专利名称：治疗胰腺癌的药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及治疗胰腺癌的药物和用途，以及生产这种药物的用途。
胰腺癌和胰腺的腺癌分别是具有最不好预后的癌症之一。对于胰腺癌的病因现在还不知道。到此刻为止还没有适当的疗法。除了其它基因的改变，胰腺癌细胞经常显示在K-ras基因中的突变。尤其已经在密码子12，13以及61中检测到了突变。K-ras基因是编码GTP-结合K-ras蛋白的原癌基因。K-ras被定位在细胞质膜的细胞质侧，并且与受体-酪蛋白-激酶有关。GTP的结合活化K-ras。已结合GTP的磷酸残基的水解裂解导致失活。结果释放形成的GDP，GTP的重新结合能够导致K-ras的再活化。前面提到的突变能够导致K-ras中氨基酸的交换，因而导致其持久活化。K-ras的活化除其它作用外，还激活蛋白激酶C。
从德国专利DE10100586C1中已知一种抑制细胞中靶基因表达的方法，其中将具有双链结构的寡核糖核酸引入细胞。双链结构中的一条链与靶基因互补。在这种方法中，抑制作用的原理被称为RNA干扰。
本发明的任务是克服现有技术的缺点。特别是获得治疗胰腺癌的有效药物和用途。而且，获得生产这种药物的用途。
这个任务通过权利要求1，19和20中的特征解决。从权利要求2至18和21至38中的特征可以得出优选的实施方案。
根据本发明，含有适合通过RNA干扰方式抑制K-ras基因表达的双链核糖苷酸(dsRNA)的药物用于治疗胰腺癌，特别是人胰腺癌。不是dsRNA中的所有核苷酸都必须显示为典型的沃森-克里克(Watson-Crick)碱基对。特别地，单个的，非互补的碱基对几乎根本不损害效果。最大可能的碱基对数也是dsRNA中所含最短链中的核苷酸数。
该药物含有足以抑制胰腺癌中K-ras基因表达剂量的dsRNA。也能将该药物设计成几个药物单位的总和共同含有足够量这样的方式。足够量依赖于给药的方式。为了确定所需要的量，可以以逐渐增加的量或剂量给予dsRNA。接着通过已知方法检验从胰腺癌中获得的组织样品以检测在这种量时是否发生K-ras基因的表达抑制。这些方法，例如可能包括分子生物学、生物化学或者免疫学的方法。
使人惊奇地是，通过用能够选择性地抑制K-ras基因表达的dsRNA治疗，已经显示能够抑制胰腺癌细胞的增殖，并且能够减少活肿瘤细胞的数量。令人惊异的是，非恶性细胞的增殖行为在很大程度上没有受到这种疗法的影响。该药物能够增加胰腺癌细胞中的凋亡率。在体内，使用这样的药物可能会有效地抑制胰腺肿瘤的生长。
能够以突变K-ras基因这样的方式影响K-ras的持久活化。通过根据本发明的药物抑制这种基因的表达在抑制胰腺癌的生长中特别有效。能够在密码子12，13或61中突变K-ras基因。在被突变的K-ras基因中，密码子12能够编码精氨酸、丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、半胱氨酸或天冬氨酸，或者密码子13能够编码天冬氨酸，或者密码子6 1能编码组氨酸或亮氨酸。在野生型K-ras基因中，密码子12和密码子13每个都编码甘氨酸，密码子61编码谷氨酸。
优选地，dsRNA的一条链S1具有一个区域，特别地是由少于25个连续核苷酸构成，其至少部分与K-ras基因互补。这样的dsRNA特别非常适于抑制K-ras基因的表达。“K-ras基因”应被理解为指在肿瘤细胞中编码K-ras的双链DNA的DNA链，其与包括所有被转录区，作为转录模板的DNA链互补。因此K-ras基因通常是有意义链。这样S1链能够与RNA转录本或其加工产物，例如在K-ras基因的表达过程中形成的mRNA互补。
互补dsRNA区可能具有19到24，优选20到24，特别优选21到23，尤其优选22或23个核苷酸。具有这种结构的dsRNA在抑制K-ras基因中效率特别高。dsRNA的S1链可能具有少于30，优选少于25，特别优选21到24，尤其优选23个核苷酸。这些核苷酸的数量也是在dsRNA中最大可能的碱基对数。这种dsRNA在细胞内特别稳定。
已经证明当dsRNA的至少一端具有由1到4个，特别地由2个或3个核苷酸构成的单链突出端时特别有利。与在至少一端没有单链突出端的dsRNA相比，这种dsRNA在抑制K-ras基因的表达中显示了优越的效果。这里，一端是存在5’-和3’-链末端的dsRNA区。仅仅由S1链构成的dsRNA相应地具有环状结构和仅仅一端。由S1链和S2链构成的dsRNA具有两端。在各种情况下，一端由链S1的一个链末端形成，另一端由链S2的链末端形成。
单链突出端优选位于S1链的3’-端。单链突出端的这种位置导致药物效率的进一步提高。在一个实例中，dsRNA仅仅在一端，特别是在位于S1链3’末端的一端显示单链突出端。在显示两端的dsRNA中另一端是平端，即，缺乏突出端。已经证明这样的dsRNA在各种各样的细胞培养基中以及在血和血清中特别稳定。
优选地，dsRNA除了具有S1链，还具有S2链，即，它由两条单链构成。当S1链(反意义链)是23个核苷酸长，S2链是21个核苷酸长，并且S1链的3’-端具有由两个核苷酸构成的单链突出端时该药物特别有效。这里位于S1链5’-末端的dsRNA端是平端。S1链能够与K-ras基因的初级或已加工的RNA转录本互补。优选地，dsRNA由具有SEQ ID NO1序列的S2链和具有SEQ ID NO2序列的S1链，或由具有SEQ ID NO3序列的S2链和具有SEQ ID NO4序列的S1链，或由具有SEQ ID NO5序列的S2链和具有SEQ ID NO6序列的S1链构成，如所附的序列表中所示。这种dsRNA在抑制K-ras基因的表达中特别有效。
dsRNA能够存在于在溶液中的药物中，特别是生理上可耐受的缓冲液或生理盐水溶液中，或者被胶束结构围绕，优选被脂质体、衣壳、类衣壳体，或聚合物纳胶囊或微胶囊围绕，或者被结合到聚合物纳囊或微囊上。
生理上耐受的缓冲液可能是磷酸缓冲盐水溶液。胶束结构、衣壳、类衣壳体，或聚合物纳胶囊或微胶囊在肿瘤细胞中能够便于dsRNA的摄取。聚合物纳胶囊或微胶囊由至少一种可生物降解的聚合物，例如聚丁基氰基丙烯酸酯构成。聚合物纳胶囊或微胶囊能够在体内转运和释放包含在其内或被结合到其上的dsRNA。
药物能够显示为适于吸入、口服、输注或注射，特别是适于静脉内、腹膜内、或者肿瘤内输注或注射的制剂。适于吸入、输注或注射的制剂最简单地由dsRNA和生理上可耐受的溶剂构成，优选生理盐水溶液或生理上可耐受的缓冲液，特别是磷酸缓冲盐水溶液。使人惊奇地是，已经显示dsRNA不必被包裹在特定的载体中，简单地在这样的溶剂或这样的缓冲剂中溶解和给药的dsRNA也能够被肿瘤细胞摄入，并且抑制K-ras基因的表达。
优选地，药物以至少一个剂量单位存在，该剂量单位含有能够以递升的优选顺序排列的最大剂量为每公斤体重每天5mg、2.5mg、200μg、100μg、50μgh和最适25μg dsRNA的dsRNA的量。已经证明甚至在这种剂量时dsRNA也显示出抑制K-ras基因表达的显著效果。能够将剂量单位设计成每日单次给药或摄入剂量。在这种情况中，单剂量单位中包含全部日剂量。如果将剂量单位设计成每天几次给药或摄入的剂量，那么为了获得每日的总剂量，在每个剂量中所含的dsRNA量将相应地变小。也能够将剂量单位设计成例如在几天中单次给药或摄入的量，结果在几天中释放dsRNA。于是剂量单位含有相应的多个每日剂量。
另外，根据本发明，目的是将适合通过RNA干扰的方式抑制K-ras基因表达的双链核糖核酸用于生产治疗胰腺癌的药物。此外，根据本发明，目的是将适合通过RNA干扰的方式抑制K-ras基因表达的双链核糖核酸用于治疗胰腺癌。
根据本发明，关于用途的有利的实施例见前面的评述。
下面，将用图示范性地说明本发明。用缩写“M”代替“mol/l”表示浓度。在
图1中显示人胰腺癌细胞YAP C的凋亡率(百分率)依赖于与人K-ras基因第一序列互补的dsRNA转染后的培育时间，在图2中显示用dsRNA转染后活细胞的数量，在图3中显示在NMRI-小鼠中皮下植入的人胰腺腺癌的体积。
使用的双链寡核糖核苷酸显示为下列序列，在序列表中称为SEQID NO1到SEQ ID NO8KRAS1，与YAP C细胞中在密码子12中显示第一个点突变的人K-ras基因序列互补S25’-agu ugg agc ugu ugg cgu agg-3’(SEQ ID NO1)S13’-ca uca acc ucg aca acc gca ucc-5’(SEQ ID NO2)KRAS1’，与NMRI小鼠皮下移植的人胰腺腺癌中在密码子12中显示第一个点突变的人K-ras基因序列互补S25’-agu ugg agc uga ugg cgu agg-3’(SEQ ID NO3)S13’-ca uca acc ucg acu acc gca ucc-5’(SEQ ID NO4)KRAS2，与来自人K-ras基因的野生型序列互补S25’-agu ugg agc ugg ugg cgu agg-3’(SEQ ID NO5)
S13’-ca uca acc ucg acc acc gca ucc-5’(SEQ ID NO6)NEO，与来自新霉素抗性基因的序列互补S25’-c aag gau gag gau cgu uuc gca-3’(SEQ ID NO7)S13’-ucu guc cua cuc cua gca aag cg-5’(SEQ ID NO8)在37℃，5％CO2恒定条件下，在含有10％胎牛血清(FCS)和100μg/ml青霉素/链霉素的RPMI1640培养基(Bio-chrom，Berlin)中培养能够从德国微生物和细胞培养物保藏中心获得的人胰腺癌细胞系YAP C细胞，Braunschweig(No.ACC 382)。
在6孔板中用oligofectamine(Invitrogen，Karlsruhe)进行转染。在每个孔中铺150,000个细胞。根据Invitrogen建议的方案用oligofectamine进行双链寡核糖核苷酸的转染(涉及6孔板中一个孔的数据)用175μl无添加剂的细胞培养基稀释10μl双链寡核糖核苷酸(0.1到10μM)。用12μl无添加剂的细胞培养基稀释3μloligofectamine，在室温下培养10分钟。将用这种方式稀释的oligofectamine加到已经稀释好的双链寡核糖核苷酸中，混合，在室温下培养20分钟。在这期间，用无添加剂的细胞培养基冲洗将被转染的细胞一次，加入800μl新鲜的细胞培养基。接着向每个孔中加入200μl所描述过的oligofectamine-dsRNA混合物，使得最终的感染体积是1000μl。
这导致双链寡核糖核苷酸的终浓度是1-100nM。在37℃培养转染分析物4小时。在这之后，向每个孔中添加500μl含有30％FCS的细胞培养基，使得FCS的终浓度是10％。接着在37℃培养这种分析物24到120小时。
为了测定凋亡率，培养后收集上清液，用磷酸缓冲盐水溶液(PBS)冲洗细胞，使用胰蛋白酶分离，在100g下离心10分钟。弃去上清液，沉淀在低渗碘化丙锭溶液中4℃黑暗中培养30分钟。用荧光辅助细胞分选仪FACSCalibur(BD GmbH，Heidelberg)通过流式细胞术的方法进行分析。
图1显示了人胰腺癌细胞YAP C的凋亡率(按百分率)，其对逐渐增加浓度的KRAS1 dsRNA转染后的培养时间有依赖时。从这可以看到，KRAS1能够在人胰腺癌细胞中诱导浓度依赖的凋亡。凋亡率随着培养时间的增加而增加。而没有被处理的YAP C细胞(对照)和没有用双链寡核糖核苷酸进行所描述的转染方法转染的细胞(伪转染或假转染)在120小时的培养后，也仅仅显示了5％的最大凋亡率，而用100nMKRAS1转染的细胞在120小时培养后凋亡率增加到24％。与K-ras野生型互补的KRAS2 dsRNA在YAP C细胞中诱导出相同效果的凋亡。
为了测定转染对增殖和活细胞数量的影响，在6孔板中的每个孔中分别铺50,000个YAP C细胞并且按照上面描述过的方法转染。在24到120小时培养之后用台盼蓝排除染色，通过在Neubauer计数室中计数来测定活细胞的数量。结果显示在图2中。YAP C细胞的增殖受到KRAS1的抑制并依赖于KRAS1的浓度。仅仅使用1nM的KRAS1就能够使活细胞的数量在统计学上显著地减少(120小时后与未处理的对照相比，p＝0.001)。
在100nM浓度下与K-ras野生型互补的KRAS2 dsRNA转染导致活细胞数量的减少。被用KRAS1或KRAS2转染的非恶性人皮肤成纤维细胞在它们的增殖行为上没有显示变化。
对于体内实验，将直径2-3mm的人胰腺腺癌组织碎片皮下移植到NMRI小鼠(Harlan Winkelmann GmbH，Borchen)中。在肿瘤长到6-7mm大小后，将溶解在生理盐溶液的KRAS1’或NEO按每公斤体重200μg的剂量，每日进行腹膜内注射。注射生理盐水溶液作为对照。每日用游标卡尺或标准模板测量肿瘤的大小。图3以平均值±平均值的标准误显示所测肿瘤的体积，单位为mm3，依赖于以用腹膜下注射治疗开始天数表示的测量时间(天数，i.p.)。从这可以看到与K-ras基因互补的dsRNA能够抑制肿瘤的生长。通过以200μg/kg的剂量每日腹膜下应用与K-ras基因互补的dsRNA来抑制肿瘤的生长，使得24天的治疗后，肿瘤的体积仅仅是在对照组中所见肿瘤体积的62％。
序列表<110>Ribopharma AG<120>治疗胰腺癌的药物<130>422271EH<140>
<141>
<160>8<170>Patent In Ver.2.1<210>1<211>21<212>RNA<213>人<400>1aguuggagcu guuggcguag g21<210>2<211>23<212>RNA<213>人<400>2ccuacgccaa cagcuccaac uac 23<210>3<211>21
<212>RNA<213>人<400>3aguuggagcu gauggcguag g21<210>4<211>23<212>RNA<213>人<400>4ccuacgccau cagcuccaac uac 23<210>5<211>21<212>RNA<213>人<400>5aguuggagcu gguggcguag g21<210>6<211>23<212>RNA<213>人
<400>6ccuacgccac cagcuccaac uac 23<210>7<211>22<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述与新霉素抗性基因序列互补的dsRNA的有意义链<400>7caaggaugag gaucguuucg ca23<210>8<211>23<212>RNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述与新霉素抗性基因序列互补的dsRNA的反意义链<400>8gcgaaacgau ccucauccug ucu 2权利要求
1.治疗胰腺癌的药物，其中该药物含有适合通过RNA干扰的方式抑制K-ras基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)。
2.根据权利要求1的药物，其中突变K-ras，致使其引起K-ras的持续活化。
3.根据权利要求1或2的药物，其中K-ras基因在密码子12，13或61中突变。
4.根据前面权利要求之一的药物，其中在K-ras基因中密码子12编码精氨酸、丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸、半胱氨酸或天冬氨酸，密码子13编码天冬氨酸，或者密码子61编码组氨酸或亮氨酸。
5.根据前面权利要求之一的药物，其中dsRNA的S1链具有至少部分与K-ras基因互补的区域，特别地该区域由少于25个连续核苷酸构成。
6.根据前面权利要求之一的药物，其中互补区域具有19-24，优选20-24，特别优选21-23，尤其优选22或23个核苷酸。
7.根据前面权利要求之一的药物，其中S1链具有少于30，优选少于25，特别优选21-24，尤其优选23个核苷酸。
8.根据前面权利要求之一的药物，其中至少dsRNA的一端具有由1-4，特别地由2个或3个核苷酸构成的单链突出端。
9.根据权利要求8的药物，其中单链突出端位于S1链的3’-端。
10.根据前面权利要求之一的药物，其中dsRNA仅仅在一端，特别是在位于S1链3’-端的末端具有单链突出端。
11.根据前面权利要求之一的药物，其中dsRNA除具有S1链外，还具有S2链。
12.根据权利要求11的药物，其中S1链是23个核苷酸长，S2链是21个核苷酸长，并且S1链的3’-端具有由两个核苷酸构成的单链突出端，而位于S1链5’-端的dsRNA末端是平端。
13.根据前面权利要求之一的药物，其中S1链与K-ras基因的初级或已加工的RNA转录本互补。
14.根据前面权利要求之一的药物，其中dsRNA由具有SEQ IDNO1序列的S2链和具有SEQ ID NO2序列的S1链，或由具有SEQ IDNO3序列的S2链和具有SEQ ID NO4序列的S1链，或由具有SEQ IDNO5序列的S2链和具有SEQ ID NO6序列的S1链构成，如所附的序列表中所示。
15.根据前面权利要求之一的药物，其中药物中的dsRNA存在于溶液中，特别是生理上可耐受的缓冲液或生理盐水溶液中，被胶束结构围绕，优选被脂质体、衣壳、类衣壳体、或聚合物纳胶囊或微胶囊围绕，或者被结合到聚合物纳胶囊或微胶囊上。
16.根据前面权利要求之一的药物，其中药物显示为适合吸入、口服、输注或注射，特别地适合静脉内、腹膜内、或者肿瘤内输注或注射的制剂。
17.根据权利要求16的药物，其中所述制剂，特别是仅仅由dsRNA和生理上可耐受的溶剂，优选生理盐水溶液或生理上可耐受的缓冲液，特别是磷酸缓冲盐水溶液构成。
18.根据前面权利要求之一的药物，其中药物以至少一个剂量单位存在，该剂量单位含有能够以递升的优选顺序排列的最大剂量为每天每公斤体重5mg、2.5mg、200μg、100μg、50μg和最适25μg的dsRNA。
19.适合通过RNA干扰方式抑制K-ras基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)在生产治疗胰腺癌的药物中的用途。
20.适合通过RNA干扰方式抑制K-ras基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)在治疗胰腺癌中的用途。
21.根据权利要求19或20之一的用途，其中使K-ras基因突变致使其引起K-ras的持久活化。
22.根据权利要求19-21之一的用途，其中K-ras基因在密码子12，13或61中突变。
23.根据权利要求19-22之一的用途，其中在K-ras基因中密码子12编码精氨酸、丝氨酸、缬氨酸、半胱氨酸或天冬氨酸，密码子13编码天冬氨酸，或者密码子61编码组氨酸或亮氨酸。
24.根据权利要求19-23之一的用途，其中dsRNA的S1链具有至少部分地与K-ras基因互补的区域，特别地该区域由少于25个连续核苷酸构成。
25.根据权利要求19-24之一的用途，其中互补的区域具有19-24，优选20-24，特别优选21-23，尤其优选22或23个核苷酸。
26.根据权利要求19-25之一的用途，其中S1链具有少于3个，优选少于25，特别优选21-24，尤其优选23个核苷酸。
27.根据权利要求19-26之一的用途，其中在至少dsRNA的一端具有由1-4，特别地由2个或3个核苷酸构成的单链突出端。
28.根据权利要求27的用途，其中单链突出端位于S1链的3’-端。
29.根据权利要求19-28之一的用途，其中dsRNA仅仅在一端，特别地在位于S1链3’-端的末端具有单链突出端。
30.根据权利要求19-29之一的用途，其中所述dsRNA除了具有S1链外，还所述S2链。
31.根据权利要求30的用途，其中所述S1链是23个核苷酸长，S2链是21个核苷酸长，并且S1链的3’-端具有由两个核苷酸构成的单链突出端，而位于S1链5’-端的dsRNA末端是平端。
32.根据权利要求19-31之一的用途，其中所述S1链与K-ras基因的初级或已加工的RNA转录本互补。
33.根据权利要求19-32之一的用途，其中所述dsRNA由具有SEQ ID NO1序列的S2链和具有SEQ ID NO2序列的S1链，或由具有SEQ ID NO3序列的S2链和具有SEQ ID NO4序列的S1链，或由具有SEQ ID NO5序列的S2链和具有SEQ ID NO6序列的S1链构成，如所附的序列表中所示。
34.根据权利要求19-33之一的用途，其中所述dsRNA存在于溶液，特别是生理上可耐受的缓冲液或生理盐水溶液中，被胶束结构围绕，优选被脂质体、衣壳、类衣壳体、或聚合物纳胶囊或微胶囊围绕，或者被结合到聚合物纳胶囊或微胶囊上。
35.根据权利要求19-34之一的用途，其中dsRNA存在于适合吸入、口服、输注或注射，特别是适合静脉内、腹膜内、或者肿瘤内输注或注射的制剂中。
36.根据权利要求35的用途，其中所述制剂，特别地仅仅由dsRNA和生理上可耐受的溶剂，优选生理盐水溶液或生理上耐受的缓冲液，特别地磷酸缓冲盐水溶液构成。
37.根据权利要求19-36之一的用途，其中所述dsRNA是通过口服、吸入、输注或注射，特别地通过静脉内、腹膜下或肿瘤内输注或注射的方式给药的。
38.根据权利要求19-37之一的用途，其中dsRNA按递升的优选顺序，以每天每公斤体重最大剂量5mg、2.5mg、200μg、100μg、50μg和最适剂量25μg使用。
全文摘要
本发明涉及治疗胰腺癌的药物，所说的药物含有适用于抑制K－ras基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)。
文档编号C12N15/11GK1608131SQ02826179
公开日2005年4月20日 申请日期2002年10月25日 优先权日2001年10月26日
发明者M·奥克尔, C·赫罗尔德, A·盖克, D·舒潘, H·－P·沃恩洛赫尔, R·克罗伊策尔, S·林默 申请人:里伯药品公司