线粒体肌酸激酶抗体的制作方法

专利名称：线粒体肌酸激酶抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及临床检查领域，尤其涉及测定肌酸激酶(以下简称CK)同功酶的定量法、测定中使用的抗体、测定用试剂以及测定用试剂的配套。
这些同功酶的电泳迁移率，从阴极一侧开始的顺序为mCK(8倍体)、mCK(2倍体)＝CK-MM、CK-MB、CK-BB。为证明mCK(2倍体)的迁移率与CK-MM相同，在保存血液中电泳状态下把其作为CK-MM来测定。其他不是同功酶的还有免疫球蛋白结合生成的大CK。这些都可以用迁移率从酶电泳相中确认。
CK、CK同功酶的定量在临床检查方面广泛应用。其中CK-MB作为心肌梗塞的标记非常重要。CK-MB的定量可用EIA法、免疫阻遏法、电泳法来实施。EIA法能高效测定CK-MB，但需要专用机器，速度较低。电泳法操作烦琐，需要熟练技艺，得出结果前，需要用密度计测出CK-MB的存在比率，也有速度缺陷。免疫阻遏法能用自动分析装置迅速简便的测定，但在测定特异性方面有缺陷。
但是为了早期诊断急性心肌梗塞，广泛使用了能够迅速简便的测定免疫阻遏法。这种方法用针对CK-M辅助单元的特异抗体(以下简称“抗CK-M抗体”)使CK-M辅助单元失去活性，然后测定CK-B辅助单元的活性。用此法，同时也测定了CK-MB以外的CK-BB和mCK(2倍体+8倍体)。其中的CK-BB在血中基本不存在，可以忽略，而且CK-BB脱离的疾病有脑挫伤、多脏器不全，但这类离子并不多。但是，mCK在健康人的血清中具有和CK-MB基本相同的活性量，并且肝病等细胞坏死、恶性肿瘤等也混乱了mCK脱离所引起的结果的判定。最近，由轴状病毒引起的肠炎、新生儿假死等疾病中mCK脱离事件被报道出来。(星野忠，临床病理，46，总会号，57，(1998)、金光房江，临床病理，46，总会号，56，1998)。另外还报道了由于mCK的存在，使酶阻遏法测出的CK-MB测定值受到影响。(第22次千叶临床卫生检查学会抄录6-7，平成13年2月开幕)。因此，报道了一种更准确的测定CK-MB的方法，方法为制造针对mCK活性的特异抗体(以下简称“抗mCK抗体”)，而且针对CK同功酶，使抗CK-M抗体之外的抗mCK起作用来阻遏CK-M辅助单元活性和mCK活性。
据报道，mCK中有遍在(ubiquitous)型mCK(umCK)和肌节(sarcomeric)型mCK(smCK)的同步形态。从mCK的基因分析得出人的mCK和CK-M以及CK-B之间的氨基酸排列的相同性有62-66％，umCK和smCK之间具有80％的相同性，(J.Biol.Chem，265，6921-6927.1998)。此外，把umCK和smCK分离调查各自性状的结果是umCK和smCK分别形成2倍体和8倍体，pI略有不同，8倍体中在各个抗原性方面没有的差别，2倍体被识别出来。(金光房江，临床病理，47，总会号，306，1999)。
mCK的脱离与疾病的关系如上所述，已有许多报道。但是mCK的测定一般采取琼脂糖凝胶泳动法，由于umCK和smCK的泳动基本一样，因此两者被无区别的报道出来。虽然报道了具有抗umCK性的抗体(特开2002-270公开公报)，但没有关于抗umCK抗体的报告，因此两者很难区分开来进行解析。
为完成上述课题而进行的研究结果认为，由于推测正常人体mCK同功酶中大多数是umCK，因此只要得到特异阻遏umCK活性的抗体，就能很容易的对umCK和smCK进行分别测定。因此，从事此项研究的研究人员们不断努力，成功的制造了能特异阻遏umCK活性的抗体，完成了本发明。
本发明由以下各项构成1.阻遏线粒体肌酸激酶(mCK)同功酶中umCK活性的抗mCK抗体。
2.在1中记述的至少60％阻遏umCK活性的抗体。
3.在肌酸激酶(CK)同功酶的分别定量方面，单独或和其他抗mCK的抗体并用时，实际上在不影响测定mCK同功酶以外的CK同功酶的情况下，还能阻遏mCK活性的在1和2中记述的抗体。
4.以单克隆抗体为特征的、在1-3中任一项中记述的抗体。
5.根据受委托号FERM P-18760号，被委托处理的混合体所产生的单克隆抗体。
6.根据受委托号FERM P-18760号，被委托处理的混合体。
7.利用1-5中任一项中记述的抗mCK抗体来测定mCK量的免疫测定法。
8.利用阻遏mCK同功酶中smCK(smCK)活性的抗mCK抗体来测定mCK量的免疫测定法。
9.在7或8中记述的mCK量为umCK量以及/或者smCK量的免疫测定法。
10.包括用在1-5中任一项中记述的抗体进行试剂处理和有选择地排除mCK活性这两个工序的CK同功酶的分别定量法。
11.包括用阻遏smCK活性的抗体单独处理、或者用该抗mCK抗体与1-5任一项中记述的抗体合用进行处理有选择地排除mCK活性这两个工序的CK同功酶的分别定量法。
12.在抗体处理前测定试剂中的CK活性，然后把阻遏umCK活性的mCK抗体、阻遏smCK活性的抗mCK抗体、抗CK-M辅助单元抗体中的任一个或两个以上组合起来处理，以测定残存活性为特征的、在10或11中记述的CK同功酶的分别定量法。
13.包括以针对CK-M辅助单元的抗体进行试剂处理、有选择地排除CK-M活性这两个工序的在10-12的任一项中记述的CK同功酶的分别定量法。
14.把以有选择的排除CK-M活性和mCK活性的处理在同一工序中同时完成为特征的，在13中记述的CK同功酶的分别定量法。
15.把以有选择的排除CK-M活性和mCK活性这一处理过程在两个以上的工序中、在不同时间进行为特征的，在13中记述的CK同功酶的分别定量法。
16.先使针对CK-M辅助单元的抗体起作用，测定残存的CK活性，然后使抗umCK抗体以及/或者抗smCK抗体起作用，测定残存的CK活性，包括以上工序的在15中记述的CK-MB活性和mCK活性的分别定量法。
17.以把从10-16任一项中记述的CK同功酶的分别定量法中得出的测定值与全身疾患想关联为特征的CK同功酶的检查方法。
18.在7-17任一项中记述的CK同功酶活性测定法中，把必要的测定用试剂配套化或由单品构成的CK同功酶测定用试剂。
图2是抗umCK单克隆抗体(UI-1881)的酶活性阻遏能力示意3是抗smCK单克隆抗体(mCKI-578)的酶阻遏能力示意图。
符号说明-○-umCK酶活性阻遏效果-△-smCK酶活性阻遏效果-◆-CK-MM酶活性阻遏效果-■-CK-BB酶活性阻遏效果本发明的抗mCK抗体是指阻遏mCK活性的抗体，阻遏smCK活性是指能特异识别smCK型蛋白质并能特异阻遏其酶活性的抗体。同样，阻遏umCK活性的抗体是指能特异识别umCK型蛋白质并能特异阻遏其酶活性的抗体。在本发明的CK同功酶的分别定量法中，使用的抗体以实际上不影响测定mCK以外的CK同功酶的情况下，还能阻遏mCK活性的抗体为佳。mCK在大多数情况下，在试剂中含5-20U/L，如能阻遏80％以上的mCK，则可在临床检查中使用。阻遏umCK活性的抗体(以下简称“抗umCK抗体”)如单独使用，对mCK的阻遏能力低。但如与阻遏smCK活性的抗体或其他抗体复合物或与能阻遏mCK的化合物共同使用，实际上能获得阻遏80％以上的mCK的效果。本发明的抗umCK抗体能阻遏80％以上的umCK活性，较理想的是70％以上，更理想的是90％以上。
此外，本发明的抗体为多克隆抗体或单克隆抗体均可，但单克隆抗体更为理想。
抗体的制作本发明的抗体，不仅来源于小鼠，还有白鼠、仓鼠、兔、山羊、马等，最理想的是实验小鼠。抗体不局限于IgG，也可使用IgM等。
本发明的抗体可用以往众所周知的免疫学手法。比如用作为抗原的umCK蛋白质，最好是和佐剂混合在一起对哺乳类进行免疫，从免疫后的动物血清等中提取。此外，单克隆抗体和产生单克隆抗体的杂交细胞瘤可通过使来源于免疫后的B淋巴球和各种骨髓细胞相融合的方法制作。具体如下抗体制作中使用的抗原在本发明中，例如在对umCK有特异亲和性且能阻遏其酶活性的抗体制作中，使用的抗原一般是人或哺乳类动物的umCK。为提高特异性，使用目的测定对象物和种特异抗原为好。
具体为在能得到对人体umCK有特异亲和性且能阻遏其酶活性的抗体的情况下，最好使用人体umCK作为抗原。umCK抗原可从生体组织中精制而成，也可用基因工程学的手法获得。市场上出售的抗原，如细胞生物研究所(Institute of Cell Biology，Swiss Federal Instituteof Techonology(ETH))的产品。
免疫方法把精制umCK蛋白质或用以其氨基酸排列为基础的基因工程学手法发现的umCK蛋白质或其部分缩氨基在磷酸缓冲液(PBS)等适当缓冲液中溶解或悬浮，用这样制成的液体作为抗原液。把抗原液中抗原物质调制成50-500μg/mL的浓度为好。缩氨基抗原等只用其一种，抗原性低的情况下，可与清蛋白、KLH等适当运载蛋白质联合使用。用该抗原进行免疫制作的动物有实验小鼠、白鼠、山羊、仓鼠、马、羊、兔等。较理想的是实验小鼠，最理想的是BALB/C实验小鼠。
这时，为提高对免疫动物的抗原应答性，可把该抗原溶液与佐剂混合投药。这里可使用的佐剂有弗罗因德氏完全佐剂(FCA)、弗罗因德氏不完全佐剂、Ribi(MPL)、Ribi(TDM)、Ribi(MPL+TDM)、百日咳疫苗(Boredetella pertussis vaccine)、MDP、铝佐剂(ALCM)以及它们的混合物。初次免疫时用FCA，追加免疫时用FIA或Ribi佐剂，这些混合更为理想。
免疫方法中，根据使用抗原的种类或佐剂是否混合，可对注射部位、时间等做适宜调整。比如，用小鼠作免疫动物时，把佐剂混合抗原液0.05～1ml(抗原物质10～200μg)注射到腹腔皮下、肌肉或(尾)静脉中，从初次免疫开始约每4～21天实行1～4次追加免疫，1～4周后实行最终免疫。如对腹腔注射的抗原量很多，那么该抗原溶液可不使用佐剂便可投药。抗体价通过追加免疫后约5～10天采血进行调查。抗体价的测定以下述的化验结果为标准，可采用通常方法进行。最终免疫后约3～5天，从该免疫动物中分离脾细胞获得抗体产生细胞。
单克隆抗体的制作单克隆抗体(以下简称“MoAb”)用开勒和密尔斯特因(Kohierand Milstein，Nature，256，495～495，1995)的方法制成。作为骨髓瘤细胞的来源，有实验小鼠、白鼠、和人。例如图示实验小鼠骨髓瘤、P3X63-Ag8、P3X63-Ag8-U1、P3NS1-4、SP2/0-Ag14、P3X63-Ag8·653等株化骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞中含有产生免疫球蛋白轻链的物质，把它作为融合对象，就可以把抗体产生细胞产生的免疫球蛋白和这种轻链结合，因此特别适合用于不产生球蛋白的轻链的骨髓瘤细胞如P3X63-Ag8、653、SP2/3-Ag1等。抗体产生细胞和骨髓瘤细胞最好来源于同种动物，尤其是同系统动物。骨髓瘤细胞的保存方法用众所周知的方法即可。如在添加了马、兔、或牛胎儿血清的一般培养基中，对继代培养的物质冻结保存。另外，在细胞融合方面，用对数增殖期的细胞为好。
使抗体产生细胞和骨髓瘤细胞融合来制作杂交细胞瘤的方法有使用聚氧乙烯(PEG)的方法、使用聚甘醇的方法和使用电场融合装置的方法等。例如用PEG法，在含有约30～60％的PEG(平均分子量1,000～6,000)的适当培养基或缓冲液中，使脾细胞与骨髓细胞以1～10∶1，最好是5～10∶1的混合比悬浮，温度25～37℃，pH6～8的条件下使其反应约30秒～3分钟即可。反应结束后，冲洗细胞，去除PEG溶液在培养基中再悬浮，然后在微量滴定实验板上播种继续培养。
融合操作后的细胞在选择培养基中培养，实行杂交细胞瘤的选择。选择培养基是能使亲细胞株死亡、只让融合细胞增殖的培养基，通常使用次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培养基。通常融合操作1-7天后，培养基的一部分，最好是大约一半与选择培养基进行交换，每2～3天以同样的培养基反复交换来培养。通过显微镜观察可确认杂交细胞瘤的菌落生长。
为了知道生长的杂交细胞瘤是否产生所期望的抗体，采取培养上清，用众所周知的方法研究抗体效价。例如，把阶段稀释后的该上清加入固相化抗原蛋白质中使其反应，然后使用荧光物质、酶或放射性同位体(RI)等做过标记的二次抗体(抗球蛋白抗体、抗IgG抗体、抗IgM抗体等)使其再起反应，就可测出该上清中产生的抗体，也可测定抗体价。如抗原是酶等，这种酶和该上清起反应后，使适当的基质起反应，根据是否存在酶阻遏活性，检测出抗体且测定出抗体价。这样，对各洞穴中的培养上清进行甄别，得到产生适当抗体的杂交细胞瘤。
此外，用界限稀释法、软寒天法、利用荧光激起细胞分类器法等可分离出单一纯系。例如，界限稀释法为使杂交细胞瘤的菌落分离成单个细胞/洞穴前后，通过在培养基中阶段培养，可使产生目标抗体的杂交细胞瘤菌落单离。把活动的抗体产生杂交细胞瘤菌落与10％(v/v)的DMSO或丙三醇等冻结保护剂共存的情况下冻结，在一70～-196℃下保存，可以约半年～半永久保存。细胞在使用时，在37℃上下的恒温槽中急速溶解使用。为了不使冻结保护剂的细胞毒性残存，要认真冲洗后再使用。
为调查杂交细胞瘤产生的抗体的免疫球蛋白辅助类，可把该杂交细胞瘤在一般条件下培养，然后用市场上出售的抗体类辅助类判定用配套品对在培养上清中分泌出的抗体分析便可查出。
从杂交细胞瘤中提取MoAb的方法可根据需要量和杂交细胞瘤的性状进行适当选择。例如，从移植了该杂交细胞瘤的小鼠腹水中取得的方法、通过细胞培养从培养上清中取得的方法。如果小鼠腹腔内有可能增殖的杂交细胞瘤，就可以从腹水中获得数mg/mL的高浓度MoAb。在活体内不能增殖的杂交细胞瘤可从细胞培养的培养上清中获取。用细胞培养获取MoAb的方法抗体产生量虽比在活体内低，但混入的小鼠腹腔内的免疫球蛋白和其他杂质很少，具有易于精制的优点。
从移植了杂交细胞瘤的小鼠腹腔内获取抗体的情况，如向预先投入了具有普日斯烷(2，6，10，14-四甲苯基十五烷)等免疫抑制作用的物质的BALB/C小鼠的腹腔内移植杂交细胞瘤(约106个以上)，约1～3周后采取贮留下的腹水。不同种杂交细胞瘤(如小鼠和白鼠)的情况下，使用裸鼠或放射线处理过的小鼠为好。
另一方面，从细胞培养上清中取得抗体情况下，如除了用于细胞维持的静置培养法，还可用高密度培养上清法或旋转烧瓶培养法来培养该杂交细胞瘤且活动含有抗体的培养上清。培养液中的血清含有其他抗体和清蛋白等杂质，抗体精制很烦琐。因此，向培养液中少添加物质为好。最理想的是用常法在无血清培养基中，将杂交细胞瘤驯化，使用无血清培养基的培养法。用无血清培养基来培养使抗体精制变的容易。
从腹水或培养上清中提取MoAb的精制，可用众所周知的方法进行。如用以下方法可很容易的完成作为免疫球蛋白的精制法的用已知的硫酸铵、硫酸钠进行盐析的分离法，聚甘醇分离法，乙醇分离法，DEAE离子交换色层分析法，凝胶过滤法等。应用这些，可以很容易地达成目的。
如MoAb是小鼠IgG，可使用蛋白质结合单体或小鼠免疫球蛋白结合单体用亲和色谱法精制，很简便。
本发明以人体umCK(细胞生物研究所(Institute of Cell Biology)制，Lot No.ETH010122)为抗原，作为能用上述手法对umCK进行特异识别并阻遏的MoAb。该抗体来源于小鼠且是IgG类的抗体，是对能特异阻遏umCK酶活性的物质进行甄别而得的。阻遏力分别为60％以上，更好的为80％以上，最理想的是90％。该抗体是根据委托通商产业省工业技术院生命工程学工业技术研究所处理的杂交细胞瘤而生产的，受托号FERM P-18760号，日期为平成14年3月13日，命名为UI-1881。本发明的抗体并不局限于具体例子，只要能对人体umCK进行特异识别，并能特异阻遏起酶活性的抗体均可。另外，本发明的抗umCK抗体，用于阻遏mCK酶活性时，单独使用也可，复数的mCK抗体，如把识别部位不同的抗体适当组合使用也可。同样，用于阻遏umCK时，单独使用也可，如把识别部位不同的复数抗umCK抗体适当组合使用也可。
另外，本发明的测定方法中，也可使用能够特异识别并阻遏肌节mCK(smCK)的抗体(以下简称“抗smCK抗体”)。作为smCK抗体的例子，可使用如有通商产业省工业技术院生命工程学技术研究所委托处理的杂交细胞瘤中产生的命名为mCKI-578的MoAb。(特开2002-270号公开公报)，受托号FERM BP-7133号，日期平成12年4月13日。这种MoAb可单独或组合使用。
因此，通过把抗umCK抗体和抗smCK抗体单独或组合使用，便可有选择的去除试剂中的mCK、umCK或smCK酶活性。另外，如能与可有选择的排除CK-M辅助单元的抗体共同使用，便可对CK同功酶进行分别定量，CK同功酶即CK-MB、CK-MM、CK-BB及Mck，更具体的说是可以区分umCK酶活性和smCK酶活性。
免疫学测定法本发明的抗umCK抗体和抗smCK抗体可用于EIA、KIA法，免疫凝集反应及其他一切能用抗体测定的所有测定方法。这样可根据测定对象的不同适当选择固定在载体上的抗体、标识抗体、及其他试剂等在最佳条件下使用。如，用免疫手法对umCK抗体和抗smCK抗体单独测定，就可以把以往用电泳动法不能区别的umCK和smCK区别开来进行测定。
利用免疫阻遏法的同功酶测定法CK同功酶测定法的基本原理是利用根据免疫阻遏法有选择的测定CK同功酶酶活性异活性抗体。一般这种方法按照以下步骤来测定C-K-MB的活性。即，使用人类CK-M中特异活性抗体，阻遏试剂中CK-MM和MB辅助单元活性(MB约一半的活性抗体被阻遏)之后，把残存的B辅助单元活性扩大2倍，以此来测定CK-MB活性。CK-MB活性的测定，采用如下程序进行。下述化学式1的左行反应生成ATP，把ATP再与乙糖激酶(HK)和葡萄糖6磷酸脱水酶(G-6-PDH)共同反应生成NADPH，再对NADPH的量的变化进行定量(化学式2)。
化学式1化学式2在上述发明的CK-MB测定法中，可把抗CK-M抗体和抗umCK抗体和/或抗smCK抗体在同一工序中使用，进行测定试剂的处理。例如，上述抗体包含于测定用酶液中，因此可以在同一工序中处理试剂。另一方面，在不同工序中处理的情况下，如向基质液中添加抗umCK抗体和/或抗smCK抗体，由于测定用酶液中含有抗CK-M抗体，也可以进行处理。以测定活性为目的的同功酶是CK-MB的情况下，用抗CK-M抗体和抗mCK抗体(抗umCK抗体和/或抗smCK抗体)在同一工序中处理试剂并进行测定，这样较为简便。
此外，本发明由于使用抗umCK抗体和/或抗smCK抗体对试剂进行处理，这就提供了以有选择的排除mCK酶活性为特征的mCK的测定法。而且，由于使用抗umCK抗体和/或抗smCK抗体对试剂进行处理，提供了以有选择的排除umCK或smCK的酶活性为特征的umCK或smCK的测定方法。也就是说，在本发明的mCK或umCK或smCK的测定法中，把试剂中的对含有mCK的肌酸激酶活性的测定与对上述发明使用抗umCK抗体和抗smCK抗体，这些mCK以外的肌酸激酶的活性测定同时进行，从所得的2种测定值的差中求得mCK或umCK或smCK活性。这时，对测定试剂中含有mCK的肌酸激酶的测定和上述本发明的用抗mCK抗体对mCK以外的肌酸激酶的测定，既可用含有抗CK-M抗体的测定用试剂，也可用抗CK-M抗体的试剂。两种测定只要在同一条件下进行即可。
例如，对试剂中的全CK活性进行测定，测完后加入本发明的抗umCK抗体和/或抗smCK抗体，再次测定，把所得的2种测定值做差，就求得了mCK活性。具体还可求得umCK和/或smCK活性。
先将试剂用抗CK-M抗体进行处理，CK-MM活性CK-MB的约一半活性被阻遏后，先测定一次，能测定出1/2CK-MB+mCK的酶活性(测定值A)，测完后再加入本发明的umCK抗体和/或抗smCK抗体再次测定，就测定出了1/2CK-MB酶活性(测定值B)。这样不仅mCK或umCK或抗smCK而且CK-MB活性也能用同一试剂同时简便迅速的测出。即把测定值B乘以2得出CK-MB活性，通过测定值A与测定值B的差求出mCK或umCK或smCK的活性。
例如，把含有试剂中mCK的CK活性与试剂中mCK以外的CK活性分别进行测定，从所得二者的差中得出mCK活性。再如，象下面这样用配套A和B分别测出各自活性，从两者差中可得mCK活性。这时，如使用在配套A中添加了抗CK-M抗体的CK-MB活性测定试剂，不仅mCK活性，CK-MB活性也可求得。
A.含有试剂中mCK的全CK活性测定用试剂配套。
B.在配套A中添加了抗umCK抗体和/或抗smCK抗体的试剂中的mCK(具体为umCK和/或smCK活性)以外的活性测定用试剂配套。
另外，用本发明的CK同功酶的分别定量法，先用抗umCK抗体和/或抗smCK抗体对抗mCK(具体为umCK和/或smCK活性)以外的肌酸激酶活性进行测定(测定值C)，再用抗CK-M抗体和抗umCK抗体和/或抗smCK抗体对mCK、CK-MM，和1/2CK-MB以外的CK活性进行测定(测定值D)，把测定值C和D分别乘以2再做差，便求得CK-MM活性。
用本发明的方法测定的试剂没有特殊的限制，通常在临床检查领域里进行的测定CK同功酶的方法和试剂都使用。以往的CK同功酶的分离活性中mCK的异常出现可在心肺停止、外伤、小儿腹泻、恶性肿瘤、肝硬化、淤血性心不全等疾病中观察到。(检查和技术，vol，28，no.13，p.1499-1504，2000)从前，由于umCK和smCK在电泳动下泳动状态相同所以不能区分开，但采用本发明的测定法，除上述疾病以外，对umCK和smCK的异常出现以及其比例的调查也成为可能。因此，本发明的测定方法提供了作为多疾病指标的umCK和/或smCK的检查方法。
另外，本发明还提供了本发明的CK同功酶测定法、CK-MB测定法、mCK测定法中所必须的有配套试剂或单一试剂构成的CK同功酶活性测定用的试剂。本发明的CK同功酶测定用试剂是由含有抗mCK酶活性阻遏MoAb或单品构成的。这里所说的试剂当中，包括全CK活性测定试剂和用于急性心肌梗塞的生化诊断的CK-MB测定用试剂，但不局限于这些。
下面实施例具体解释了本发明，但并不说明本发明的应用范围仅限于此。
实施例1产生单克隆抗体(MoAb)的杂交细胞瘤的制作(1)免疫原(抗原)的调制本发明以人体umCK为抗原(细胞生物研究所制Lot No.ETH010122)。
(2)把被免疫的5-8周龄的近交系BALB/c系雌鼠放在饲养动物的室内(23±1℃，温度70％)，用标准颗粒饲养，任意给水。
(3)用免疫方法上述(1)中调制出的以人体umCK为抗原的精制品，用PBS调制成100μg/0.5mL浓度与等量(0.5mL)的弗罗因德氏完全佐剂(frend’s complete adjubantDifco公司制)混合并乳化。把这种乳化抗原给5周龄大雌BALB/C小鼠的腹腔内每只注射200μL，然后每2周把用Ribi佐剂调制成的100μg/mL的上述抗原向每只小鼠中每次注射20μg，共四次。然后，一个月后用Ribi佐剂调制成的100μg/mL浓度的上述抗原进行追加免疫后，测定小鼠的抗体价，对抗体价高的小鼠要在2周后，用PBS调制成100μg/mL的精制人体mCK抗原向小鼠尾静脉注射，实行最终免疫。
(4)抗体价测定(抗体价验定)从免疫开始的时候就定期的从小鼠眼底网膜少量采血，分离血清后，用umCK酶活性抗体法对针对umCK的抗体价进行调查。
把用PBS稀释各个鼠的抗血清10-1000倍调制的抗体液251μL与25μL的umCK酶液(200U/L)加入到96个孔的微孔板中，室温下反应10分钟后，将100μL的酶试剂[100mM咪唑、2mM EDTA、10mM乙酸镁、2mM腺苷-5-二磷酸(ADP)、5mM腺苷-5’-磷酸(AMP)、40μM P1P5、P5-二(腺苷)5磷酸(AP5A)、30mM 1-硫化甘油、28mMD-葡萄糖、2mM NADP、3U/ml HK、2U/ml、葡萄糖-6-磷酸脱水酶、30mM肌氨酸磷酸二钠、0.3mg/mL硝基溴氯化四唑、0.6U/ml DIA、pH 6.6]加入到96个孔的微孔板中，37℃温度下反应10分钟。
随机地，参照试剂盲检，在波长570nm下测定吸光度。而且，取代作为抗体阴性控制的抗血清，添加非免疫鼠，进行阴性控制。
表1

如果umCK酶活性阻遏特异抗体在血液中产生，将阻遏umCK酶活性，抑制基质反应使吸光度的变化量降低。从所得的吸光度中可以确认umCK酶活性阻遏特异抗体的存在。结果如

图1所示，确认了在每一个鼠上的umCK的酶活性的阻遏。
(5)用于细胞融合的细胞从最终免疫开始三天后，进行BALB/c鼠的摘脾，使脾细胞浮游在EMEM培养液上面。接着，将脾细胞用EMEM培养液清洗四次后，计算细胞数，得到7.0×108个脾细胞。细胞融合，以从8-氮鸟嘌呤(2-amino-6-oxy-8 azapurine)抗性的BALB/c鼠得到的骨髓瘤培养细胞株(P3X63-Ag8·653、以下称为“X63细胞”)作为亲细胞株来使用。X63细胞，用含有10％的灭活小牛血清(festal calfserumFCS)的RPMI-1640培养液(20μg/mL，含有8-氮鸟嘌呤)进行继代培养。从细胞融合的三天前用含有不含8-氮鸟嘌呤的10％的FCS的RPMI-1640培养液进一步培养，使用对数增殖期的细胞。将X63细胞用RPMI-1640培养液清洗三次后，计算细胞数目，得到7.0×107个细胞。
在RPNI-1640培养液中，把聚甘醇-4000溶解成50(w/v％的浓度把上述脾细胞和X63细胞按10∶1混合，按照开勒和密尔斯特因氏的方法(Nature第256卷，495-497，1995)以及Eur.J.Immunol.，第6卷，511-519，1996))进行细胞融合。
之后，在添加了10％的FCS的RPMI-1640培养上清中，在含有1×10-4M的次黄嘌呤、4×10-7氨基蝶呤和1.6×10-5M的胸苷(HAT)的HAT选择培养基中，脾细胞以2.0×106个/mL的密度浮游。接着把这种细胞浮游液分别注入96穴的微量滴定实验板的每个穴中，每个注入50μL，然后放在二氧化碳无菌培养箱中在温度37℃、湿度95％、8％的二氧化碳环境中培养。培养开始后，第一天和第二天向每个穴中添加一滴，第七天和第九天添加二滴，继续对HAT选择培养基进行培养。之后，在不含HAT的培养液中培养，约10天～2周后，用选择培养基来确认杂交细胞瘤。
(6)甄别上述所得的杂交细胞瘤中，把能产生具有阻遏人体umC K酶活性的抗体通过以下方法选择出来。
把25μL的杂交细胞瘤培养上清和25μL的人体um C K酶液(200U/L)滴入96穴微量滴定实验板，在温室中反应10分钟后，再把200μL的酶试剂(100mM咪唑，2mM EDTA，10mM酢酸镁，2mM二磷酸腺苷，5mM一磷酸腺苷，40μM P1，P5-(五磷酸腺苷)，30mM1-硫甘油，28Mmd-葡萄糖，2mM NADP，3U/mLHK，2U/mL葡萄糖6磷酸盐脱水素酶，30mM磷酸肌酸二钠，0.3mg/mL蓝四唑氯，0.6U/mL心肌黄酶，pH6.6)滴加到96穴微量滴定实验板上，37℃下使其反应10分钟。然后，在波长570nm下，对照试剂育检，测定吸光度。作为抗体阴性对照，不用杂交细胞瘤培养上清，而是只添加培养液，形成阴性对照。从所得的吸光度中可以对产生的抗人体umCKMoAb的杂交细胞瘤进行测定。
对确认了杂交细胞瘤的96穴微量滴定实验板的2469穴进行甄别，结果确认了有7穴产生人体umCKMoAb的杂交细胞瘤。
实验例1关于培养上清的酶阻遏特异性关于上述甄别得出的7穴中的杂交细胞瘤产生细胞的培养上清，用人体umCK和人体smCK，人体CK-MM，人体CK-BB或人体CK-MB调查各酶活性阻遏，确认了对人体CK同功酶的特异性。为了核对，还调查了根据受托号FERM BP-7133号被委托处理的杂交细胞瘤产生的mCKI-578(特开2002-270公开公报)的MoAb。
其结果如图1所示。纯系号UI-178、UI-281、UI-956、UI-1111、UI-1125、UI-1881以及UI-1299的上清，可阻遏82％以上的umCK酶活性，但对smCK、CK-MM、CK-BB、CK-MB的酶活性完全没有阻遏。尤其是UI-1881的上清可阻遏94％的umCK酶活性。另一方面mCKI-578能阻遏94％的smCK酶活性，但对umCK酶活性和其他同功酶的酶活性没有阻遏。
实验例2产生MoAb杂交细胞瘤株的建立(选择建立)对上述通过甄别得出的7穴中的杂交细胞瘤用极限稀释法进行筛选，选择1纯系的能稳定产生显示mCK酶活性阻遏的杂交细胞瘤。以这个细胞为建立株，委托通商产业省工业技术院生命工程学工业技术研究所进行处理，受托号FERM P-18760号。
实验例3小鼠免疫球蛋白辅助类的同定受托号FERM P-18760号对细胞产生的MoAb(UI-1881)的小鼠免疫球蛋白辅助类用Zymed公司制的。MONOAb验明工具(MONOAbtyping kit)进行同定。结果证明UI-1881是免疫球蛋白G(IgG2b，k)。
实验例4UI-1881对人体CK同功酶的特异性为确认UI-1881对人体CK同功酶的特异性，用人体umCK、人体smCK、人体CK-MM、或人体CK-MB，对个酶活性阻遏进行了确认。并调查mCKI-578(抗smCK MoAb)进行了核查。
其结果如图2和图3所示。UI-1881可阻遏约90％的umCK酶活性，但对smCK、CK-MM、CK-BB和CK-MB的酶活性完全没有阻遏。另一方面，mCKI-578能阻遏约90％的smCK酶活性，对umCK、CK-MM、CK-BB、和CK-MB的酶活性完全没有阻遏。
如上所述，本发明的抗体能够特异阻遏umCK酶活性，而不阻遏其他同功酶的活性。另一方面，抗smCK抗体能特异阻遏smCK酶活性，而不阻遏其他同功酶的活性。把这些抗体组合使用，可以对试剂中的各同功酶进行分别测定。另外，通过分别测定的umCK和smCK，就可以检查出它们的异常出现和比例，与起因于此的疾病之间的关系也可以查明。这样就使从临床检查测定值中诊断各种疾病和早期治疗成为可能。
权利要求
1.阻遏线粒体肌酸激酶(mCK)同功酶中umCK活性的抗mCK抗体。
2.在权利要求1中记述的至少60％阻遏umCK活性的抗体。
3.在肌酸激酶(CK)同功酶的分别定量方面，单独或和其他抗mCK的抗体并用时，实际上在不影响测定mCK同功酶以外的CK同功酶的情况下，还能阻遏mCK活性的在权利要求1和2中记述的抗体。
4.以单克隆抗体为特征的、在权利要求1-3中任一项中记述的抗体。
5.根据受委托号FERM P-18760号，被委托处理的混合体所产生的单克隆抗体。
6.根据受委托号FERM P-18760号，被委托处理的混合体。
7.利用权利要求1-5中任一项中记述的抗mCK抗体来测定mCK量的免疫测定法。
8.利用阻遏mCK同功酶中smCK(smCK)活性的抗mCK抗体来测定mCK量的免疫测定法。
9.在权利要求7或8中记述的mCK量为umCK量以及/或者smCK量的免疫测定法。
10.包括用在权利要求1-5中任一项中记述的抗体进行试剂处理和有选择地排除mCK活性这两个工序的CK同功酶的分别定量法。
11.包括用阻遏smCK活性的抗体单独处理、或者用该抗mCK抗体与权利要求1-5任一项中记述的抗体合用进行处理有选择地排除mCK活性这两个工序的CK同功酶的分别定量法。
12.在抗体处理前测定试剂中的CK活性，然后把阻遏umCK活性的mCK抗体、阻遏smCK活性的抗mCK抗体、抗CK-M辅助单元抗体中的任一个或两个以上组合起来处理，以测定残存活性为特征的、在权利要求10或11中记述的CK同功酶的分别定量法。
13.包括以针对CK-M辅助单元的抗体进行试剂处理、有选择地排除CK-M活性这两个工序的在权利要求10-12的任一项中记述的CK同功酶的分别定量法。
14.把以有选择的排除CK-M活性和mCK活性的处理在同一工序中同时完成为特征的，在权利要求13中记述的CK同功酶的分别定量法。
15.把以有选择的排除CK-M活性和mCK活性这一处理过程在两个以上的工序中、在不同时间进行为特征的，在权利要求13中记述的CK同功酶的分别定量法。
16.先使针对CK-M辅助单元的抗体起作用，测定残存的CK活性，然后使抗umCK抗体以及/或者抗smCK抗体起作用，测定残存的CK活性，包括以上工序的在权利要求15中记述的CK-MB活性和mCK活性的分别定量法。
17.以把从权利要求10-16任一项中记述的CK同功酶的分别定量法中得出的测定值与全身疾患想关联为特征的CK同功酶的检查方法。
18.在权利要求7-17任一项中记述的CK同功酶活性测定法中，把必要的测定用试剂配套化或由单品构成的CK同功酶测定用试剂。
全文摘要
通过对遍在型mCK(umCK)活性和肌节型mCK(smCK)活性进行区别测定，提供一种更准确的mCK同功酶定量方法以及CK同功酶的分别定量法。这通过使用能特异识别umCK蛋白质的抗体进行测定来完成，也可使用其他抗mCK抗体(如smCK)抗体)或抗体CK－M阻遏抗体。上述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。象这样的抗体的例子有可特异识别umCK的IgG类单克隆抗体，是从委托处理号FERM P－18760号特定的杂交细胞瘤中产生的单克隆抗体。
文档编号C12N5/20GK1454902SQ0312212
公开日2003年11月12日 申请日期2003年4月17日 优先权日2002年4月30日
发明者白波瀨泰史, 梶田忠宏, 岸浩司, 山下和昭 申请人:国际试药株式会社