专利名称：一种多种病原体标本检测的新方法
技术领域：
本发明涉及一种生物技术产品的应用，具体地说是利用基因编码识别通用芯片结合PCR技术，实现通过芯片的一次杂交同时分析多份病原体标本的目的。
背景技术：
随着人类基因组(测序)计划的完成以及分子生物学相关学科的迅猛发展，大规模、高通量的分析技术越来越受到重视，结构和功能基因组研究、序列测定、疾病诊断、药物筛选等都离不开高通量样品分析技术。基因芯片(又称DNA芯片)技术就是顺应这一科学发展要求的产物。它融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术，具有操作简单、自动化程度高、序列数量大、检测效率高、应用范围广等特点，很大程度上满足了目前对大规模、高通量分析技术的需要。
基因编码识别通用芯片技术是由F.Barany等(J.MOL.BIO.1999，292251-262)发明的，它最初用于进行高通量的单碱基点突变检测。它是通过结合PCR、连接酶检测技术(LDR)以及基因编码杂交技术而实现的，其检测原理见附
图1。首先是设计合成多组寡核苷酸探针对，每对探针中的一条包含靶基因特异序列以及可寻址的基因条码序列，且该探针的3’端为突变碱基，另一条包含靶基因特异序列及检测报告分子，两条探针与靶基因邻近序列互补，这样，当两探针与靶基因序列杂交而互相靠近时，连接酶以靶基因序列为模板将两段探针序列进行连接，这样在进行杂交时，含有寻址的基因条码序列可被固定有与寻址基因条码序列互补探针的芯片所捕获，再通过报告分子显示信号。因为只有当两条探针完全与模板互补，连接酶才能识别，若有单个碱基突变则不能被连接，而且每对探针中都有一条连接有可寻址基因条码探针，这样根据该寻址探针对应的点的有无信号就可判定待检样品有无产生突变以及哪种基因产生哪种类型的突变等。本方法中所采用的可寻址的基因条码序列是随机产生的人工设计探针，其序列独一无二，因此由这些序列组成的芯片可作为通用芯片，用于任意基因的突变检测，只需变换一下可寻址条码序列后所连接的靶核酸的序列就可实现。用本方法进行突变检测、SNP分析具有高通量、特异性好、灵敏度高、背景低等特点。
目前临床上检测病原体的方法多为血清学方法、分子杂交法及PCR法等，这些方法中以PCR法最为灵敏，可达fg水平(105拷贝)。但常规PCR检测一般是将扩增后的产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后，在紫外灯下通过观察有无特异性的荧光条带的出现判定阴阳结果，其结果的准确性、可靠性受主观及客观因素影响较大，同时溴化乙锭有强致癌毒性。而基于荧光能量传递原理的实时PCR技术虽然能特异、灵敏地同时检测多份标本，但其对荧光探针、PCR条件要求都很高，稍有不注意，就可能造成检测失败。DNA芯片技术在病原体检测中的应用成为协助临床诊断、治疗疾病的有效手段。但目前广泛使用的芯片检测一般是一份标本一次杂交，而运用多荧光标记技术后，其样品分析能力得到一定的提高，但由于受检测技术的限制(一般仪器最多只能同时检测4种荧光)，仍然不能实现一次杂交检测成十上百份标本的目的。而常规PCR技术结合基因条码识别通用芯片技术不但能实现多标本同时分析，而且克服了上述方法检测不便、特异性较差或易受实验条件影响等缺点。
复合探针技术是基于荧光能量传递技术(FRET)而设计的一种新的技术，主要用于进行定量PCR研究(Wang SQ et al，Anal.BioChem.2002)。与其他基于FRET的方法如TaqMan、Amplisensor、Molecular beacon及LightCycler相比，本法淬灭彻底，合成和标记容易，成本低等优点。其检测原理如下复合探针由一条长的荧光杂交探针和短的淬灭探针构成，其中荧光探针5′端接一荧光报告分子，3′端接一延伸阻断分子磷酸，淬灭探针3′端连接一个淬灭分子-对甲基红，淬灭探针与荧光探针5′端互补，无模板时，该探针杂交形成复合探针，无荧光产生，当有模板时，荧光探针与模板杂交，荧光不能被淬灭，产生的荧光与模板量成正比，从而可对初始摸板进行准确定量。基因芯片技术通常需要在杂交后进行洗涤，除去未杂交的标记分子，以免产生较高的背景，但是由于种种因素，在实验中经常会出现尽管经过多次洗涤，但背景仍然很强的情况，影响对最终结果的判定。
表1寻址条码捕获探针的序列及编号编号 序列(5’→3’) Tm(℃)Bar1 GTCT TCTG GCAA TCGT CTCA CGTT-spacer-NH2 71.1Bar2 GCAA TCTG ACCT TCGT CCAT CGTT-spacer-NH2 72.9Bar3 ACCT TCTG AGGA TCGT TGTC CGTT-spacer-NH2 71.7Bar4 AGGA TCTG GTCT TCGT CTTG CGTT-spacer-NH2 72.0Bar5 TCTG TGTC TCGT GCAA CGTT CTCA-spacer-NH2 71.4Bar6 TCGT TGTC CGTT GCAA CTGT CTCA-spacer-NH2 71.4Bar7 CGTT TGTC CTGT GCAA TCTG CTCA-spacer-NH2 73.6Bar8 CTGT TGTC TCTG GCAA TCGT CTCA-spacer-NH2 70.7Bar9 CGTT GGTA CTCA TGTC CCAT CTGT-spacer-NH2 69.4Bar10 CTCA GGTA CTTG CGTT TGTC CCAT-spacer-NH2 71.0Bar11 CTGT GGTA CCAT TGTC CGTT GAGT-spacer-NH2 71.4Bar12 CTTG CCAT CTCA GGTA TGTC GGTT-spacer-NH2 70.9Bar13 TCTG CGAA TGTC CTGT ACCT TCGT-spacer-NH2 71.5Bar14 TGTC CAGA AGTG CTTG CTGT TCGT-spacer-NH2 72.5Bar15 TCGT AGTG CTTG ACCT TCTG CTGT-spacer-NH2 69.7Bar16 CTTG GCAA AGTG CTGT TCGT ACTC-spacer-NH2 69.72.通用芯片的制备用厚约50微米的防水纸制成方形格栅，将其紧密贴于醛基化的玻片上，使玻片分割成10个互相分开的方形小区，每个区的边长为9毫米。然后将氨基修饰的捕获探针以50μmol/L的浓度溶于3×SSC溶液中，用Pix sys 5500芯片制备仪(Catesian Technologies)点到醛基化玻片上的各个方形小区中，这样就得到了包含10个完全一样探针矩阵的芯片(探针矩阵的排列及芯片示意图见附图3)，芯片点制完毕后晾干，放载玻片盒上室温放置备用。3.HBV DNA特异引物、报告探针及淬灭探针的设计与合成参照引物设计原则，选取HBV DNA序列上位于nt2267-2288及nt2356-2378的序列作为PCR扩增检测HBV的上下游引物F1、R1(序列见表2)，F1位于DNA序列的正链上，R1位于序列的负链。根据复合探针分析原理设计报告探针FL及淬灭探针Q，引物与探针均用391A型DNA合成仪合成。报告探针与靶序列负链互补，位于靶序列的nt2326-2353，由28个核苷酸组成，其5′端带一荧光素分子；淬灭探针长21mer，与荧光探针5′端互补，其3′端连接一个淬灭分子-对甲基红。
表2针对HBV DNA设计的引物及探针序列编号序列(5’→3’) 序列位置(nt)F1GGA GTG TGG ATT CGC ACT CCT C2267-2288R1TTC TTC TTC TAG GGG ACC TGC CT 2378-2356FLCy3-ACT TCC GGA AAC TAC TGT TGT TAG ACG A2326-2353Q ACA ACA GTA GTT TCC GGA AGT-Dabcyl 2346-23264.寻址基因条码引物的设计因为所设计的报告探针与靶序列负链互补，这就决定被芯片捕获的应为负链，也就意味着寻址条码序列应位于负链，根据这点，我们将与寻址捕获探针互补的序列与HBV下游引物R1的5’端连接，合成时在两序列之间引入一个乙二醇作为间隔基团，以阻止PCR扩增，各引物序列及编号见表3。
表3检测HBV DNA的含有基因条码序列的引物编号 序列(5’→3’)Bar1R1 AACGTGAGACGATTGCCAGAAGAC-OCH2CH2O-TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTBar2R1 AACGAGTTACGAAGGTCAGATTGC-OCH2CH2O-TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTBar3R1 AACGGACAACGATCCTCAGAAGGT-OCH2CH2O-TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTBar4R1 AACGCAAGACGAAGACCAGATCCT-OCH2CH2O-TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTBar5R1 TGAGAACGTTGCACGAGACACAGA-OCH2CH2O-TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTBar6R1 TGAGAACGTTGCACGAGACACAGA-OCH2CH2O-TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTBar7R1 TGAGCAGATTGCACAGGACAAACG-OCH2CH2O-TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTBar8R1 TGAGACGATTGCCAGAGACAACAG-OCH2CH2O-TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTBar9R1 ACAGATGGGACATGAGTACCAACG-OCH2CH2O-TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTBar10R1 ATGGGACAAACGCAAGTACCTGAG-OCH2CH2O-TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTBar11R1 ACTCAACGGACAATGGTACCACAG-OCH2CH2O-TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTBar12R1 AACCGACATACCTGAGATGGCAAG-OCH2CH2O-TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTBar13R1 ACGAAGGTACAGGACATTCGCAGA-OCH2CH2O-TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTBar14R1 ACGAACAGCAAGCACTTCTGGACA-OCH2CH2O-TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTBar15R1 ACAGCAGAAGGTCAAGCACTACGA-OCH2CH2O-TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCTBar16R1 GAGTACGAACAGCACTTTGCCAAG-OCH2CH2O-TTCTTCTTCTAGGGGACCTGCCT5.HBV DNA的PCR扩增取病人血清50ul，加入10μl Lysis Buffer，煮沸15min，12000rpm离心10min，取上清5μl，加入如下反应体系中PCR Mix 20μl，上游引物F1 0.5μM，下游寻址基因条码引物BarR1 1μM，TaqPolymerase(5u/μl)0.2μl。94℃ 5min；[94℃ 30 Sec，55℃ 30Sec，72℃ 30Sec]40 cycles；72℃ 3min。每个PCR管做上与寻址条码引物及对应标本相应的标志，以防弄混。同时设阳性对照(以含有HBV序列的质粒为模板)及无模板阴性对照。扩增后将这些PCR产物等体积混匀，准备进行芯片杂交检测。6.寡核苷酸通用芯片处理Oligochip先用0.2％SDS清洗2次，接着以水清洗2次，空气凉干。用NaBH4溶液[100ml含20％7醇的PBS溶液中加入1.3g NaBH4]作用10min，封闭玻片表面的醛基。0.2％SDS清洗1次，水清洗1次，晾干后用于杂交。7.杂交及其杂交条件的优化将PCR混合物与杂交液按比例混匀后，取10μl加到芯片的各个方型小区上，并置于杂交盒中，在一定温度下杂交一定时间，芯片杂交完成后用洗液A(1×SSC，0.2％SDS)；洗液B(0.2×SSC)和洗液C(0.1×SSC)各清洗5分钟，然后用Axon4000扫描仪对其进行扫描，并记录结果，根据信号强度对结果进行判定。
(1)杂交体系的组成5×SSC，0.2％SDS，10％甲酰氨，PCR混合物，报告探针。
(2)报告探针的用量在含有相同量PCR混合物的10μl杂交体系中，加入不同量的报告探针，使每个体系中报告探针的终浓度分别为0.01μM，0.02μM，0.04μM，0.08μM，0.1μM.然后将这些体系加在芯片的各个小区上，并于45℃杂交1小时。对扫描结果分析(见附图4)显示，报告探针的用量以0.02μM左右为宜，过少会影响信号强度，过多则背景会较高。
(3)杂交时间的确定将同一杂交体系分成多份，分别加在多张芯片上于45℃进行杂交，在杂交2，5，10，20，30，及60分钟分别取出一张芯片进行扫描(见附图5)，分析并比较结果显示，随杂交时间的增长，信号逐渐增强，到30分钟后信号已基本饱和。
(4)杂交温度的确定将同一杂交体系分成多份，分别加在多张芯片上，于37℃，42℃，45℃，50℃，55℃杂交30分钟后，取出芯片进行扫描，分析并比较结果显示(见附图6)，42℃-50℃杂交信号强度无明显差异，37℃杂交则特异性较差，55℃杂交信号减弱。8.通用芯片特异性分析将基因条码引物Bar1R1、Bar3R1、Bar6R1、Bar8R1、Bar9R1、Bar11R1、Bar14R1、Bar16R1用于扩增阳性模板，而Bar2R1、Bar4R1、Bar5R1等用于扩增阴性对照，然后将这些PCR产物混合后进行杂交检测，结果显示，该芯片能很好地区分阴阳性样品。同时在芯片制备时还点制了空白点样液点及位于扩增区外的HBV探针作为阴性对照，以监测芯片的特异性。9.芯片检测灵敏度分析将含HBV DNA序列的质粒10倍系列稀释，制成浓度为108-102拷贝/ul的系列模板，用Bar1R1-Bar16R1分别扩增同一已知浓度的质粒，然后将PCR产物混合后杂交，对杂交结果分析显示，芯片上每个点的检测限都能达到104拷贝。10.复合探针技术的应用为了确定在杂交中加入淬灭探针是否会影响杂交结果以及洗涤与否对扫描结果有无影响，实验分四组，第一组杂交时只加报告探针，杂交后不洗涤，第二组杂交时只加报告探针，但杂交后进行多步洗涤，第三组杂交时加报告探针和淬灭探针，杂交后不洗涤，第四组杂交时加报告探针和淬灭探针，但杂交后进行多步洗涤，然后将这四组芯片进行扫描，结果分析比较显示(见附图7)，后三组检测的信号强度差异不大，而且背景低且均匀，而第一组背景非常不均匀，影响对结果的判定。因此，在杂交时加入淬灭探针，能有效淬灭过量的报告探针，而不会影响到杂交信号，并且无需洗涤就能达到较好背景，可节省大量时间，这点在同时使用多张芯片进行检测时更能体现出来。11.基因条码识别通用芯片结合复合探针技术分析临床标本将来自医院的阴阳性明确的15份血清标本分别用BarR1-Bar15R1与F1组合进行PCR扩增，Bar16R1扩增阳性对照，各取2uLPCR产物混合，加入0.02μM报告探针，0.02μM淬灭探针，5×SSC，0.2％SDS，10％甲酰氨，使终体积为50μL，取出10μL加在通用芯片的一个小区上，放入杂交盒，置于45℃杂交30分钟后取出，甩去表面的杂交液，用Axon4000扫描仪扫描，其扫描结果见图8，经分析显示，所测定结果与预期结果相吻合，表明利用此方法可实现对多标本的准确测定。
权利要求
1.一种多病原体标本检测的新方法。其特征在于，设计合成待检病原体基因的特异扩增引物及报告探针和淬灭探针，其中一条引物向5’端延伸一段寻址条码序列，该序列与引物间有一间隔臂，可阻止PCR延伸，并且该序列与固定在通用芯片上的可寻址捕获探针互补，通过PCR扩增使产物的末端连上一段可寻址的条码序列，然后将所有PCR扩增产物混合，与报告探针、淬灭探针一起加入到杂交体系，与通用芯片进行杂交，这样这些PCR产物上连接的可寻址条码序列与芯片上互补的寻址捕获探针杂交，从而将扩增产物定向地锚定在芯片对应位置上，被锚定的PCR产物再与荧光等报告分子标记的特异报告探针杂交，通过信号扫描等分析即可检测出每份样品的结果。
2.根据权利要求1，一条寻址条码序列可对应一份样本，有多条寻址条码序列就可对应多份样本，这样通过一次杂交就能同时检测出多份样本，从而实现多样本检测的目的。
3.根据权利要求2，多样本检测可以是检测不同个体的同一病原体、同一个体的不同病原体，也可以是不同个体的不同病原体，可依具体情况而定。
4.权利要求1中的病原体可以是病毒、衣原体、支原体、细菌、真菌、螺旋体、立克次体等可引发人类传染病的病原体。
5.权利要求1中的靶特异报告探针，长15-30mer，位于扩增片段中间，5’末端标记荧光素或生物素等报告分子，且与连有可寻址条码序列的引物所延伸的链互补。淬灭探针较报告探针少5-10个碱基，3′端连接一个淬灭分子-对甲基红，其序列与荧光探针5′端互补。两探针杂交形成二聚物时，可发生荧光能量传递，使报告探针不能发出荧光。
6.权利要求1中的间隔臂可以是-OCH2CH2O-、-O-或-NH2-等基团。
7.根据权利要求1及5，杂交体系中过量的报告探针可与淬灭探针杂交，使其荧光被淬灭，这样即使杂交后不洗涤，芯片的背景也会很低，从而省去了芯片杂交后多步洗涤的步骤，提高检测效率。
全文摘要
本发明涉及一种生物技术产品的应用，具体地说是结合基因芯片及PCR技术进行多份病原体标本的检测。本方法利用基因条码技术定向、自动识别的特点以及PCR扩增可对扩增序列进行5’端修饰的特性，可实现通过芯片的一次杂交分析成十上百份的标本的目的；同时结合复合探针技术，将一对基于荧光能量传递原理设计的报告探针和淬灭探针用于芯片杂交，使过量的报告探针被淬灭探针所淬灭，使芯片杂交后无需进行多步洗涤即能达到较低的背景，减少了操作步骤，提高了分析效率。
文档编号C12Q1/04GK1456685SQ03121040
公开日2003年11月19日 申请日期2003年3月21日 优先权日2003年3月21日
发明者王升启, 陈苏红, 文思远 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所