棉花中一种花药特异性启动子(cofs)的分离和鉴定的制作方法

专利名称：棉花中一种花药特异性启动子(cofs)的分离和鉴定的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物分子生物学领域。特别地，本发明涉及棉花启动子及其在产生转基因植物中的应用，特别涉及棉花花药特异性启动子。
2.发明背景棉花是纺织工业中应用最广泛的天然纤维。世界范围的棉花年产量超过100百万包，价值450亿美元。在过去的十年里尽管依靠传统培育在棉花品质和产量上已经明显改良，但由于品种相容性和可用性状的需求，通过传统培育进一步改良棉花性质受到限制。遗传工程提供了进一步改良棉花的新方法，通过导入基因产生具有高所需性状例如虫害抗性的新生殖质。
花药是开花植物中雄性生殖器官。花药发育可以分为两个一般阶段。在第一阶段，大多数特化细胞和组织分化，小孢子母细胞减数分裂及小孢子四分体形成。在第二阶段，小孢子从四分体中释出随后花粉粒成熟，组织退化，开裂及释出花粉。在少量植物物种中已经研究了在花药和花粉发育期间特异性表达的基因。Allen和Lonsdale，植物杂志3261-271，1993；Bird等，植物分子生物学11651-662，1988；Brown and Crouch，植物细胞2263-274，1990；Grierson等，核酸研究148595-8603，1986；Hanson等，植物细胞1173-179，1989；Ursin等，植物细胞1727-736，1989；John和Petersen，植物分子生物学26(6)1989-1993，1994；Atanassov等，植物分子生物学381169-1178.1998；Liu等，植物分子生物学33291-300，1997；Treacy等，植物分子生物学34603-611，1997；Agnes等，植物分子生物学40857-872，1999。在烟草花药中表达的20,000-25,000个基因中，只有10,000个基因是花药特异性的。Kamalay和Goldberg，美国科学院院报812801-2805，1984；Koltunow等，植物细胞21201-1224，1990。
启动子是一种DNA片段，其决定在植物和动物发育期间基因表达的时间及空间特异性。在过去的十年中，从众多植物和动物中已经鉴别和分离了许多组织特异性基因及其启动子，包括棉花组织特异性基因和启动子。Loguerico等，分子普通遗传学261(4/5)660-671，1999；Kawai等，植物细胞生理学39(12)1380-1383，1998；Song和Allen，生物化学生物生理学Acta 1351(1)305-312，1997；Ma等，生物化学生物生理学Acta 1344(2)111-114，1997；John，植物分子生物学，30(2)297-306，1996；Rinehart等，植物生理学112(3)1331-1341，1996；Hasenfratz等，植物生理学108(4)1395-1404，1995；John和Peterson，Plant Affiol.Biol.26(6)1989-1993，1994；John和Crow，美国科学院院报89(13)5769-5773，1992。这些植物组织特异性启动子可以用于在转基因植物中以组织特异性方式控制外源基因表达，其在大多数转基因作物第二代中是显性的。一些植物组织在所有所希望的组织或特定需要的组织中不表达高水平转基因。例如在转基因Bt棉花中，Bt基因表达水平在花中包括在花药中非常低，导致在这些组织中虫害抗性较低。为实现更好地控制棉花虫害，鉴别在这些组织中可以产生较高水平的基因表达的花药特异性启动子是特别有益的。
发明概述因此，本发明提供了一种棉花花药特异性启动子，其包含棉花CoFS基因的启动子。本发明还提供了一种棉花花药特异性启动子，其包含SEQ ID NO2。在另一个实施方案中，本发明提供了一种转基因植物，其在棉花CoFS基因的棉花花药特异性启动子的控制下表达转基因。
附图简述

图1示出CoFS cDNA示差展示分析结果。
图2提供了示出CoFS基因表达的Northern印迹。
图3示出CoFS启动子载体构建体和棉花CoFS基因的示意图。
图4提供了在转基因烟草植物中在CoFS基因启动子控制下的GUS基因的表达分析结果。
图5示出在转基因烟草植物中在CoFS启动子控制下的GUS基因的表达分析结果。
优选实施方案详述花药特异性基因(CoFS)及其相应启动子通过示差展示分析分离自棉花。所述分离的启动子的活性及组织特异性使用CoFS启动子控制GUS报告基因的表达在转基因烟草植物中证实。
得自多种棉花组织cDNA的Northern印迹分析示出包含CoFS基因的cDNA克隆在花药中高水平表达，而且在花瓣组织中也表达，但在其它组织中很少表达或不表达。见图1所示。
花药特异性基因(称为CoFS)分离自棉花。所述分离的完整CoFScDNA长度为8.4kb，见表1。基于CoFS cDNA序列，分离到一个CoFS启动子片段(2.6kb)。见表2。将所述棉花CoFS基因的核苷酸序列和推定的多肽序列与公布的序列对比表明所述基因与得自一些植物如Brassica napus(X94624)和Arabidopsis(AL078468，AL161560)的酰基辅酶A合成酶(很可能是长链酸性cCoA连接酶，EC 6.2.1.3)基因在氨基酸水平具有大约54-58％相同性。在核苷酸水平发现同源性较低，表明CoFS是在棉花中发现的新基因。基于已知的酰基辅酶A合成酶的氨基酸序列，对CoFS序列分析表明在其开放读框中可能含有9-10个外显子和8-9个内含子。
将CoFS启动子片段与GUS基因融合构建基因表达载体，以分析所述启动子的功能。具有CoFS启动子/GUS融合基因的转基因烟草植物通过Southem印迹杂交鉴别。在所研究的转基因植物中，在花药中检测到GUS活性，在子房，花柱和柱头中较弱，但在花瓣或其它组织中未检测到活性。这个结果结合Northern印迹分析结果表明CoFS启动子在棉花中是花药特异性的。所述启动子在棉花花药中在转录水平控制特异基因表达。所述分离的启动子可以用于改善所需基因在花药和植物性器官的相关组织中表达，以产生新的植物品种，从而通过基因操纵提高植物的品质和产量。
本发明的启动子可用于产生在花药组织中具有改良的转基因表达的转基因植物，尤其包括棉花。保护性基因如Bt基因在花药组织中的较好表达使植物对Bt敏感性有害物的抗性提高。可以在这个启动子控制下表达的基因包括适于此目的任何基因。
表1棉花CoFS基因的序列(SEQ ID NO1).
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GGGAAGCTTATCTACTTGAAGTTTTGGTAGCCCAATGAAATACTCTCGTAAATCTAGAGTTATTAGTGTAAACCCTAAAGGGATCAAATTGTATAAATTTAAATCCCTTATGACTTTCAATTGTAGATAGACTCTAATCTCGATCATGGATGTAACTCAATCTATTTGTTGGGTTTGGGGTGATTACTTCAATTCATTCCATTCATAGTTGTGAATATATTTGAGAGTATTTACGCAAACATTTGGTGTGTGCTATTTTTCCTTTGGTCTTTTGTTCTTCGTTGCCCATTCGTTCGAGTTTGCTTTCGCTATATTTTAATGCCTTAGAAAATTTTTGCGAGAATTCTCATTTTGTGAGAGTTAAGCGAACTTAGAATTATTTTTTTTAAAATCGCTTAAGGCTGTATGGTCTGTGAGACTAAAATTCTAGTCTCGTAACACTAATACAATCACAAGTAATTTACATTGTTCAAGTTCTTATTCACATAAGCGGTTGGATAAAGAAAATTAAAAAAAAACAATCGGATATAATTACAAAAAAATAAATTGAAATGTGCAATAATACAAATAATAATTATTGCTAAAGGTAAATAAAAAATGTAAATAATTATCAATGAAGTTTGAAAC CTTAAATGGTGAAGTTTGTGTCAACTAATAGAAGAAAAAATAAATTATTTATATAACTCTACTAATGTATTATTTTATTTTGTAAAATTGATTTATTTATATTATTTCTACTAAATTGATGTGGAATTAGTGATATCTACTTAATTAACTATATATAATTATAATGAATCTCCGGGACTGTGACTGGTCAAAGATCATAAAGTGGTATCCAATAAATTTAAAATGCACTTGTAAAATATTAGACTCATGATGGCACTGAGGCGGAGGTGAAGAGGCGGCAAAGCACATGGAGAAGCTATATAGAAAATTCTTTCACGAAAAAGGCAACTCTTGGCTTGTGTGTTGGGAATTGTGTTAAGAACTGGATTATATAAAAACAATTATATGGGGAAAGGAAATGGTCCACTGTCAATAGTTTACTATAAGCAAGTTGGAGATATAAAATTAAATATATATTCAGTACATATACGAGTTTGAGCAACAAAATTAGAGATCTTTTTTGTCAAGTTGATATCTTCAATTTTATAACGTAAATGTTCTTTTGAAGGCAACAGTAATGATATATATATATGTAGAAGAAATTTAACTAAAAATAGATAATTAGGCTTAATTTAATTAATTCAAGTGCAATTGTTTTATCATAATATATATTACATTACAAGGCTTGAATTATTCATATTTTAAATTTATTTATTAGTTAACAAAGTAATTATTGGTGCAA
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表3.CoFS的-275bp cDNA片段的序列(SEQ ID NO3).
GGTCACTGTGACGTGCCGTGGCTACTGTGAAACGAGCCGTGGCTACTGTGAACGTGCCGTGGCTACTGTGAACGAGCCGTGGCTACTGTGAACGTGCCGTGGCTACTGTGAACGTGCCGTGGCTACTGTGAACGAGCCGTGGTCACTGTGATACGTGCCGGGAGTTTTGTCTCTTTACCTAATGAATTGTCAATGCTTGGTACTGTGGGGCCCCATACCAAACATAGATGTACGCCTGGAATCTGTTCCGAAAAAAAAAAAACTGAATTCCGAGT以下非限制性实施例举例示出了本发明。
实施例1编码在棉花花药中表达的CoFS序列的花药特异性cDNA的分离将棉花种子表面用70％乙醇灭菌30-60秒，及用10％H2O2灭菌30-60分钟，随后用无菌水冲洗。将种子在1/2MS培养基上，在28℃光照16小时而萌发。从灭菌秧苗上切下子叶和胚轴，作为转化外植体材料。将棉花植物生长于花盆中以进行DNA和RNA提取。使用硫氰酸胍方法或SV总RNA分离系统(Promega)，从棉花的幼纤维，子房，花药，花瓣，萼片，叶和根提取总RNA。使用得自mRNA纯化试剂盒(Pharmacia Biotech)的寡(dT)-纤维素旋转柱纯化聚(A)+RNA。得自棉花不同组织的总RNA用于逆转录第一链cDNA。这些cDNA在示差展示PCR中用作模板。
用示差展示试剂盒(Clontech)进行示差展示分析。用2pg总RNA作为逆转录起始物及寡(dT)作为引物，在42℃反应1小时合成第一链cDNA。示差展示PCR反应如下进行初始循环包括94℃5分钟，40℃5分钟，及68℃5分钟，随后进行两次94℃2分钟，40℃5分钟及68℃5分钟循环，然后进行25次94℃1分钟，60℃1分钟及68℃2分钟循环，最后在68℃延伸7分钟。切下目的示差展示条带并再扩增以进一步分析。将PCR片段，DNA和cDNA片段亚克隆入载体中，并将用Qiagen质粒试剂盒制备的质粒DNA和噬菌粒DNA在PCR中用作模板。PCR产物通过自动测序仪测序。
棉花cDNA使用cDNA合成试剂盒(Stratagene)合成。棉花cDNA文库通过将所述cDNA片段插入ZAP表达载体(Stratagene)中构建。对重复性的花药及花瓣特异性示差展示产物(见图1)进一步分析。收获每个目的条带中的cDNA并通过PCR扩增而再生。随后将分离的cDNA亚克隆入载体中并测序。
为确定哪种cDNA转录物在棉花花药中特异积聚，使用得自所述cDNA克隆的探针通过与分离自棉花纤维，子房，花药，花瓣，萼片，干，叶和根的总RNA进行Northern印迹杂交分析cDNA表达模式。为进行Northern印迹分析，得自不同棉花组织的RNA样品在琼脂糖-甲醛凝胶上分离，并通过毛细管印迹移至Hybond-N尼龙膜上。将RNA Northern印迹在ExpressHyb溶液(Clontech)中，在68℃与通过随机标记制备的32P-cDNA探针(Prime-a-GeneLabelling System，Promega)杂交。杂交后，将印迹在68℃，在0.1×SSC，0.5％SDS中洗30-60分钟。
一个克隆经鉴别为275bp CoFS cDNA片段(见表3)。发现此cDNA片段与Brassica napus的酰基辅酶A合成酶基因(X94624)在开放读框的33个氨基酸区域内呈现73％同源性。Northern印迹杂交证实此CoFS cDNA转录物在棉花花药中大量积聚，而且在花瓣中也或多或少积聚，但这些转录物在来自纤维，子房，干，叶和根的RNA中未检测到(见图2)。这个结果示出CoFS cDNA表达在棉花中是花药特异性的。
实施例2CoFS基因的分离及结构分析如实施例1所述制备来自棉花的植物材料。将烟草种子表面用70％乙醇灭菌30-60秒，及用0.1％HgCl2灭菌15分钟，随后用无菌水冲洗。将所述种子在1/2MS培养基上在28℃光照萌发，并将从无菌秧苗上切下的叶用作实验材料。
根据以下方法从棉花和烟草植物叶中提取并纯化总DNA。将叶组织(2-4g)在液氮中彻底匀浆。将匀浆组织置于具有20ml冰冻的提取缓冲液的50ml试管中，并以2500rpm沉淀15分钟。在除去上清后，将沉淀再悬浮于10ml裂解缓冲液中，在65℃温育30分钟。向每个试管加入10ml氯仿并与样品混合。然后将样品在3500rpm沉淀10分钟。将上清移至一个清洁试管中，再一次用氯仿提取。将上清移至一个清洁试管中，并向每个试管中加入0.6体积的异丙醇以沉淀DNA。在3500rpm离心30分钟后，将DNA用70％乙醇冲洗。然后将分离的基因组DNA溶解于无菌水中以应用。
从棉花植物叶中构建棉花基因组DNA文库。将DNA用BamHI部分消化，将所述DNA片段克隆在ZAP表达载体(Stratagene)的BamHI位点。使用通过基因组步查PCR分离的CoFS基因片段作为探针，筛选所述棉花基因组DNA文库。
使用通用基因组步查试剂盒(Clontech)构建基因组步查文库。将来自棉花植物叶的基因组DNA分别用5种限制酶消化，通过苯酚/氯仿提取纯化，并在乙醇中沉淀。将消化的DNA与基因组步查衔接物连接。
相继进行两个基因组步查聚合酶链反应将1μl每种基因组步查DNA文库在第一个PCR中用作模板，并将第一个PCR产物在第二个PCR中用作模板。所述PCR在95℃1分钟开始，随后进行35次95℃15秒及68℃4分钟的循环，最后在68℃延伸6分钟。使用Geneclean试剂盒(Bio 101)纯化靶DNA条带。
筛选揭示了两个CoFS基因阳性克隆。一个克隆含有一个4.801kb棉花CoFS基因区域，另一个克隆含有一个3.913kb棉花DNA片段，其携带部分CoFS启动子区域。从棉花基因组步查文库中分离3个CoFS启动子片段(分别为0.7，1.4和2.6kb)。分离自棉花的完整CoFS基因长度为8.4kb，包括一个2.6kb启动子区域。序列示于表1表2。
实施例3CoFS启动子的功能分析为定性CoFS启动子在CoFS基因的花药特异性表达中的功能，在基因表达载体pBI121中将CoFS启动子的0.7kb片段，1.4kb片段和2.5kb片段(代替CaMV35S启动子)与GUS编码序列分别融合，见图3。
载体如下构建。通过PCR分别在0.7，1.4和2.4kb CoFS启动子片段的5’和3’末端产生一个Hind III位点和一个BamHI位点。将Hind III/BamHI片段最初亚克隆入pGEM-T载体(Promega)中。将含有CoFS启动子片段的DNA用Hind III和BamHI消化，并将消化的片段通过琼脂糖凝胶电泳分离。三个嵌合的CoFS启动子/GUS构建体通过分别将0.7，1.4或2.4kb片段代替CaMV35S启动子插入pBI121载体的Hind III/BamH I位点中而产生。
所述CoFS启动子/GUS融合基因构建体通过农杆菌介导的基因转移用于转化烟草，使用含有CaMV35S启动子/GUS融合蛋白的pBI121载体作为阳性对照。所述CaMV35S启动子是组成型启动子，在所有植物组织中均有活性。Odell等，自然313810-812，1985；Ow等，美国科学院院报844870-4874，1987；McCabe和Martinell，生物技术11596-598，1993。
将含有CoFS启动子/GUS融合基因的二元载体移至根癌农杆菌菌株LBA 4404中。使用叶-盘方法(Horsch等，1985)进行烟草转化。将烟草叶切成大约2×2cm，并浸入农杆菌悬浮液中5分钟。将感染的烟草移植物在MS培养基上用1mg/L 6-BA在28℃培养48小时，并移至含有100mg/L卡那霉素和1mg/L 6-BA的选择MS培养基上培养20-30天。选择卡那霉素抗性(转化的)芽。将转化的芽从愈伤组织切下，并在具有50-100mg/L卡那霉素的MS培养基上生根。将转化的植物移至土壤中生长成熟。
通过DNA Southern印迹杂交及通过GUS组织化学测定分析具有嵌合CoFS启动子/GUS基因(或35S/GUS基因)的转基因烟草植物及阴性对照未转化的植物。为进行Southern印迹分析，将来自转基因烟草植物叶的总基因组DNA用限制酶消化，在琼脂糖凝胶上分离，并通过毛细管印迹移至Hybond-N尼龙膜上。将DNA Southern印迹在ExpressHyb溶液(Clontech)中在68℃与通过随机标记制备的32P-DNA探针(Promega Prime-a-Gene Labelling System)杂交。杂交后，将印迹在68℃在0.1×SSC，0.5％SDS中洗30-60分钟。将32P-标记的尼龙膜在-70℃曝光于X-光片以放射自显影。见图4结果。
根据先前Jefferson，植物分子生物学报道5387-405，1987所述加以一些修改，在转基因烟草植物中进行GUS活性组织活性分析。将得自所述植物的新鲜组织在X-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸)溶液中温育过夜，所述溶液由0.1M磷酸钠(pH7.0)，10mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.5mM亚铁氰化钾和0.1％X-gluc(Clontech化学制品)组成。然后将染色的植物材料清亮并通过用100％和70％乙醇彻底漂洗而固定，直接或在显微镜下观测样品并拍照。见图5。
印迹分析结果表明CoFS启动子/GUS基因整合入烟草基因组中。获得50多种烟草转基因植物并移植土壤中生长成熟。与棉花Northern印迹分析结果一致，由CoFS启动子驱动的GUS基因在烟草花药中特异性并强有力表达。在子房，花柱和柱头中也检测到在CoFS启动子驱动下GUS基因的微弱活性，但在花瓣及研究的所有转基因烟草植物的其它组织中未检测到GUS活性。这个结果结合上述Northern印迹分析提示CoFS启动子在植物花药中能在转录水平控制特异性基因表达。
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1.一种花药特异性启动子，其包含棉花CoFS基因的启动子。
2.权利要求1的启动子，其包含SEQ ID NO2。
3.一种转基因植物，其在权利要求1的启动子控制下表达转基因。
全文摘要
本发明涉及一种花药特异性棉花基因(CoFS)及其活性启动子片段。这些启动子示出强花药特异活性。
文档编号C12N15/82GK1486369SQ01822084
公开日2004年3月31日 申请日期2001年1月17日 优先权日2001年1月17日
发明者刘建伟, 李学宝, 蔡林, 程宁辉 申请人:分子农业生物学院