一种新的青霉素g酰化酶及其应用的制作方法

专利名称：一种新的青霉素g酰化酶及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及新的黄杆菌青霉素G酰化酶及其编码序列。本发明还涉及此青霉素G酰化酶的制法和用途。
背景技术：
青霉素G酰化酶在碱性条件下催化青霉素G水解生成母核(6-APA)和侧链苯乙酸，母核6-APA是半合成青霉素的原料；在酸性条件下催化母核6-APA和侧链苯乙酸生成青霉素G。因此青霉素G酰化酶是半合成青霉素工业生产中一种非常重要的酶。
青霉素G酰化酶多存在于细菌，酵母甚至真菌中。青霉素G酰化酶是由一个无活性的前体肽经过剪切加工，形成有活性的由大小不同的二个亚基组成的分子量在80KD左右的异源二聚体。
青霉素G酰化酶基因的表达无论是在原始菌株或者是重组的大肠杆菌中都受到许多因素的调节。青霉素G酰化酶基因的表达对温度很敏感，在高于33℃条件下生长时，表达的蛋白大多为没有活力的前体，22-25℃是产酶的最好温度。但是22℃情况下菌体的生长量较低，因此总酶活不高。工业上为了提高总酶活，采取变温处理，在28℃下培养菌体，然后在转移到22℃产酶，这给工业生产带来不便。另外，许多来源的青霉素G酰化酶基因的表达都必须有苯乙酸的诱导，在这些青霉素酰化酶基因的内部存在调节基因，调节基因编码阻遏蛋白抑制青霉素G酰化酶基因的表达。只有在培养基中加入苯乙酸，通过苯乙酸和阻遏蛋白结合，从而使得青霉素G酰化酶基因得以表达。由于苯乙酸有较强的酸性，对菌体的生长存在抑制作用，苯乙酸也产生较强的气味，因此给工业生产带来许多不便。
因此，本领域迫切需要开发新的青霉素G酰化酶，所述的青霉素G酰化酶的基因表达不依赖于苯乙酸的诱导和/或所述青霉素G酰化酶的基因表达对低温的依赖性也下降。

发明内容
本发明的目的是提供一种新的青霉素G酰化酶蛋白以及其片段、类似物和衍生物。所述的青霉素G酰化酶基因的表达不依赖于苯乙酸的诱导，并且所述青霉素G酰化酶基因表达对低温的依赖性也下降。
本发明的另一目的是提供编码所述青霉素G酰化酶的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产所述青霉素G酰化酶的方法以及该多肽和编码序列的用途。
在本发明的第一方面，提供了一种分离的青霉素G酰化酶，它包含α亚基和β亚基，其中所述的α亚基含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物；所述的β亚基含有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
较佳地，所述的青霉素G酰化酶，所述的α亚基含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列；且所述的β亚基含有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核昔酸序列编码本发明的青霉素G酰化酶。
较佳地，该多核苷酸编码含有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的α亚基和含有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的β亚基。更佳地，该多核苷酸的序列含有SEQ ID NO1和SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
在本发明的第三方面，提供了一种含有本发明上述的多核苷酸的载体。
在本发明的第四方面，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，它含有本发明上述的载体，或者含有青霉素G酰化酶的编码序列。
在一优选例中，上述的宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli.)JM109/pPGACGMCC No.0745。
在本发明的第五方面，提供了一种青霉素G酰化酶的制备方法，该方法包含(a)在适合表达青霉素G酰化酶的条件下，培养本发明上述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出青霉素G酰化酶。
在本发明的第六方面，提供了一种生产青霉素G的方法，它包括步骤(a)在酸性条件下，在反应体系中，用青霉素G酰化酶催化青霉素母核6-APA与侧链苯乙酸形成青霉素G，所述的青霉素G酰化酶包含α亚基和β亚基，其中所述的α亚基含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，所述的β亚基含有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列；(b)从反应体系中分离出青霉素G。
在本发明的第七方面，提供了一种生产青霉素母核6-APA的方法，它包括步骤
(a)在碱性条件下，在反应体系中，用青霉素G酰化酶催化青霉素G分解形成母核6-APA与侧链苯乙酸，所述的青霉素G酰化酶包含α亚基和β亚基，其中所述的α亚基含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，所述的β亚基含有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列；(b)从反应体系中分离出青霉素母核6-APA。


下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了青霉素G酰化酶催化的反应。
图2显示了带有本发明青霉素G酰化酶基因的质粒。
图3A和3B分别显示了本发明青霉素G酰化酶的DNA和氨基酸序列，其中箭头处为α亚基和β亚基的切割位点，切割后前半部分为α亚基，后半部分为β亚基。
图4显示了纯化的本发明青霉素G酰化酶的电泳照片。
具体实施例方式
本发明人经过深入而广泛的研究，分离出了一种新型的青霉素G酰化酶基因。该青霉素G酰化酶基因呈组成型表达，不必苯乙酸诱导，而且，该青霉素G酰化酶基因的表达对低温度的依赖也有所减弱，其最适的产酶温度是28℃。在此基础上完成了本发明。
在本发明中，术语“青霉素G酰化酶蛋白”、“青霉素G酰化酶多肽”或“青霉素G酰化酶”可互换使用，都指由青霉素G酰化酶α亚基(氨基酸序列如SEQ IDNO2所示)和β亚基(氨基酸序列如SEQ ID NO4所示)构成的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。
如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，“分离的青霉素G酰化酶”是指青霉素G酰化酶基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化青霉素G酰化酶蛋白。基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。
本发明还包括黄杆菌青霉素G酰化酶蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然黄杆菌青霉素G酰化酶蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语“黄杆菌青霉素G酰化酶”还包括具有与黄杆菌青霉素G酰化酶蛋白相同功能的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括黄杆菌青霉素G酰化酶蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与黄杆菌青霉素G酰化酶DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗黄杆菌青霉素G酰化酶多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了黄杆菌青霉素G酰化酶多肽的活性片段。通常，该片段具有黄杆菌青霉素G酰化酶多肽各亚基序列的至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
发明还提供黄杆菌青霉素G酰化酶蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然黄杆菌青霉素G酰化酶多肽的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的多肽的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中，“黄杆菌青霉素G酰化酶蛋白保守性变异多肽”指与SEQ ID N02的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。对于α和β亚基而言，编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ IDNO1和3所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”对于α亚基而言，在本发明中是指编码具有SEQ ID NO2的蛋白质，但与SEQ ID NO1所示的编码区序列有差别的核酸序列。对于β亚基而言，在本发明中是指编码具有SEQ ID NO4的蛋白质，但与SEQ ID NO3所示的编码区序列有差别的核酸序列。
编码SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码青霉素G酰化酶蛋白的多核苷酸。
本发明的黄杆菌青霉素G酰化酶核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列(SEQ ID NO5)，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用按常规方法所提取的黄杆菌DNA或DNA文库作为模板，扩增而得有关序列。一种引物例子是对应于SEQ ID NO5中5′端和3′端序列的引物。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或青霉素G酰化酶蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；2241431)，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的青霉素G酰化酶多肽。一般来说有以下步骤(1).用本发明的编码黄杆菌青霉素G酰化酶多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
本发明中，黄杆菌青霉素G酰化酶多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、酵母质粒、植物细胞病毒、或其他载体。在本发明中适用的载体包括但不限于在细菌中表达的基于T7的表达载体(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)，和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含黄杆菌青霉素G酰化酶编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；动物细胞，如CHO、COS、293细胞等。
本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
另一方面，本发明还包括对黄杆菌青霉素G酰化酶具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于黄杆菌青霉素G酰化酶基因产物或片段。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的黄杆菌青霉素G酰化酶基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达黄杆菌青霉素G酰化酶蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。
本发明的青霉素G酰化酶蛋白或多肽有多方面的用途。一种直接用途是用于制备青霉素G，另一种直接用途是制备青霉素母核6-APA。由于本发明的该青霉素G酰化酶基因具有以下优点(1)组成型表达，不必苯乙酸诱导；(2)对低温度的依赖性低，最适的产酶温度是28℃，
因此，本发明的青霉素G酰化酶具有广阔的应用前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1黄杆菌(Flavobacterium sp.650)的培养和总DNA的提取50毫升LB液体培养基(每升培养基含10克酵母粉，5克蛋白胨和10克氯化钠，pH 7.0)接种一个单菌落黄杆菌(Flavobacterium sp.650)，28℃培养24小时。5000转/分钟离心10分钟以收集菌体，悬浮菌体于15毫升TE中，加入蛋白酶K和SDS使终浓度分别为100微克/毫升和0.5％。混匀后于37℃放置过夜至悬浮液变透明。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)，缓慢的混匀后12000转/分钟离心20分钟，用大口的移液管取出上清，再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇抽提，反复抽提直到离心后上下层间没有白色的物质。取出上清加入1/10体积的3摩尔/升的醋酸钠，混匀，再加入2倍体积的无水乙醇，混匀以使DNA析出。用干净的玻璃钩子钩出DNA，将其放入70％乙醇中漂洗，取出DNA，室温放置以使乙醇挥发干净，将DNA溶于1毫升TE。于4℃保存。
实施例2黄杆菌(Flavobacterium sp.650)青霉素G酰化酶基因的克隆取2微克实施例1中提取的Flavobacterium sp总DNA，在40微升的反应体系中，加入限制性内切酶Sau 3AI和相应的反应缓冲液进行部分酶切，反应过程中每次取1微升样用0.8％的琼脂糖凝胶电泳观察酶切的程度，当酶切的片段集中在4-10kb时终止反应，将所有的反应液加入琼脂糖凝胶的加样孔中进行电泳，割下含有4-10kb的DNA片段的凝胶，利用华舜公司生产的凝胶回收柱将凝胶中的DNA片段回收到4微升的TE中。
按照《分子克隆实验指南》中碱裂解法小量抽提质粒的方法，提取质粒载体pBSKS(-)(一种常用载体)并用氯化铯-溴化乙锭超离心纯化超螺旋质粒。将纯化的超螺旋质粒100纳克在20微升的反应体系中用过量的BamHI酶切完全后，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳分离，割下含有大小为3.4kb的线性化的载体的凝胶，利用华舜公司生产的凝胶回收柱将凝胶中的DNA片段回收到17微升的无菌的重蒸水中。在这17微升溶液中加1单位的小牛碱性去磷酸化酶和2微升的去磷酸化酶的缓冲液，37℃放置5分钟，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇抽提二次，取出上清加入1/10体积的3M的醋酸钠，混匀，再加入2倍体积的无水乙醇，混匀后冰上放置30分钟，离心回收DNA，70％乙醇洗后，室温放置以使乙醇挥发干净，将DNA溶于1微升的TE。
按照Takara公司提供的连接酶的说明，将回收的总染色体的sau3A I部分酶切片段和载体进行连接。连接产物加入1/10体积的3摩尔/升的醋酸钠，混匀，再加入2倍体积的无水乙醇，混匀后冰上放置30分钟，离心回收DNA，70％乙醇洗后，室温放置以使乙醇挥发干净后，加20微升制备的大肠杆菌JM109电击感受态，将这20微升大肠杆菌JM109电击感受态和连接产物的混合物转移到特制的电击杯中，在Bio-Rad公司的基因枪上进行电击转化，然后加入800微升的LB，并于37度培养45分钟以复苏细胞，然后将所有的培养液按每个平板100微升涂布于8个含有合适浓度的氯霉素，X-gal和IPTG的LB平板上，37℃培养16-20小时，得到黄杆菌的基因组文库。
将基因组文库中的白色菌落转接到含有1毫克/毫升的2-硝基-5-苯乙酰胺苯甲酸(NIPAB)的LB平板上，33℃培养24小时后，仔细观察平板上菌落周围有无黄颜色出现。青霉素G酰化酶阳性克隆水解NIPAB，底物呈现易于观察的黄颜色。
将筛选到的青霉素G酰化酶阳性克隆的重组质粒提取出后，用限制性内切酶分析其大小，选取插入片段最小的质粒pPGA(图2)用于测定外源DNA的序列，测序由上海联合基因公司进行。
测定的DNA序列用BioEdit和GCG软件分析得到完整的青霉素G酰化酶的编码序列，它有2589个核苷酸组成，编码862个氨基酸(图3)。它和来源于Providencia rettgeri，Escherichia coli，Kluyvera cryocrescens和Bacillusmegaterium的青霉素G酰化酶的氨基酸同源性分别为52％，51％，52％和28％。
本发明的青霉素G酰化酶由α亚基和β亚基构成。其中，α亚基的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO1和2所示，β亚基的核苷酸序列和氨基酸序列如SEQ ID NO3和4所示。
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青霉素G酰化酶基因工程菌大肠杆菌(Escherichia coli.)JM109/pPGA于2002年5月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCC No.0745。
实施例4苯乙酸对青霉素G酰化酶基因工程菌JM109/pPGA中青霉素G酰化酶基因表达的影响在LB培养基中添加不同浓度的苯乙酸(浓度为0，0.05％，0.1％，0.2％，0.4％(W/V％)，用氢氧化钠溶液调节使培养基最终的pH为7.0)，平行三份，都按1％的接种量接种后，分别在22℃、28℃、37℃培养，并在接种后的12，24，36，48小时从每个摇瓶中取样测定菌体浓度和青霉素G酰化酶的活力，计算比活力。
结果在同一个温度下，苯乙酸(PAA)的初始浓度越高，菌体的青霉素G酰化酶的比活力越低。比活最高的为在28℃培养且不加PAA的摇瓶。因此，该青霉素G酰化酶基因呈组成型表达，不必苯乙酸的诱导；与其它来源的青霉素G酰化酶基因的最佳表达温度在22-25℃相比，该青霉素G酰化酶基因的表达对低温度的依赖也有所减弱，其最适的产酶温度是28℃。
实施例5重组的青霉素G酰化酶的纯化接种JM109/pPGA单菌落到含有34微克/毫升的50毫升LB液体培养基中，28℃培养24小时，即为种子培养液。然后按1％的接种量转接到装有1000毫升LB的5000毫升的三角瓶中，于28℃180转/分钟震荡培养48小时，然后8000转/分钟离心5分钟，以收集菌体。
将收集的重组大肠杆菌菌体经磷酸缓冲液(0.1摩尔/升，pH 8.0)洗涤后再分散于100毫升磷酸缓冲液中，并于4℃条件下，用French Pressure Cell Press破碎细胞。破碎液经12000转/分钟离心15分钟去除菌体碎片。上清液中的青霉素G酰化酶用50％(NH3)2SO4沉淀，离心收集沉淀的蛋白。用少量的1摩尔/升(NH3)2SO4/0.01摩尔/升磷酸缓冲液溶解蛋白，离心20分钟，弃去不溶物后，上清上Phenyl-Sepharose层析。流动相A0.01摩尔/升磷酸缓冲液(pH 8.0)；流动相B1摩尔/升(NH3)2SO4，0.01摩尔/升磷酸缓冲液，线性降落梯度洗脱，分步收集洗脱液。用NIPAB检测洗脱液中青霉素G酰化酶的酶活。收集有活性的洗脱液，于4℃用PEG20000浓缩到体积足够小，于4℃对0.01摩尔/升pH 8.0的磷酸缓冲液充分透析。充分透析后的蛋白溶液经12000转/分钟离心去除不溶物，上清上Q Sepharaose层析。流动相A0.01摩尔/升磷酸缓冲液(pH 8.0)，流动相B0.5摩尔/升NaCl、0.01摩尔/升磷酸缓冲液，线性升梯度洗脱。收集有活性的洗脱液，于4℃用PEG20000浓缩到体积足够小，离心去除不溶物，上分子筛Superdex 75(Ampharmacia)流动相0.05摩尔/升磷酸缓冲液(pH 8.0)。活性洗脱液用PEG20000浓缩，SDS-PAGE检测其纯度和亚基组成。
结果表明，该青霉素G酰化酶由一个62kD的大亚基和一个25kD的小亚基组成(图4)。
实施例6
青霉素G酰化酶用于水解青霉素G产生青霉素母核6-APA反应式见图1。反应体系用0.1摩尔/升pH7.5磷酸盐缓冲液，青霉素G(钾盐)为5毫克/毫升，酶浓度为0.5毫克/毫升，于37℃保温5分钟。取样加入等体积反应终止液(20％冰醋酸∶0.05MNaOH＝2∶1(体积比))和1/2体积的显色剂(0.5％对-二甲氨基甲醛乙醇溶液)，于415nm比色。酶活力的计算方法按37℃ pH7.5每分钟分解青霉素G产生1微摩尔的6-APA所需要的酶量定义为一个酶活力单位。
结果表明，本发明实施例5中获得的青霉素G酰化酶的催化活性为48.5活力单位/毫克蛋白。
实施例7青霉素G酰化酶利用青霉素母核6-APA和苯乙酸合成青霉素G反应式见图1。在45％PEG600的100毫摩尔/升pH 6.0的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中，青霉素G酰化酶1毫克，6-APA和苯乙酸初始浓度均为30毫摩尔/升。混匀后于20℃振摇。一小时后取样测定6-APA减少的量。一个单位的酶活定义为20℃、pH 6.0每分钟消耗微摩尔的6-APA所需要的酶量。比活定义为每毫克蛋白的酶活。
结果表明，本发明实施例5中获得的青霉素G酰化酶的催化活性为0.8单位/毫克蛋白。
菌种的保藏本发明的青霉素G酰化酶基因工程菌大肠杆菌(Escherichia coli.)JM109/pPGA于2002年5月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京)，保藏号为CGMCC No.0745。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国科学院上海植物生理研究所<120>一种新的青霉素G酰化酶及其应用<130>023316<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>915<212>DNA<213>黄杆菌(Flavobacterium sp.)<220><221>CDS<222>(1)..(915)<223><400>1atg aag cag cat gtg ttg tcg gcc gcc ctg gtg gcg gcc tgt tcc tgc 48Met Lys Gln His Val Leu Ser Ala Ala Leu Val Ala Ala Cys Ser Cys1 5 10 15ctg ccc gcg atg gcg caa ccc gtg gcg caa gcc gcg ggc cag gag tcc 96Leu Pro Ala Met Ala Gln Pro Val Ala Gln Ala Ala Gly Gln Glu Ser20 25 30gcg gcc gtc gcg gct ccg gcg caa ggc gcc gcc ggc aag gtc acg atc 144Ala Ala Val Ala Ala Pro Ala Gln Gly Ala Ala Gly Lys Val Thr Ile35 40 45cgg cgc gac gcc cat ggc atg ccg cac gtc tac gcc gac acg gtg tac 192Arg Arg Asp Ala His Gly Met Pro His Val Tyr Ala Asp Thr Val Tyr50 55 60ggc att ttc tac ggc tac ggt tac gcg gtg gcg cag gac cgg ctg ttc 240Gly lle Phe Tyr Gly Tyr Gly Tyr Ala Val Ala Gln Asp Arg Leu Phe65 70 75 80cag atg gag atg gcg cgg cgc agc acc cag ggc cgg gtg gcc gaa gtg 288Gln Met Glu Met Ala Arg Arg Ser Thr Gln Gly Arg Val Ala Glu Val85 90 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权利要求
1.一种分离的青霉素G酰化酶，其特征在于，它包含α亚基和β亚基，其中所述的α亚基含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物；所述的β亚基含有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列，或其保守性变异多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
2.如权利要求1所述的青霉素G酰化酶，其特征在于，所述的α亚基含有SEQ IDNO2所示的氨基酸序列；且所述的β亚基含有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列。
3.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列编码权利要求1所述青霉素G酰化酶。
4.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码含有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的α亚基和含有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的β亚基。
5.如权利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的序列含有SEQ IDNO1和SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
6.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的多核苷酸。
7.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6所述的载体。
8.一种青霉素G酰化酶的制备方法，其特征在于，该方法包含(a)在适合表达青霉素G酰化酶的条件下，培养权利要求7所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出青霉素G酰化酶。
9.一种生产青霉素G的方法，其特征在于，它包括步骤(a)在酸性条件下，在反应体系中，用青霉素G酰化酶催化青霉素母核6-APA与侧链苯乙酸形成青霉素G，所述的青霉素G酰化酶包含α亚基和β亚基，其中所述的α亚基含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，所述的β亚基含有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列；(b)从反应体系中分离出青霉素G。
10.一种生产青霉素母核6-APA的方法，其特征在于，它包括步骤(a)在碱性条件下，在反应体系中，用青霉素G酰化酶催化青霉素G分解形成母核6-APA与侧链苯乙酸，所述的青霉素G酰化酶包含α亚基和β亚基，其中所述的α亚基含有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列，所述的β亚基含有SEQ ID NO4所示的氨基酸序列；(b)从反应体系中分离出青霉素母核6-APA。
全文摘要
本发明提供了一种新型的青霉素G酰化酶及其编码序列。该青霉素G酰化酶基因组成型表达，不必苯乙酸诱导，苯乙酸对该基因的表达有抑制作用；该青霉素G酰化酶基因的表达对低温度的依赖也有所减弱，其最适的产酶温度是28℃。本发明还提供了该青霉素G酰化酶的制法和用途。
文档编号C12N15/63GK1464055SQ0211206
公开日2003年12月31日 申请日期2002年6月14日 优先权日2002年6月14日
发明者姜卫红, 赵国屏, 杨蕴刘, 朱颂成 申请人:中国科学院上海植物生理研究所