将植物甾醇发酵制备雄二烯二酮的方法

专利名称：将植物甾醇发酵制备雄二烯二酮的方法
技术领域：
本发明一般地涉及发酵方法，特别是从植物甾醇组合物到雄烯二酮和/或雄二烯二酮的生物转化。
背景技术：
现在甾类药物的制备存在两条主要的途径，其一是薯蓣皂甙元途径，其二是微生物转化途径。薯蓣皂甙元是分离自菊科植物(薯蓣属种)的螺酮缩醇类甾体甙元。在二十世纪四十年代的末期和五十年代的初期，主要利用化学反应发展该途径用于制备甾类化合物的薯蓣皂甙元途径
尽管该途径对于甾类的商业化制备仍然重要，在二十世纪七十年代还是考虑了替代的方法。特别是由墨西哥政府提供的薯蓣皂甙元的价格显著增长，而其原因部分归咎于干植物量中薯蓣皂甙元含量的减少和劳动力成本的增加等等。因此，替代的方法对于将来AD的制备是必需的。
根据二十世纪六十年代和七十年代制药工业的广泛研究可知，很多微生物(如节杆菌属，短杆菌属，微杆菌属，精朊杆菌属，芽孢杆菌属，诺卡氏菌属，链霉菌属和特别是分枝杆菌属的那些)具有将3β-羟基-Δ5-甾醇(如胆甾醇，β-谷甾醇或α-谷甾醇)或甾醇的混合物(如下所述)自然降解为二氧化碳和水的固有能力，在降解中作为中间产物形成4-雄烯-3，17-二酮(雄烯二酮)和1，4-雄二烯-3，17-二酮(雄二烯二酮)。
作为底物用于微生物生物转化的植物甾醇化合物。
β-谷甾醇菜油甾醇 豆甾烷醇菜油甾烷醇 菜子甾醇 α-谷甾醇植物甾醇现有的商业来源之一是植物来源的油类。从这些可用的甾醇到AD和ADD的微生物转化为甾类药物工业提供了非常重要的途径。
ADD在各种合成甾类的生产中是一种基本的原料，所述合成甾类包括抗炎药，口服避孕药，合成肾上腺素甾类药，促蛋白合成类药(生长刺激)和其它合成的甾类。
一般而言，已知的发酵方法包括在适当的营养培养基中增殖分枝杆菌属突变体，将培养物转入含植物甾醇的生物反应器中，随后经过大约120小时生物转化为AD和/或ADD。收获发酵肉汤，用有机溶剂对后者进行提取，随后在有机溶剂中结晶，通常得到白色的结晶粉末状产物AD和/或ADD。涉及讨论已知方法和概述早先研究的参考如下S.Kraychy，和R.D.Muir，美国专利3,684,657(1972).
W.J.Marsheck，S.Kraychy和R.D.Muir，Appl.Microbiol.，23，72(1972).
A.H.Conner，M.Nagaoka，J.W.Rowe和D.Perlman，Appl.和Environ.Microbiol.，32，310(1976)。
K.Kieslich，J.Basic Microbiol.，25，461(1985)。
已知植物甾醇生物转化方法中所存在的问题之一(该问题困扰了整个甾类工业)涉及在含水营养培养基中底物(在这里是植物甾醇组合物)的不充分溶解度。不充分的溶解度是指在营养培养基中底物仅以相对低的浓度存在，从而导致与微生物的接触不充分并通常会导致最终产物的低收率。典型地需要长时间的发酵以达到任何令人满意的生物转化度。为提供一种得到AD和ADD并致力于解决底物溶解度问题的其它途径，本申请人证明了来自林业可以以多公吨量获得的″皂″的植物甾醇(-谷甾醇，菜油甾醇和豆甾烷醇)，能溶解和被分枝杆菌属突变体定量地生物转化为ADD(PCT/CA99/00267)。
已知植物甾醇生物转化方法的另外一个问题是植物甾醇(或植物甾醇组合物)生物转化的最终产物典型地含有显著的AD和ADD。由于AD和ADD具有相似的化学结构，将这两种甾类产物进行随后的相互分离是困难和昂贵的。
因此，为了制备ADD，起始的发酵产物(AD)必须被提取，纯化，随后再进行第二次生物转化以制备ADD。自然地，该方法由于涉及AD发酵的中断，第二生物转化之前AD的移取和纯化，因而是昂贵并且费时的。
本发明的一个目的就是避免或减轻上述缺陷。
发明概述本发明的一个方面，提供了一种将植物甾醇组合物发酵以制备雄烯二酮(雄-4-烯-3，17-二酮或″AD″)和随后的雄二烯二酮(androstadienedione)(雄-1，4-二烯，3，17-二酮或″ADD″)的方法，该方法包括在第一营养培养基中增殖分枝杆菌属(Mycobacterium)的微生物培养物；将微生物培养物和植物甾醇组合物在生物反应器中放置足够的时间以将组合物基本上转化为雄烯二酮(″AD溶液″)；在第二营养培养基中增殖镰孢属(Fusarium)的真菌培养物；随后将1)镰孢属物种；或2)含有镰孢属物种的真菌培养物培养基中的一种或多种注入生物反应器中足够的时间以将AD溶液转化为雄二烯二酮。
本发明进一步包括用雄烯二酮制备雄二烯二酮的方法，该方法包括在1)镰孢属物种；或2)镰孢属物种真菌培养物培养基存在的情况下，在生物反应器中将AD发酵足够的时间，从而将AD转化为ADD。
本发明进一步包括通过上述提及的方法制备的ADD组合物。
本发明所述方法的重要和显著的优点是，使用镰孢属物种的AD到ADD的生物转化与先前的细菌转化在相同的生物反应器中发生，即与从植物甾醇组合物制备AD所用的为同一个生物反应器。换言之，起始发酵步骤中所制得的AD不需要从生物反应器中移出(作为本领域中已知和常规的手段)，反而，为了将AD溶液转化为ADD，将1)真菌培养物，或2)真菌培养物培养基接种入生物反应器中(详细描述如下)。令人惊讶的是，现已发现尽管有残留细菌培养物的存在，镰孢属物种和特别是如下文所述的优选的菌株仍然保持将AD转化为ADD的能力。因此，本发明的方法不涉及起始AD发酵的中断，或第二生物转化之前AD的移出和纯化。显著地节约了时间，能量和材料。
本发明还提供了一种镰孢属的新微生物，下文中以PTA-3947或FMI 33表示，其在2001年12月21日以茄病镰孢(Fusarium solani)FMI33保藏在ATCC。


本发明通过以下非限制性附图进行解释附图1图示了根据本发明从植物甾醇到ADD的微生物转化；和附图2是一个流程图，显示了根据本发明使用茄病镰孢从AD到ADD的生物转化的优选程序。
发明详述以下的详细说明帮助本领域技术人员实施本发明。然而，此详细说明并不解释为对本发明范围的过度限制。本领域普通技术人员可以对在此讨论的实施例进行修饰和变化而不背离本发明范围的精神。
在本发明的第一步，在营养培养基中增殖分枝杆菌属的微生物培养物。本领域中有许多已知和可用的适宜培养基和条件，本发明并不限制于其中的任何一个。但是，在优选方式中，分枝杆菌种在含有精制厂的糖蜜(refiner’s molasses)，硝酸钠，磷酸铵和葡萄糖的种子培养基中生长。在Kutney等的美国专利6,071,714一文中描述了适当的培养基，在此被引入作为参考。
一般地，用于分枝杆菌属种和镰孢属物种培养的营养培养基中应该含有可同化的氮和碳，并在其中维持足够补给量的无菌空气，例如通过将培养基的大表面暴露于空气中或使充足量的空气通过培养基以支持深层生长。
适宜氮源是通常用于此目的的那些，包括大豆粉，棉籽粉，酪蛋白的胰酶消化物，鱼粉，玉米浆，肉膏，蛋白质，带有奶固形物的自溶啤酒酵母，蛋白胨，酵母膏，水解酪蛋白，硝酸盐和/或铵类化合物。其中的大部分也能被用作碳源。其它含有碳的物质包括碳水化合物如甘油，葡萄糖，果糖，蔗糖，乳糖，麦芽糖，肌醇，糊精，糖蜜，淀粉和乳清。可以有利的使用这些碳源和氮源的结合。
如果需要，可以加入磷酸盐，镁和/或亚铁离子作为促生长因子；还可加入缓冲液以确保生长在基本中性的pH开始。消泡剂可能是有益的。当用于诱导发酵的是分离的细胞或酶而不是完整和生长的微生物时，不需要营养物质的存在；但是无论是何种情形，培养基通常主要为含水的。
在本发明的第二步，将溶解于适宜溶剂中的或乳化形式的底物(植物甾醇组合物)和微生物培养物一起加入生物反应器中。进行发酵直到达到最大底物转化(植物甾醇转化为AD溶液)。
只要能促进植物甾醇底物在溶剂中混合，从而最优化微生物培养物对底物的利用率，可以使用任何乳化剂。例子包括但并不局限于聚二醇的脂肪酸酯或乙烯氧基加成化合物和商业可得的名为TeginTM，TweenTM和SpanTM的那些。
或者，可以使用增溶剂溶解植物甾醇组合物以形成澄清溶液，从而提供与在生物转化中所用微生物良好的接触。所选的适宜的增溶剂包括二醇(glycol)家族的成员和硅氧烷家族的成员，它们能使高浓度的植物甾醇被溶解于营养培养基中。这将使得与微生物良好接触，减少发酵时间，并得到最终产物的相对高收率。优选先前已知的增溶剂例如向日葵油。
在本发明的第三步，在第二营养培养基中增殖镰孢属的真菌培养物。如上所述，本领域中有许多已知和可用的适宜培养基和条件，本发明并不限制于其中的任何一个。但是，在优选方式中，镰孢属物种在含有玉米浆和葡萄糖的种子培养基中生长。
在本发明的第四步，将1)镰孢或2)真菌培养物培养基(包含真菌酶)中的一种或多种注入含有AD溶液的生物反应器中，以将AD溶液转化为ADD。在优选的实施方案中，在注入之前对生物反应器进行灭菌以杀灭细菌(例如在120℃左右加热)。
进行″注入″步骤最简单和经济的方法是将真菌培养物培养基中的一些接种到已灭菌的生物反应器中。或者，在另一方面，从培养基中分离真菌细胞(例如通过离心分离)并且仅仅注射这些细胞也是可能的。而且，为了促进存在的酶的接近，这些细胞能被超声或以其它方式破裂，再通过过滤分离或用溶剂如丙酮和水提取酶，随后取代培养基或真菌细胞被注入生物反应器中。
两个″阶段″(植物甾醇到AD；AD到ADD)中各自的最佳底物浓度，底物添加时间和发酵期依赖于所用微生物的类型和确切的发酵条件。确切的条件对于本领域技术人员而言，不需要过度的实验就能容易地确定。
在本发明最优选的方式中，通过使用分枝杆菌属MB 3683完成从植物甾醇组合物到AD的生物转化。本发明最优选的方式中，通过使用茄病镰孢或尖孢镰孢(Fusarium oxysporium)中的一个完成从AD到ADD的生物转化。
本发明的一个实施方案中，使用亚硝基胍对茄病镰孢进行突变制得新的突变体，所述新突变体对于在甾类转化为AD所用的相同反应器中进行AD到ADD的转化尤其有效，即该转化不需要从第一发酵步骤中分离AD。所述突变体微生物已经保藏在美国典型培养物保藏中心(″ATCC″)(10801 University Blvd.，Manassas VA，USA，20110-2209)中，专利保藏号为PTA-3947，其以永久保藏的方式保藏。该微生物的传代培养物在请求时是可获得的，然而，要了解所述可获得并不构成许可实施本发明。
附图1简略地列出了本发明的一个实施方案中微生物和真菌的发酵步骤，其中植物甾醇使用分枝杆菌种转化为AD以及随后AD使用镰孢属物种转化为ADD和勃地酮(boldenone)。
附图2图示了本发明进一步的实施方案，其中ADD直接从AD来源制备。增殖镰孢属物种培养物，在发酵条件下将接种物加入含有AD的容器中。在此之后，分离和纯化ADD。
植物甾醇/植物烷醇在此使用的术语″植物甾醇组合物″包括所有的甾醇并且没有限制，例如谷甾醇，菜油甾醇，豆甾醇，菜籽甾醇(包括二氢菜籽甾醇)，链甾醇，chalinosterol，多孔甾醇，穿贝海绵甾醇，麦角甾醇，粪甾醇，科迪甾醇(codisterol)，异岩藻甾醇(isofucosterol)，岩藻甾醇，桐甾醇，神经甾醇(nervisterol)，7-烯胆甾烷醇，星鱼甾醇，菠菜甾醇，chondrillasterol，peposterol，燕麦甾醇，异燕麦甾醇，fecosterol，pollinastasterol，胆甾醇以及它们的所有天然或合成形式和衍生物，包括异构体。并且包括它们所有的氢化对应物(″植物甾烷醇(phytostanols)″)。植物甾烷醇包括所有饱和或氢化的植物甾醇以及它们的所有天然或合成形式和衍生物，包括异构体。当在说明书全文中存在疑问时，需要了解的是术语“植物甾醇组合物”可包含植物甾醇和植物甾烷醇两者。
用于本发明生物转化的甾醇和甾烷醇(stanols)可以通过许多种天然来源获得。例如，它们可以从植物油(包括水生植物)的加工中获得，所述植物油如玉米油和其它植物油，麦胚芽油，大豆提取物，大米提取物，米糠，菜籽油，向日葵油，芝麻油和鱼(以及其它水产来源)油。它们也可以衍生自真菌，例如麦角甾醇。因此，本发明并不限于甾醇的任何一个来源。美国专利4,420,427中教导了使用溶剂如甲醇从植物油渣中制备甾醇。或者，植物甾醇和植物甾烷醇可以来自林业加工副产品妥尔油树脂(tall oil pitch)或制浆皂(pulping soap)，如美国专利5,770,749中所述，在此引入作为参考。
在发酵方法中，优选温度维持在大约30-37℃的范围内，更优选25-35℃。发酵期间pH的检测显示pH能在起始时大约7.0到收获时大约4.7的范围内变化。发酵或转化过程一旦完成，即用本领域已知和常规的方法回收ADD。
以下的实施例代表实验室试验。然而，每个都能使用已知的工业技术扩展用于工业规模的应用以实施本发明。
实施例1使用分枝杆菌种和茄病镰孢将植物甾醇生物转化为ADD使用分枝杆菌种进行的生物转化(第1阶段)制备分枝杆菌种的种子培养物在液体培养基中制备用于生物转化的接种物。从琼脂斜面(在玻璃试管中培养)接种锥形瓶。对于不超过40L的工作体积，使用每个含200mL种子培养基的1L锥形瓶，而对于50L和更大体积，使用每个含400mL培养基的2L锥形瓶。在无菌条件下进行接种(在防生物危害罩中)。移取无菌水(5mL)到琼脂斜面上。用移液管末端轻轻刮下细菌培养物。然后移取该混悬培养物并放入锥形瓶中。在旋转振荡器上进行细菌增殖(200rpm，1″throw，30℃室温)。在培养72小时后，此种子培养物即可转移至生物反应器中。在接种前对种子培养物长期储存是不可取的。
种子培养方案概述如下培养基种子培养基(每L)54mL Refiners糖蜜(BC糖)5.4g NaNO30.6g NH4H2PO46.0g 葡萄糖调pH至7.0培养基量200mL/烧瓶接种物量每200ml新培养基接种来自琼脂斜面的3ml细胞悬液容器1000mL锥形瓶搅拌振荡器(1″throw)，200rpm温度30℃生长时间72小时培养注解如果在底部有黄色细胞沉淀形成则表示为良好的培养物生长。
制备用于使用分枝杆菌种的3L实验的生物转化培养基该培养基制备过程仅仅用于3L工作体积的实验。在大规模生产中，过程如下所述。
生物转化培养基的组成如下培养基生物转化培养基(以3L培养基计)162mL无菌糖蜜(BC糖)(5.4％v/v)16.2g NaNO3(0.54％)1.8g NH4H2PO4(0.06％)底物30.0g植物甾醇(1.0％)乳化剂480mL向日葵油(16％)在使用前一天，必需量的Refiners糖蜜(162mL)与水(300mL)混合并在锥形瓶中灭菌(121℃持续20分钟)。
在烧瓶或烧杯中混合水(2.0L)和培养基组分(除植物甾醇和向日葵油以外)。用1M NaOH溶液(40g/L NaOH)调培养基的pH值至8.1，将培养基转移至生物反应器中，随后加热至60-70℃。
在烧杯中称重植物甾醇(30g)，加入向日葵油(480mL)，在热板上边加热边搅拌混合物，直至油变澄清。这时通常在～120℃。将油中澄清的黄色植物甾醇溶液倒入生物反应器中已加热的液体培养基中(60-70℃)，无需搅拌。
将发酵罐灭菌(121℃持续30分钟)，然后冷却至30℃。
上述培养基制备的过程仅仅适用于3L的工作体积。
注解生物转化培养基具有7％的干燥物质(折射测量)。
制备用于使用分枝杆菌种的大规模实验的生物转化培养基该培养基的制备过程用于40L和更大的工作体积。
表1.制造商提供的植物甾醇组合物

培养基组成如下培养基生物转化培养基(以每升培养基计)54mL无菌糖蜜(BC糖)(5.4％v/v)5.4g NaNO3(0.54％)0.6g NH4H2PO4(0.06％)底物 10.0g植物甾醇 (1.0％)乳化剂160mL向日葵油 (16％)
在使用前一天，必需量的Refiners糖蜜(54mL/L培养基)与水(100mL/L培养基)混合并灭菌。
发酵罐中在搅拌下混合所有组分(包括必需量的水，但不包括植物甾醇和向日葵油)，以获得一种澄清溶液。水的必需量通过从所需最终体积中减去糖蜜、油和接种物的量而得。用NaOH水溶液(20％)调培养基的pH值至8.L在培养基中加入植物甾醇和向日葵油，并灭菌发酵罐(121℃，30-60分钟)。
注解生物转化培养基具有7％的干燥物质(折射测量)。
在发酵罐中使用分枝杆菌进行的生物转化在带有有效底部搅拌的不锈钢发酵罐中进行生物转化实验。所用发酵罐的主要参数列于表2中。将发酵罐中培养基的温度调至30℃，在无菌条件下加入接种物。整个过程在30℃进行。从此阶段开始到最后都监测该过程的pH值和无菌度。40小时以后开始监测底物(植物甾醇)和产物(AD)。详细的分析过程(HPLC，GC)和结果在下面给出。此过程中生物转化混合物的pH值通常在1 pH单位内变化并未校正。当泡沫层中的产物(AD)浓度达到最大或当底物(植物甾醇)浓度达其起始浓度的1/20时，被认为已经完成生物转化。
表2.用分枝杆菌种进行植物甾醇发酵的参数

注意事项为了与微生物最大化接触，必须伴有高效的搅拌。通常来说，″泡沫牛奶(milk-shake)″外观表征为良好的乳化。
形态学观察(使用光学显微镜进行的研究)
在每阶段(从琼脂斜面到最终的收获)，细胞的形态维持不变，也就是说，细胞具有两极细胞核并且是杆状的。
使用茄病镰孢进行的生物转化(第2阶段)制备茄病镰孢的种子培养物在液体培养基(10g/L玉米浆，10g/L葡萄糖，pH 6.5)中增殖真菌培养物茄病镰孢。从在燕麦粉琼脂上在30℃生长了120小时的培养物接种锥形瓶(1L体积，0.2L培养基)。在旋转振荡器(26℃，120rpm，1″throw)中增殖液体培养基培养物72小时。
也可以将镰孢从液体到液体培养基传代培养，直至4-5代或直到下一个培养物变为粉红色。
摇瓶接种物在4℃下储存不超过1个月，其活性不会发生显著的变化。
使用茄病镰孢的生物转化的制备使用从第一阶段得到的全部生物转化肉汤进行生物转化的第二阶段。
在完成植物甾醇到AD的转化之后(2.3.1.4部分)，将必需的组分(10g/L葡萄糖，10g/L玉米浆)加入第一阶段所得的肉汤中，并用HCl水溶液(4％)调pH至6.7。灭菌肉汤(121℃，30min)，随后将温度调至30℃。
使用第一阶段所得的肉汤和茄病镰孢将AD生物转化为ADD生物转化实验在带有有效底部搅拌的不锈钢发酵罐中进行。所用发酵罐的主要参数列于表3中。将发酵罐中培养基的温度调至30℃并在无菌条件下加入接种物。
表3.用茄病镰孢进行植物甾醇发酵的参数

整个过程在30℃进行。从该阶段开始到最后监测过程的pH值和无菌度。15小时以后开始监测底物(AD)和产物(ADD)。详细的分析过程(HPLC，GC)在4.1部分中给出。过程的监测结果在4.2部分中给出。在此过程中生物转化混合物的pH值通常在1pH单位内变化并未校正。当泡沫层中的产物(ADD)浓度达到最大或当底物(AD)浓度达其起始浓度的1/20时，被认为已经完成生物转化。
该过程通过灭菌结束(121℃，30min)。
实施例2使用茄病镰孢将AD生物转化为ADD的一阶段法制备茄病镰孢的种子培养物在液体培养基(10g/L玉米浆，10g/L葡萄糖，pH6.5)中增殖真菌培养物茄病镰孢。从在燕麦粉琼脂上在30℃生长了120小时的培养物接种锥形瓶(1L体积，0.2L培养基)。在旋转振荡器(26℃，120rpm，1″throw)中增殖液体培养基培养物72小时。
镰孢也可以从液体到液体培养基传代培养，直至4-5代或直到下一个培养物变为粉红色。
摇瓶接种物在4℃下储存不超过1个月，其活性不会发生显著的变化。
用于茄病镰孢的生物转化培养基的制备该方法使用已分离的AD进行。
生物转化培养基的组成如下
培养基生物转化培养基(用于3L培养基)30g葡萄糖 (10％)30mL 玉米浆 (10％v/v)底物 30.0g AD(1.0％)乳化剂480mL 向日葵油 (16％)烧瓶或烧杯中混合水(2.5L)和培养基组分(除AD和向日葵油以外)。用1M NaOH溶液(40g/L NaOH)调培养基的pH值至6.5，将培养基转移至生物反应器中，随后加热至60-70℃。
烧杯中称重AD(30g)，加入向日葵油(480mL)，在热板上边加热边搅拌混合物，直至油变澄清。将油中澄清的黄色AD溶液倒入生物反应器中已经加热的液体培养基中(60-70℃)，无需搅拌。
灭菌发酵罐(121℃持续30分钟)，然后冷却至30℃。
不锈钢发酵罐中AD到ADD的生物转化在带有有效底部搅拌的不锈钢发酵罐中进行生物转化实验。所用发酵罐的主要参数列于表4中。将发酵罐中培养基的温度调至30℃，在无菌条件下加入接种物。整个过程在30℃进行。从此阶段开始到最后监测过程的pH值和无菌度。15小时以后开始监测底物(AD)和产物(ADD)。详细的分析过程(HPLC，GC)和结果在下面给出。此过程中生物转化混合物的pH值通常在1pH单位内变化并未校正。当泡沫层中的产物(ADD)浓度达到最大或当底物(AD)浓度达其起始浓度的1/20时，被认为已经完成生物转化。
该过程通过灭菌结束(121℃，30min)。
表4.用茄病镰孢进行植物甾醇发酵的参数

实施例3发酵肉汤的提取收获发酵肉汤到分液漏斗中。在肉汤中加入乙酸乙酯(6.0L)并振荡2-3分钟。15分钟后该混合物分为两层(乙酸乙酯上层和含水底层)。移去乙酸乙酯层并将其转入其它的容器中。用第二份乙酸乙酯(4.0L)萃取含水底层，移去上层(乙酸乙酯)并将其与第一份乙酸乙酯萃取物合并。将合并的乙酸乙酯萃取物在旋转蒸发器上浓缩形成一种红色粘稠的油(～450ml)，其用于进一步的纯化。
每份乙酸乙酯萃取物和含水残留物通过HPLC进行甾类分析。两阶段法的结果列于表5中，一阶段法的结果列于表6中。
从油中分配ADD将己烷(1.25L)与油性残留物(～450ml)很好的混合。用甲醇(2.0L×2)萃取油-己烷溶液。将这两份甲醇萃取物进行合并并蒸发直至干燥形成浅褐色油性残留物。真空干燥残留物。己烷和甲醇层各个均进行HPLC分析，以控制分配的完成。
A)从植物甾醇发酵为ADD的两阶段发酵物将ADD结晶第一次结晶在一些实验中甲醇蒸发后的残留物被真空干燥。如果这样的话，残留物(～40-50g，ADD含量17-18g，HPLC测得的纯度为30-40％)溶于乙酸乙酯(100ml)中。
如果甲醇蒸发后的残留物不进行真空干燥，随后将残留物溶于乙酸乙酯(250ml)中，用Na2SO4干燥并浓缩至较小体积(100ml)。
加入活性炭(4.0g)并将混合物回流1小时。冷却后，在烧结玻璃漏斗上过滤混合物，并用乙酸乙酯洗涤过滤物。或者，通过硅藻土垫(Celite pad)过滤溶液并用乙酸乙酯洗涤。将滤液在旋转蒸发器上浓缩直至干燥。加入己烷(200ml)，混合物回流搅拌20分钟，冷却至室温并放置30分钟以分离。将上层己烷转入另一个容器中并放置过夜用于结晶。从己烷溶液过滤ADD晶体，用己烷/乙酸乙酯(3/1)洗涤，并减压干燥，以形成白色的ADD晶体(0.23g)。将粘性油溶于乙酸乙酯(8ml)中并加热搅拌10分钟。将溶液冷却至室温并放置过夜。过滤ADD晶体，用己烷/乙酸乙酯(3/1)洗涤，并减压干燥，以形成白色的ADD晶体(2.51g)。将晶体和母液进行HPLC分析。
第二次结晶将第一次结晶后留下的母液在旋转蒸发器上浓缩。加入乙酸乙酯(4ml)，混合物回流搅拌10分钟，冷却至室温并放置过夜用以结晶。过滤ADD晶体，用己烷/乙酸乙酯(3/1)洗涤，并减压干燥，以形成白色的ADD晶体(1.25g)。将产物和母液进行HPLC分析。
表5.来自两阶段法的产物(ADD)的萃取和分配结果

第三次结晶将第二次结晶后留下的母液在旋转蒸发器上浓缩。乙酸乙酯(2ml)和己烷(1mL)混合物回流搅拌10分钟，冷却至室温并放置过夜用以结晶。过滤ADD晶体，用己烷/乙酸乙酯(3/1)洗涤，并减压干燥，以形成白色的ADD晶体(0.16g)。将产物和母液进行HPLC分析。
结晶的ADD的总量为4.25g。
B)从AD发酵为ADD的一阶段发酵物分离ADD第一次结晶如果将甲醇蒸发后的残留物真空干燥，残留物(～40-50g，ADD含量17-18g，HPLC测得的纯度为30-40％)溶于乙酸乙酯(150ml)中。
如果甲醇蒸发后的残留物不真空干燥，随后将残留物溶于乙酸乙酯(250ml)中，用Na2SO4干燥并浓缩至较小体积(150ml)。
加入活性炭(4.0g)并将混合物回流1小时。冷却后，在烧结玻璃漏斗上过滤混合物，并用乙酸乙酯洗涤过滤物。或者，通过硅藻土垫(Celite pad)过滤溶液。将滤液在旋转蒸发器上浓缩直至干燥，然后边加热边将残留物溶于乙酸乙酯(6ml)中，并冷却至室温用以结晶。在放置过夜后，过滤ADD晶体，用己烷/乙酸乙酯(3/1)洗涤，并减压干燥，以形成白色的ADD晶体。将晶体和母液进行HPLC分析。
第二次结晶将第一次结晶后留下的母液在旋转蒸发器上浓缩。加入己烷(50ml)，混合物回流搅拌1小时，冷却至室温并放置30分钟用以分离。上层己烷被转入另外一个容器中并放置过夜用以结晶。粘性油与乙酸乙酯(2ml)、己烷(1ml)混合，边加热边搅拌10分钟。溶液冷却至室温并放置过夜。过滤ADD晶体，用己烷/乙酸乙酯(3/1)洗涤，并减压干燥，以形成白色的ADD晶体。该己烷层也产生了一部分的ADD晶体。将晶体和母液进行HPLC分析。
第三次结晶将第二次结晶后的母液在旋转蒸发器上浓缩。粘性油与乙酸乙酯(1ml)、己烷(3ml)混合，边加热边搅拌10分钟。冷却后，溶液放置过夜以结晶。过滤ADD晶体，用己烷/乙酸乙酯(3/1)洗涤，并减压干燥，以形成ADD晶体。将晶体和母液进行HPLC分析。
ADD结晶的结果列于表6中表6.来自一阶段法的ADD的萃取，分配和结晶结果

实施例5定性(TLC)和定量(HPLC和GC)分析TLC定性分析从发酵罐底部取肉汤样品(每份大约40mL)。用乙酸乙酯(0.5mL)提取肉汤样品(0.5mL)。在硅胶预涂布板(60F254，厚0.2mm)上对0.050mL乙酸乙酯萃取物进行TLC分析。所用流动相为己烷/乙酸乙酯＝3∶1；氯仿/丙酮＝3∶1，或二氯甲烷/丙酮＝9∶1。板展开后，使用下列喷雾(或浸渍)试剂之一。
Cerrium试剂含有(以100mL计)水(94mL)，硫酸铈(IV)(1.0g)，磷钼酸水合物(2.5g)，硫酸(6ml)。这些组分以所列顺序溶解。该试剂能保存一年以上。
钼酸盐试剂含有(以100mL计)水(90mL)，钼酸铵(ammoniummolibdate)(10.85g)，硫酸(6ml))。这些组分以所列顺序溶解。该试剂能保存一年以上。
随后将板在150℃加热3分钟。最终的蓝斑表明了下述化合物的存在(己烷/乙酸乙酯＝3/1)Rf＝0.75-向日葵油；Rf＝0.53-植物甾醇；Rf＝0.47-雄烯二酮(AD)；和Rf＝0.02-雄二烯二酮(ADD)。
AD，ADD和副产物的HPLC监测样品(2g泡沫或2mL液体或10mg晶体)用甲醇稀释至50.0mL，很好的混合并放置10分钟以沉淀蛋白和植物甾醇。过滤溶液的等分试样(Millipore过滤器HV型0.45μm)。使用径向填充柱(固定相C185μm，4×100mm，Waters)进行HPLC分析。
流动相水/甲醇＝4∶6(恒溶剂的)，流速1ml/min，在280nm检测。
AD的标准曲线(mg)＝(8.39×面积+2033)×10-5；其中面积范围为0到30000。
ADD的标准曲线(mg)＝(7.43×面积+72.22)×10-4；其中面积范围为0到100000。
标准曲线根据雄烯二酮(AD)和雄二烯二酮(ADD)纯样品测定结果绘制。产物的保留时间如下化合物 保留时间(min)AD 8.73ADD 13.20底物和产物的GC监测在容量瓶中，将样品(50mg晶体)溶于乙酸乙酯中并稀释至50.0mL。或者，用50mL乙酸乙酯萃取2mL生物转化混合物。然后乙酸乙酯溶液用于植物甾醇、AD和ADD的GC分析。
条件SAC-5柱，烘箱温度278℃，注射温度300℃，检测器FID。
产物的保留时间如下化合物 保留时间(min)AD8.06ADD 9.21菜籽甾醇 20.53菜油甾醇 23.20菜油甾烷醇(campestanol) 23.66豆甾醇24.70β-谷甾醇 27.71谷甾烷醇(豆甾烷醇)28.27植物甾醇和AD生物转化为ADD的结果表7.两阶段生物转化法的监测概述

表8.两阶段生物转化法的监测概述

实施例6新突变体茄病镰孢FMI33的鉴定采用方法产生大亚基(LSU)rRNA基因序列数据。从分离自FMI33真菌菌落的基因组DNA，PCR扩增始于3344位的LSU rRNA基因的大约300个碱基对。使用Microcon100分子量滤膜(Amicon)从过量的引物和dNTPs中纯化扩增产物，并通过将部分产物在琼脂糖胶上跑胶来检测其质量和数量。
使用AmpliTaq FS DNA聚合酶和dRhodamine染料终止剂进行LSU rRNA扩增产物的循环测序。使用Sephadex G-50离心柱除去序列测定反应中过量的染料标记的终止剂。通过离心分离收集产物，真空干燥并冷冻在-20℃直至用于加样。将样品再悬浮于甲酰胺/蓝葡聚糖/EDTA溶液中，并在加样前进行变性。样品在ABI Prism 377 DNA序列测定仪上进行电泳。使用PE/应用生物系统DNA编辑和装配软件进行数据分析。
使用微生物分析软件对样品FMI 33和MicroSeq数据库(MicroSeq database)中的其它微生物进行比较。发现FMI 33与下一个最接近的对比物，茄病镰孢，具有0.94％的遗传图距，这表明FMI33是一个独立的真菌突变体。
FMI 33的序列数据AGACCGATAGCGAACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTTAAACAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGTGACCAGACTTGGGCTTGGTTGATCATCCGGGGTTCTCCCCGGTGCACTCTTCCGGCCAGGCCAGCATCAGTTCGCCCTGGGGGACAAAGGCATCGGGAACGTGGCTCTCTCCGGGGAGTGTTATAGCCCGTTGCGTAATACCCTGCGGCGGACTGAGGTTCGCGCATTCGCAAGGATGCTGGCGTAATGGTCATCAGTGACCCGTCTTGAAACACGGACCAAG
序列表序列表<110>Forbes Modi-Tech Inc.
<120>将植物甾醇发酵制备雄二烯二酮的方法<130>Forb-ADD-PCT<140>PCT/CA03/00131<141>2003-02-03<150>10/066395<151>2002-02-01<160>1<170>PatentIn Ver. 2.1<210>1<211>319<212>DNA<213>镰孢属<400>1agaccgatag cgaacaagta gagtgatcga aagatgaaaa gaactttgaa aagagagtta 60aacagtacgt gaaattgttg aaagggaaga gcttgtgacc agacttggga ttggttgatc 120atccggggtt ctccccggtg cactcttccg gccaggccag catcagttcg ccctggggga 180caaaggcatc gggaacgtgg ctctctccgg ggagtgttat agcccgttgc gtaataccct 240gcggcggact gaggttcgcg cattcgcaag gatgctggcg taatggtcat cagtgacccg 300tcttgaaaca cggaccaag 319
权利要求
1.将植物甾醇组合物发酵以制备雄烯二酮(雄-4-烯-3，17-二酮)和随后制备雄二烯二酮(雄-1，4-二烯，3，17-二酮)的方法，其中包括在第一营养培养基中增殖分枝杆菌属的微生物培养物；将微生物培养物和植物甾醇组合物在生物反应器中放置足够的时间以将该组合物基本上转化为雄烯二酮(″AD溶液″)；在第二营养培养基中增殖镰孢属的真菌培养物；将1)镰孢属物种和2)真菌培养物培养基中的一种或多种注入生物反应器中足够的时间以将AD溶液转化为雄二烯二酮。
2.权利要求1所述的方法，其中真菌培养物是茄病镰孢。
3.权利要求1所述的方法，其中真菌培养物是尖孢镰孢。
4.权利要求1所述的方法，其中的微生物培养物是分枝杆菌MB3683。
5.权利要求1的方法，其中的真菌培养物是茄病镰孢FMI33，以PTA-3947保藏在ATCC。
6.权利要求1所述的方法，其中植物甾醇组合物来自妥尔油树脂或制浆皂。
7.权利要求1的所述的方法，其中植物甾醇组合物来自适宜的经选择的植物油。
8.权利要求7所述的方法，其中植物油选自大豆，菜籽，玉米，棉籽，向日葵，橄榄，亚麻籽或米糠。
9.权利要求1所述的方法，其中植物甾醇组合物包括下述中的一种或多种谷甾醇，菜油甾醇，豆甾醇，菜籽甾醇，链甾醇，chalinosterol，多孔甾醇，穿贝海绵甾醇，以及它们所有的氢化对应物和所有天然或合成形式和衍生物，包括异构体。
10.权利要求1所述的方法，其中第一营养培养基包含Refiners糖蜜和无机盐。
11.权利要求1所述的方法，其中第二营养培养基包括葡萄糖和玉米浆。
12.权利要求1所述的方法，其中发酵在有氧条件下进行。
13.权利要求1所述的方法，其中使用增溶剂将植物甾醇组合物溶于溶液中并随后加至生物反应器中。
14.权利要求13所述的方法，其中增溶剂是二醇家族中的成员。
15.权利要求13所述的方法，其中增溶剂是聚丙二醇。
16.权利要求13所述的方法，其中增溶剂是硅氧烷家族中的成员。
17.权利要求1所述的方法，其中生物反应器在注入1)真菌培养物或2)真菌培养物培养基之前经过灭菌以及随后的冷却。
18.一种用雄烯二酮(AD)制备雄二烯二酮(ADD)的方法，包括在1)镰孢属物种、2)由此得来的酶或3)镰孢属物种真菌培养物培养基存在的情况下，在生物反应器中将AD发酵足够的时间以将AD转化为ADD。
19.权利要求18所述的方法，其中镰孢属物种是以PTA-3947保藏在ATCC的茄病镰孢FMI33。
20.以PTA-3947保藏在ATCC的茄病镰孢FMI33。
21.含有通过权利要求1所述方法制备的ADD的组合物。
22.含有通过权利要求18所述方法制备的ADD的组合物。
全文摘要
将植物甾醇组合物发酵以制备雄烯二酮(雄－4－烯－3，17－二酮)和随后的雄二烯二酮(雄－1，4－二烯，3，17－二酮)的方法，其包括在第一营养培养基中增殖分枝杆菌属的微生物培养物；将微生物培养物和植物甾醇组合物在生物反应器中放置足够的时间以将组合物基本上转化为雄烯二酮(“AD溶液”)；在第二营养培养基中增殖镰孢属的真菌培养物；将1)镰孢属物种或2)真菌培养物培养基中的一种或多种注入生物反应器中，反应足够的时间以将AD溶液转化为雄二烯二酮。
文档编号C12P33/00GK1639354SQ03804973
公开日2005年7月13日 申请日期2003年2月3日 优先权日2002年2月1日
发明者J·P·库特尼, E·J·赫灵顿, G·斯帕索夫 申请人:阿克佐诺贝尔公司