专利名称：传染性非典型肺炎(sars)病毒复合荧光定量pcr检测的制作方法
技术领域：
本发明传染性非典型肺炎(SARS)病毒复合荧光定量PCR检测涉及一种定量PCR检测方法，属于生命科学领域。荧光定量PCR是通过实时监控PCR体系中的荧光信号，对样本中初始模板进行定量分析的一项新技术。可用于生物学、医学及其相关领域。
目前用于SARS病毒检测的方法主要有两种酶联免疫法检测和PCR检测。SARS病毒IgM/IgG抗体特异性酶联免疫法以灭活病毒作为抗原，对病人进行血清学检测，具有较高特异性。但由于检测的目标是患者血清中的抗体，而患者从感染病毒到体内生成抗体需要较长的时间，所以该方法通常只能检测出感染病毒时间较长的患者。SARS病毒携带者有一定时间的潜伏期(通常为4-15天)，对于潜伏期的患者，采用酶联免疫法检测的效果不佳。因为潜伏期患者同样具有传染性，所以提高潜伏期患者的检测率对控制疫情十分重要。
SARS病毒的PCR检测是根据SARS病毒基因组序列设计一对引物，通过变性、退火、延伸三个循环步骤，可使目标DNA片段呈指数扩增，产物经琼脂糖电泳，即可出现相应的阳性条带。PCR系统是一个极其灵敏的信号放大系统，能将极微弱的基因信号检测出来。相对于酶联免疫法而言，PCR检测的灵敏度明显加强。但由于引物复性过程中可能出现碱基错配，结果会导致非特异性片段的扩增，同时抑制了SARS病毒目标片段的有效扩增，最终导致出现假阴性结果。另外，随着研究的深入，发现SARS病毒具有很高的变异能力，如果对应于PCR引物位置的核苷酸发生了突变，将直接导致引物不能和模板结合，扩增反应不能进行。据统计，目前应用的SARS病毒PCR检测法的检出率只有70％左右，灵敏性还有待进一步的提高。
研究表明，不同的SARS病毒变异株在毒性和传染性上存在差异，所以确定患者所感染病毒株的类型对临床治疗极为重要，这是目前的酶联免疫检测和PCR检测无法完成的。另外，常规的PCR方法不能测定起始样本中SARS病毒的含量水平，所以不能反映患病的严重程度，也不能反映治疗的效果，从而限制了它在临床检测中的应用。
本发明目的可通过以下技术方案实现根据SARS病毒基因组序列设计特异性引物和荧光探针，不同的探针采用不同的荧光进行标记；抽取患者样本中的病毒RNA，并反转录成cDNA；以SARS病毒cDNA为模板，以病毒特异性引物进行PCR扩增，通过检测反应体系中探针荧光信号的变化，测定样本中SARS病毒的变易类型及含量。特点是在一个PCR反应体系中，包含多组SARS病毒引物和荧光探针，可同时检测SARS病毒的不同区段或不同的病毒变异株。
本发明利用荧光定量PCR技术，即是指通过实时监控PCR体系中的荧光信号，对样本中初始模板进行定量分析。定量PCR可实时检测产物量，通过加入已知浓度的标准样品绘制标准曲线，然后根据待测样品在标准曲线中的位置推算初始模板的浓度。它操作简便，结果准确可靠，是一种新的临床检测方法。不但可以检测出患SARS病毒株的类型，而且可以确定病毒的含量。
在上述技术方案的基础上，扩增片段位于SARS病毒基因组的不同位置，用于PCR扩增的引物和探针是根据SARS病毒基因组序列的不同区段而设计的，如附
图1所示。荧光定量PCR的前提是PCR引物和荧光探针都和模板特异结合，从而大大提高了检测的特异性。当其中一个片段发生变异，导致不能正常扩增时，其它片段仍可以正常扩增，从而避免出现假阴性结果，提高了检出率。
扩增片段也可位于SARS病毒基因组的同一位置，但引物和探针是根据不同的病毒变异株序列而设计的，如附图2所示。不同的引物和探针组合扩增来自不同病毒变异株的相应片段，从而检测患者携带SARS病毒的类型及病毒数量。
在上述技术方案的基础上，用于复合检测的荧光探针可以是双标记探针(double-labeled probe)、分子信标(molecular beacon)、能量传递荧光探针(Fluorescent resonance energy transfer)等中的一种或一种以上，用于标记探针的荧光可以是FAM、TET、JOE、VIC、HEX、ROX、TAMRA、CY3、CY3.5、CY5、CY5.5、OregonGreenTM、CAL RedTM、Red 640、Texas Red等中的二种或二种以上。
在上述技术方案的基础上，SARS病毒复合荧光定量PCR检测可采用两步法进行在反转录酶的作用下，将SARS病毒RNA转变为cDNA；以cDNA为模板，在DNA聚合酶的作用下扩增SARS病毒特异片段。也可以采用一步法进行SARS病毒的检测反转录和PCR扩增在同一反应管中进行。
在上述技术方案的基础上，用于SARS病毒RNA抽提的样本可以是患者血清、唾液、嗽口液及排泻物等。
本发明SARS病毒复合荧光定量PCR检测方法如下第一步，根据待扩增的片段，设计PCR引物和探针，不同的探针采用不同的荧光进行标记；第二步，提取样品中的病毒RNA，并反转录成为cDNA；第三步，在荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，同时收集反应管中不同的荧光信号；第四步，通过荧光信号的变化情况，确定SARS病毒的类型及含量。
本发明具有下述优越性第一，在一个反应体系中同时检测多个不同位置的SARS病毒基因片段，其中任何一个片段正常扩增，即可确定为SARS患者，从而大大提高临床检测的速度和检出率，减少假阴性；第二、多个片段同时扩增的方法降低了对引物和探针设计的要求，即使非专业人员也很容易设计出满足检测要求的引物和探针组合。第三，根据不同的SARS病毒株设计不同的引物和探针组合，能对SARS病毒进行快速分型，指导临床治疗。第四，可对SARS病毒进行定量测定。通过测定反应体系中不同荧光信号的变化，可以准确反映出患者SARS病毒的携带量，以及病毒的类型，为临床治疗提供科学依据。第五，灵敏度高。荧光定量PCR技术通过对反应体系中的荧光信号进行实时监控，大大提高了检测的灵敏性，反应体系中即使只存在目标片段的单个拷贝，也能得到有效的扩增与检测。第六，特异性高，检测结果可靠。第七，多个片段的复合检测不仅效率高，而且减少了操作步骤，降低了检测成本，实用性强。
提取样品中的病毒RNA，样品可以是患者血清、唾液、嗽口液、排泻物等。
SARS病毒反转录和PCR扩增在20μl反应体系中，包含特异性引物各0.4μM、荧光探针各0.2μM、0.25mM dNTP、3.5mM MgCl、10个单位的反转录酶和1个单位的热启动Taq DNA聚合酶。反应条件如下反转录42℃温浴20分钟，激活聚合酶95℃温浴10分钟PCR扩增 95℃保温10秒，55℃保温15秒，72℃保温15秒，共进行45个循环。
荧光信号的收集反转录和PCR扩增是在荧光定量PCR仪中进行，在每一个循环的72℃保温结束后，收集反应管中三种不同的荧光信号。根据各种荧光信号的变化情况，确定检测样品中SARS病毒的类型和含量。
提取样品中的病毒RNA，样品可以是患者血清、唾液、嗽口液、排泻物等。
SARS病毒反转录和PCR扩增在20μl反应体系中，包含特异性引物各0.4μM、荧光探针各0.2μM、0.25mM dNTP、3.5mM MgCl、10个单位的反转录酶和1个单位的热启动Taq DNA聚合酶。反应条件如下反转录42℃温浴20分钟，激活聚合酶95℃温浴10分钟PCR扩增 95℃保温10秒，55℃保温15秒，72℃保温15秒，共进行45个循环。
荧光信号的收集反转录和PCR扩增是在荧光定量PCR仪中进行，在每一个循环的72℃保温结束后，收集反应管中三种不同的荧光信号。根据各种荧光信号的变化情况，确定检测样品中SARS病毒变异株的类型和含量。
权利要求
1.SARS病毒复合检测，根据SARS病毒基因组不同区域的序列或不同病毒株序列设计PCR引物和探针，对取得的样品进行扩增，其特征在于以SARS病毒RNA的反转录产物作为模板，进行PCR反应，在同一个反应体系中扩增多个SARS病毒目标片段，采用不同的荧光对不同的探针进行标记，通过检测PCR反应体系中不同荧光信号的变化，确定患者是否感染SARS病毒，以及SARS病毒的类型和含量。
2.根据权利要求1所述的SARS病毒复合荧光定量检测，其特征在于，所述用于复合检测的荧光探针可以是双标记探针(double-labeledprobe)、分子信标(molecular beacon)、能量传递荧光探针(Fluorescent resonance energy transfer)中的一种或一种以上，用于标记探针的荧光可以是FAM、TET、JOE、VIC、HEX、ROX、TAMRA、CY3、CY3.5、CY5、CY5.5、Oregon GreenTM、CAL RedTM、Red 640、Texas Red中的二种或二种以上，所述提取的样品为患者血清、唾液、嗽口液、排泻物中的一种。
3.根据权利要求1、2所述的SARS病毒复合荧光定量检测，其特征在于，采用两步法进行SARS病毒复合荧光定量检测在反转录酶的作用下，将SARS病毒RNA转变为cDNA；再以cDNA为模板，在DNA聚合酶的作用下扩增SARS病毒特异片段。
4.根据权利要求1、2所述的SARS病毒复合荧光定量检测，其特征在于，采用一步法进行SARS病毒的检测，使反转录和PCR扩增在同一反应管中进行。
5.根据权利要求1、2所述的SARS病毒复合荧光定量检测，其特征在于，第一，根据SARS病毒基因组序列设计三套特异性引物和荧光探针，分别扩增SARS病毒的复制酶/聚合酶(Replicase/Polymerase)基因片段、衣壳蛋白(Capsid)基因片段和囊膜蛋白(Envelope)基因片段，三个探针分别用不同的荧光进行标记；第二，SARS病毒反转录和PCR扩增在20μl反应体系中，包含特异性引物各0.4μM、荧光探针各0.2μM、0.25mM dNTP、3.5mM MgCl、10个单位的反转录酶和1个单位的热启动Taq DNA聚合酶，反应条件反转录42℃温浴20分钟、激活聚合酶95℃温浴10分钟、PCR扩增在95℃保温10秒，55℃保温15秒，72℃保温15秒，共进行45个循环；第三，荧光信号的收集反转录和PCR扩增是在荧光定量PCR仪中进行，在每一个循环的72℃保温结束后，收集反应管中三种不同的荧光信号，根据各种荧光信号的变化情况，确定检测样品中是否存在SARS病毒，以及病毒的类型和含量。
6.根据权利要求1、2所述的SARS病毒复合荧光定量检测，其特征在于，第一，根据SARS病毒不同变异株的基因组序列设计三套特异性引物和荧光探针，分别扩增三个不同变异株所特有的基因片段，三个探针分别用不同的荧光进行标记；第二，提取样品中的病毒RNA，所述样品可以是患者血清、唾液、嗽口液、排泻物中的一种，对SARS病毒反转录和PCR扩增在20μl反应体系中，包含特异性引物各0.4μM、荧光探针各0.2μM、0.25mM dNTP、3.5mM MgCl、10个单位的反转录酶和1个单位的热启动Taq DNA聚合酶，反应条件如下反转录在案42℃温浴20分钟、激活聚合酶在95℃温浴10分钟、PCR扩增在95℃保温10秒，55℃保温15秒，72℃保温15秒，共进行45个循环；第三，荧光信号的收集反转录和PCR扩增是在荧光定量PCR仪中进行，在每一个循环的72℃保温结束后，收集反应管中三种不同的荧光信号，根据各种荧光信号的变化情况，确定检测样品中SARS病毒变异株的类型和含量。
全文摘要
本发明SARS病毒复合荧光定量PCR检测涉及一种定量PCR检测方法，根据SARS病毒基因组不同区域的序列或不同SARS病毒变易株序列设计PCR引物和荧光探针，不同的探针采用不同的荧光进行标记；以SARS病毒RNA的反转录产物作为模板，进行PCR扩增；扩增过程中收集反应管中不同的荧光信号，根据荧光信号的变化情况，测定样品中SARS病毒的类型和含量。具有仅仅通过一次反应即可检测多个不同的SARS病毒片段或不同的SARS病毒变异株，同时可对扩增片段进行定量分析的特点。检测体系灵敏度和特异性高，检测结果准确可靠，而且减少了操作步骤，降低了检测成本，实用性强。
文档编号C12P19/00GK1442488SQ0311696
公开日2003年9月17日 申请日期2003年5月16日 优先权日2003年5月16日
发明者张涛, 李宾, 彭永济, 王东, 王燕, 高雨, 孙露 申请人:上海晶泰生物技术有限公司