶100稀释的抗TRF1单克隆抗体，可用于检测肿瘤细胞表达的TRF1蛋白。
图2为正常及急性白血病骨髓细胞、肠癌组织及近旁正常组织提取蛋白的Western-blot分析图。
图3为组织细胞免疫组化染色图。
(2) 细胞、动物和组织样本 Balb/c小鼠(雌性，20g，8-12W)购自上海必凯实验动物中心，SP2/0小鼠骨髓瘤细胞(浙江大学医学院传染病研究所惠赠)，正常及急性白血病骨髓和大肠癌组织取自浙江大学医学院附属第一医院临床标本。
(3) 小鼠免疫、细胞融合及克隆化培养 以纯化的GST-TRF133-277融合蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠，时间为第0、28、42天，所用总蛋白量为20-50ug。初次免疫用完全福氏佐剂与抗原1∶1制成乳状液，皮内多点接种Balb/c小鼠；加强免疫用抗原加福氏不完全佐剂皮下多点注射，2周后接种纯抗原，共接种3次。末次免疫后3天，无菌取Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0在50％聚乙二醇作用下进行细胞融合，融合时脾细胞数量为1.38×108个，骨髓瘤细胞数量为3.0×107个。细胞融合后，接种于96孔板，共接种192孔，融合率达98％。用含20％小牛血清的HAT选择性培养基培养。细胞融合第10天，以纯化的TRF1蛋白为抗原，作ELISA间接法检测培养上清液中的抗体，选取OD值最大的分泌抗体的杂交瘤细胞培养孔，部分液氮冻存，部分予以有限稀释克隆化培养，直到克隆化细胞抗体阳性率为100％。
(4) 杂交瘤细胞染色体检测 细胞培养至对数期，弃原培养液，换含秋水仙素至终浓度0.3ug/ml的培养基，经低渗处理，加入37℃预热的0.075mol/L的KCL溶液，37℃30min后离心收集细胞，滴片，自然干燥后Giemsa染色，计数分析。
(5) 诱生腹水 给Balb/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml/鼠。1-2周后，将扩大培养的阳性杂交瘤细胞以无血清1640细胞培养液重悬，接种到经石蜡预处理过的Balb/c小鼠腹腔(1×104～1×105/只)，1-2周后收集腹水，均呈血水，离心后取上清，冻存于-80℃。
(6) 抗TRF1 单抗腹水效价检测及亚类鉴定 TRF1重组蛋白(5ug/ml)每孔0.1ml包被酶标板作ELISA间接法检测抗体滴度。一抗为经倍比稀释的腹水，二抗为1∶800稀释的羊抗鼠IgG/HRP，经显色液显色，450nm测定光密度。抗体亚类取杂交瘤细胞培养上清以单抗亚类试剂盒确定。抗TRF1单抗效价为1∶3200。TRF1单克隆抗体亚类取杂交瘤细胞株培养上清确定，属IgG1亚类。参见
图1。
实施例2 组织蛋白提取及免疫印迹法(Western-blot)正常人及急性白血病患者骨髓经淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，大肠癌组织及近旁正常组织经超声粉碎离心取上清，测定蛋白浓度。细胞和组织提取的总蛋白取20ug作10％SDS-PAGE电泳(200V)、电转移至硝酸纤维素膜(100V，1小时)，以含7％脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭后，在制备的抗TRF1单克隆抗体中室温反应30min，4℃过夜，洗膜，在羊抗鼠IgG/HRP中反应1小时，TBST洗膜2小时。ECL温浴1min，X光胶片感光，显影，定影。并设纯化GST蛋白为阴性对照，纯化TRF1蛋白为阳性对照。
结果显示上述正常人及白血病骨髓细胞、大肠癌组织及近旁正常肠粘膜组织样本均于约60KD处呈一条阳性带，与阳性对照纯化TRF1蛋白处于同一水平，而纯化GST样本孔显示阴性结果，表明TRF1单抗仅针对TRF1蛋白，具有高度的特异性，且与其计算分子量基本一致。可用于检测组织细胞表达的TRF1蛋白。参见图2，其中1纯化GST蛋白；2纯化TRF1蛋白；3正常肠粘膜组织；4大肠癌组织；5正常人骨髓细胞；6急性白血病患者骨髓细胞。
实施例3 免疫组织化学 正常及白血病骨髓细胞、大肠癌组织及近旁正常粘膜组织切片应用抗TRF1单克隆抗体作免疫组化染色，不经胰酶及微波修复，直接进行染色(Envision法)，一抗为1∶100稀释的抗TRF1单克隆抗体。
结果大肠正常粘膜组织上皮细胞、正常及急性白血病骨髓细胞、大肠癌组织细胞的胞浆呈阳性着色，但大肠正常粘膜组织上皮细胞及正常骨髓细胞阳性率明显高于肿瘤组织，部分肿瘤细胞细胞浆无着色，细胞核和组织间质呈阴性反应。参见图3。
应用抗TRF1单克隆抗体作免疫组化检测临床组织样本，结果表明TRF1蛋白定位于骨髓造血细胞及大肠上皮组织的细胞浆，为细胞浆蛋白。免疫组化结果还显示TRF1蛋白在正常组织与肿瘤组织中均有表达，但存在明显差别，正常大肠组织上皮细胞及正常骨髓细胞阳性率明显高于肿瘤组织，这可能与TRF1对端粒酶的负调控作用有关，此结果与Aragona等报道的应用TRF1多抗检测临床标本的研究结果相同。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.抗人端粒重复序列结合因子(TRF133-277)单克隆抗体的制备及应用，运用杂交瘤技术，以蛋白为抗原，制备单克隆抗体，其特征是以GST-TRF133-277融合蛋白为抗原，制备抗人端粒重复序列结合因子(TRF133-277)单克隆抗体，并建立了应用该单抗作Western-blot及免疫组化检测临床标本的方法。
2.根据权利要求1所述的抗人端粒重复序列结合因子(TRF133-277)单克隆抗体的制备方法，其特征是由以下步骤实现①以GST-TRF133-277融合蛋白免疫Balb/c小鼠后予细胞融合，融合时脾细胞数量为1.38×108个，骨髓瘤细胞数量为3.0×107个；②细胞融合后，接种于96孔板，共接种192孔，融合率达98％。以TRF1蛋白包被作ELISA筛选阳性克隆细胞，获得一株杂交瘤细胞株，部分液氮冻存，部分进行有限稀释克隆化培养，连续亚克隆3次，第3次亚克隆阳性反应率达100％。此株杂交瘤细胞液氮冻存一年，复苏后仍生长良好，并能持续稳定分泌单克隆抗体；③诱生腹水，杂交瘤细胞株(1×104～1×105/只)接种Balb/c小鼠腹腔诱生腹水，约2周后采集腹水，均呈血性。
3.根据权利要求1所述的抗人端粒重复序列结合因子(TRF133-277)单克隆抗体的应用，其特征是以TRF1单克隆抗体对临床标本作组织免疫印迹法(Western-blot)，以纯化GST蛋白为阴性对照，纯化的TRF1为阳性对照，结果显示TRF1单克隆抗体对TRF1蛋白具有高度特异性，可用于检测组织细胞表达的TRF1蛋白。
4.根据权利要求1所述的抗人端粒重复序列结合因子(TRF133-277)单克隆抗体的应用，其特征是应用TRF1单克隆抗体，对临床待检组织标本作免疫组织化学法检测，不经胰酶及微波修复，直接进行染色(Envision法)，一抗为1∶100稀释的抗TRF1单克隆抗体，可用于检测肿瘤细胞表达的TRF1蛋白。
全文摘要
一种抗人端粒重复序列结合因子(TRF文档编号C12P21/08GK1464064SQ0211200
公开日2003年12月31日 申请日期2002年6月7日 优先权日2002年6月7日
发明者黄河, 施继敏, 陈巧芳 申请人:浙江大学医学院附属第一医院