专利名称：海洋毛虾高值生态化利用工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及海洋毛虾高值化生态化利用的新的技术方法，属于应用海洋生物技术领域。
背景技术：
随着世界人口的增加和过度捕捞，使得可捕捞的海洋生物资源量逐渐减少，因此，采用生物技术进行海洋生物资源的优化利用和高值化开发是今后我国海洋高技术发展的重要研究内容之一。例如，将酶工程技术应用于海洋蛋白资源的酶解利用，可以生产新的食品添加剂和工业产品。最近生物技术的发展，已经证实应用酶工程技术可以生产新的食品、食品添加剂，也可以提高废弃物的利用效率。这也符合当今人们对天然食品的迫切要求。
毛虾是我国渤海湾水域的一种低附加值的海洋蛋白资源，每年的捕捞量达到30万吨，到目前为止，没有有效的开发利用，只是晒干制作虾皮或制作虾酱，产品的附加值较低。因此，研究开发毛虾的高效利用技术，成为海洋生物技术研究领域的急需课题。由于毛虾较高的蛋白含量和较低的脂肪含量，因此，毛虾是用于酶解的很好的蛋白资源，开发潜力巨大。
毛虾(Acetes chinensis)的壳中含有几丁质、碳酸钙等无机盐，几丁质及其衍生物由于其生物学活性和农业上的作用，因此具有很好的开发前景。传统制备几丁质的方法，需要应用强酸和强碱去蛋白和矿物质，强酸、强碱，会导致几丁质的部分脱乙酰化和部分水解，并且产生大量的废水，因为废水中含有大量的有机物，直接排放会造成严重的环境污染。
发明内容本发明针对现有技术的不足，提供一种海洋毛虾高值生态化利用新工艺，应用酶工程技术酶解毛虾，制备酶解短肽食品添加剂，在此基础上，，可以减少传统方法对环境的污染。
本发明的海洋毛虾高值生态化利用新工艺包括酶解毛虾制备酶解短肽和进一步利用酶解剩余的残渣制备几丁质和壳聚糖。
本发明的海洋毛虾高值生态化利用新工艺包括如下步骤(1)液体种子的制备培养基饼粉2～3份、玉米粉2～3份、麸皮1～1.5份、Na2HPO40.4～0.5份、KH2PO40.03～0.04份、水100份，均为重量份，下同。灭菌，冷却，接种枯草芽孢杆菌(Bacillus.Subtilis)的茄子瓶菌种的菌悬液5～10份，通风搅拌，培养15～18小时，作为液体种子待用。
(2)液体深层发酵制备蛋白酶制剂培养基豆饼粉3～3.5份、玉米粉3.5～5.0份、麸皮2.0～2.5份、Na2HPO40.4～0.5份、KH2PO40.03～0.04份、水100份，均为重量份，下同。灭菌，接种上述步骤的液体种子，接种量为培养基重量的5～7％，通风搅拌，控温，发酵37～40小时，得蛋白酶制剂。
(3)酶解毛虾制备酶解短肽基本原料毛虾，按鲜重称取毛虾45～50份原料，打浆，然后加入液体重量45～50份的上述蛋白酶制剂，调pH值到6.8～7.3，温度45～50℃，搅拌酶解3.5～4.5小时。酶解完毕，过滤去残渣，滤液浓缩，干燥成粉，即得本发明的酶解短肽产品。
上述酶解短肽产品是一种营养活性肽。
上述步骤(1)的培养基在120℃灭菌30分钟，接种后置发酵罐中，于30～32℃下，通风1∶0.5～0.6，搅拌320～330转/分钟，培养15～18小时，此时pH6.2～6.3。
上述步骤(2)的培养基在发酵罐内接种后，搅拌220～230转/分钟，控制通风量(V风/V液·时间)0～12小时1∶0.5～0.6，12～20小时1∶0.6～0.7，20～28小时1∶0.8～0.9；控制培养温度0～4小时30～32℃，5～8小时间每小时升温2℃，9～12小时，每小时降温2℃，12小时以后，保持30～32℃。每毫升酶活可达6000～7000单位。
上述步骤(1)的培养基中加豆油0.3～0.35重量份作消泡剂。
上述步骤(2)的培养基中加豆油1～1.2重量份作消泡剂。
上述步骤(3)的滤液浓缩至原来体积的1/10～2/10，浓缩液经喷雾干燥制成酶解短肽粉。
上述步骤(3)的去残渣是经板框过滤或离心机分离除去残渣，残渣用以进一步制备几丁质。
最后，经粉碎、质检、包装。本发明的酶解短肽产品可作为食品添加剂广泛用于功能食品。
上述步骤(1)中枯草芽孢杆菌的茄子瓶菌种的菌悬液制作可按已有技术。本发明提供如下具体操作步骤以0.2～0.4份牛肉膏、0.8～1.2份蛋白胨、1.5～2份琼脂、0.4～0.6份NaCl为培养基，水95～100份，均为重量份，pH为7.0～7.2，灭菌，在试管斜面上，划线接枯草芽孢杆菌菌种，30～32℃培养24～26小时，贮藏5℃。将上述菌种移入茄子斜面，培养基与包藏斜面相同，30～32℃培养24～26小时，待作菌悬液用。
上述步骤(3)的残渣用于制备几丁质和壳聚糖，具体步骤如下0.9～1.0重量份毛虾酶解去蛋白后的残渣，先用1M的HCl溶液8～9份，在20～22℃浸泡15～16小时，过滤，固体残渣用去离子水洗至中性。然后产物中以3∶40w/v～3∶45w/v加入0.5M的NaOH，混合物在88～90℃下放置1～1.2小时，反应结束后过滤，沉淀洗至中性，所得产物即为甲壳素，即几丁质。
上述步骤(3)的残渣用于制备壳聚糖，具体步骤如下在上述甲壳素中以1∶2w/v～1∶2.5w/v加入12M的NaOH，在88～90℃反应2～2.5小时，完全脱乙酰，然后将残渣洗至pH中性，冷冻干燥即为壳聚糖。
本发明的优良效果在于将陆地微生物酶工程技术应用于毛虾的综合利用。具体体现在1、运用液体深层发酵工程技术和酶工程技术，发酵生产蛋白酶制剂；2、以发酵生产的蛋白酶制剂酶解毛虾，然后经过滤、浓缩、喷雾干燥，生产许多陆地和化学合成所无法生产的天然、高效、新颖的酶解短肽产品；3、产品集营养性和保健性于一体，具有很高的生物学活性。4、利用酶解剩余的残渣，制备几丁质和壳聚糖，可较少酸碱用量，减少废水中有机物的含量，减少对环境的污染。
具体实施方式
实施例1.
(1)液体种子的制备以重量份牛肉膏0.3份、蛋白胨1份、琼脂2份、NaCl0.5份为培养基，水98份，pH为7.1，灭菌，划线接枯草芽孢杆菌种，30℃培养，培养25小时，贮藏5℃。将上述菌种移入茄子斜面(培养基与保藏斜面相同)，30℃培养25小时，待作菌悬液用。
液体种子培养。培养基豆饼粉3份、玉米粉2份、麸皮1份、Na2HPO40.4份、KH2PO40.04份、水100份，加豆油0.3份作消泡剂。120℃灭菌30分钟，冷却后，接上述茄子瓶菌种的菌悬液10份，150升发酵罐中，装样量70升，于30℃下，通风1∶0.6，搅拌330转/分钟，培养18小时。此时pH6.3。
(2)液体深层发酵制备蛋白酶制剂培养基的组成，均为重量份豆饼粉3份、玉米粉4份、麸皮2.5份、Na2HPO40.5份、KH2PO40.03份、水100份，加豆油1.2份作消泡剂。
1000升发酵罐，装450升培养基，灭菌后pH6.3，接种5％重量百分比的步骤1制备的液体种子，搅拌220转/分，在控制通风量如下0～12小时1∶0.5，12-20小时1∶0.7，20～28小时1∶0.9，控制培养温度如下0～4小时30℃，5～8小时间每小时升温2℃，9～12小时，每小时降温2℃，12小时以后，保持31℃，发酵38小时，每毫升酶活达6500单位。
(3)酶解短肽(营养活性肽)的制备首先称取50份(鲜重)的毛虾，打浆。然后加入50份(液体重量)的蛋白酶制剂，调pH值到7.2，48℃，搅拌酶解4小时，酶解完毕，经板框过滤除去残渣以制作几丁质，滤液收集后浓缩至原来体积的1/10，然后浓缩液经喷雾干燥制成酶解短肽。最后，经粉碎、质检、包装。
(4)几丁质的制备1重量份毛虾酶解去蛋白后的残渣，先用1M的HCl溶液8份，在20℃浸泡16小时，过滤，固体残渣用去离子水洗至中性。然后产物中以3∶40w/v加入0.5M的NaOH，混合物在90℃下放置1小时，反应结束后过滤，沉淀洗至中性，所得产物为甲壳素，即几丁质。
(5)壳聚糖的制备在上述甲壳素中以1∶2w/v加入12M的NaOH，在90℃反应2小时，完全脱乙酰，然后将残渣洗至pH中性，冷冻干燥即为壳聚糖。
实施例2.
(1)液体种子制备茄子瓶菌种的菌悬液同实施例1。
培养基豆饼粉2.5份、玉米粉2.5份、麸皮1.5份、Na2HPO40.5份、KH2PO40.03份、水100份，加豆油0.35份作消泡剂。各成分的用量均为重量份。120℃灭菌30分钟，冷却后，接茄子瓶菌种的菌悬液8份，150升发酵罐中，装样量70升，于31℃下，通风1∶0.5～0.6，搅拌320～330转/分钟，培养17小时。此时pH6.3。
(2)蛋白酶制剂的液体深层发酵1000升发酵罐，装450升培养基，培养基的组成，均为重量份豆饼粉3.5份、玉米粉4.5份、麸皮2.0份、Na2HPO40.4份、KH2PO40.04份、水100份，加豆油1份作消泡剂。灭菌后pH6.2，接种7％重量百分比的步骤1制备的液体种子，搅拌220转/分钟，在控制通风量0-12小时1∶0.6，12-20小时1∶0.6，20-28小时1∶0.8，控制培养温度0-4小时31℃，5-8小时间每小时升温2℃，9-12小时，每小时降温2℃，12小时以后，保持32℃，发酵39小时，每毫升酶活达6800单位。
(3)酶解短肽(营养活性肽)的制备称取50(鲜重)份原料毛虾，打浆，然后加入50份(液体重量)的蛋白酶制剂，调pH值到7.2，温度46℃，搅拌酶解4.5小时。酶解完毕，经板框过滤除去残渣以制作几丁质、壳聚糖，滤液收集后浓缩至原来体积的1/10，然后浓缩液经喷雾干燥制成粉状酶解短肽。最后，经粉碎、质检、包装。
实施例3.同实施例1，所不同的是几丁质和壳聚糖的制备如下1重量份毛虾酶解去蛋白后的残渣，先用1M的HCl溶液7份，在20℃浸泡15小时，过滤，固体残渣用去离子水洗至中性。然后产物中以3∶38w/v加入0.5M的NaOH，混合物在90℃下放置1.2小时，反应结束后过滤，沉淀洗至中性，所得产物即为甲壳素，即几丁质。
在上述甲壳素中以1∶2.5w/v加入12M的NaOH在90℃反应2.5小时，完全脱乙酰，然后将残渣洗至pH中性，冷冻干燥即为壳聚糖。
实施例4.同实施例1，所不同的是(1)液体种子培养。培养基豆饼粉2份、玉米粉2份、麸皮1份、Na2HPO40.4份、KH2PO40.03份、水100份，加豆油0.3份作消泡剂。120℃灭菌30分钟，冷却后，接茄子瓶菌种的菌悬液6份。
(2)液体深层发酵制备蛋白酶制剂培养基的组成，均为重量份豆饼粉3份、玉米粉5份、麸皮2.5份、Na2HPO40.5份、KH2PO40.03份、水100份，加豆油1.2份作消泡剂。
(3)酶解短肽(营养活性肽)的制备称取45(鲜重)份原料，打浆，然后加入50份(液体重量)的蛋白酶制剂，调pH值到7.0，温度46℃，搅拌酶解4小时。酶解完毕，经板框过滤除去残渣以制作几丁质、壳聚糖，滤液收集后浓缩至原来体积的1/10，然后浓缩液经喷雾干燥制成粉状酶解短肽。最后，经粉碎、质检、包装。
本发明不限于上述实施例。
本发明实施例的酶解短肽的外观为灰黄色，有发酵物特殊香味和海洋虾类特有的鲜味，粉状；本产品富含游离氨基酸及功能短肽，功能短肽≥40％。所得壳聚糖外观为半透明白色物，在1％醋酸溶液中溶解性好，为易溶物，本发明制得的壳聚糖的粘度大于1000mPa.s，属于高粘度的壳聚糖。本发明的特点在于集酶工程技术和发酵工程技术于一体，集高值化与生态化于一体，对毛虾这一量大而至今未被有效利用的海洋蛋白资源进行开发利用，既开发出了酶解短肽和壳聚糖等高科技产品，又减少了对环境的污染。本发明的短肽产品具有营养保健的双重功能。制备的几丁质和壳聚糖在环境保护、农业、食品、医药、生物材料等许多领域都具有广阔的应用前景。
权利要求
1.海洋毛虾高值生态化利用工艺，包括如下步骤(1)液体种子的制备培养基饼粉2～3份、玉米粉2～3份、麸皮1～1.5份、Na2HPO40.4～0.5份、KH2PO40.03～0.04份、水100份，均为重量份，灭菌，冷却，接种枯草芽孢杆菌的茄子瓶菌种的菌悬液5～10份，通风搅拌，培养15～18小时，作为液体种子待用；(2)液体深层发酵制备蛋白酶制剂培养基豆饼粉3～3.5份、玉米粉3.5～5.0份、麸皮2.0～2.5份、Na2HPO40.4～0.5份、KH2PO40.03～0.04份、水100份，均为重量份，灭菌，接种上述步骤的液体种子，接种量为培养基重量的5～7％，通风搅拌，控温，发酵37～40小时，得蛋白酶制剂；(3)酶解短肽的制备按鲜重称取45～50份原料毛虾，打浆，然后加入液体重量45～50份的蛋白酶制剂，调pH值到6.8～7.3，温度45～50℃，搅拌酶解3.5～4.5小时；酶解完毕，去残渣，滤液浓缩，干燥成粉。
2.如权利要求1所述的海洋毛虾高值生态化利用工艺，其特征在于，用步骤(3)中的残渣制备几丁质，具体步骤如下0.9～1.0重量份毛虾酶解去蛋白后的残渣，先用1M的HCl溶液8～9份，在20～22℃浸泡15～16小时，过滤，固体残渣用去离子水洗至中性，然后产物中以3∶40w/v～3∶45w/v加入0.5M的NaOH，混合物在88～90℃下放置1～1.2小时，反应结束后过滤，沉淀洗至中性，所得产物为甲壳素，即几丁质。
3.如权利要求2所述的海洋毛虾高值生态化利用工艺，其特征在于，利用几丁质制备壳聚糖，具体步骤如下几丁质中以1∶2w/v～1∶2.5w/v加入12M的NaOH，在88～90℃反应2～2.5小时，完全脱乙酰，然后将残渣洗至pH中性，冷冻干燥即为壳聚糖。
4.如权利要求1所述的毛虾高值化生态化利用技术方法，其特征在于，所述步骤(1)的培养基在120℃灭菌30分钟，接种后置发酵罐中，于30～32℃下，通风1∶0.5～0.6，搅拌320～330转/分，培养15～18小时。
5.如权利要求1所述的毛虾高值化生态化利用技术方法，其特征在于，所述步骤(2)的培养基在发酵罐中接种后，搅拌220～230转/分钟，控制通风量0～12小时1∶0.5～0.6，12～20小时1∶0.6～0.7，20～28小时1∶0.8～0.9；控制培养温度0～4小时30～32℃，5～8小时间每小时升温2℃，9～12小时，每小时降温2℃，12小时以后，保持30～32℃。
6.如权利要求1所述的毛虾高值化生态化利用技术方法，其特征在于，所述步骤(1)的培养基中加豆油0.3～0.35重量份作消泡剂。
7.如权利要求1所述的毛虾高值化生态化利用技术方法，其特征在于，所述步骤(2)的培养基中加豆油1～1.2重量份作消泡剂。
8.如权利要求1所述的毛虾高值化生态化利用技术方法，其特征在于，所述步骤(3)的去残渣是经板框过滤或离心机分离除去残渣。
9.如权利要求1所述的毛虾高值化生态化利用技术方法，其特征在于，所述步骤(3)的滤液浓缩至原来体积的1/10～2/10，浓缩液经喷雾干燥制成酶解短肽粉。
全文摘要
本发明涉及海洋毛虾高值生态化利用工艺，属于应用海洋生物技术领域。以蛋白酶产率高的芽孢杆菌为菌株，通过液体深层发酵生产蛋白酶制剂，酶解海洋毛虾，然后除渣、低温真空浓缩、喷雾干燥而成粉状酶解短肽产品。本产品富含游离氨基酸及功能短肽，活性肽≥40％，本发明产品具有营养、保健的双重功能。利用酶解的剩余残渣，制备壳聚糖，所得壳聚糖外观为半透明白色物，在1％醋酸溶液中溶解性好，为易溶物，本实验制得的壳聚糖的粘度大于1000m Pa.s，属于高粘度的壳聚糖，本方法降低了废水中有机物的含量，减少了对环境的污染。本发明方法提供了一条毛虾资源高值化、生态化利用的有效途径。
文档编号A23J1/00GK1554257SQ200310114638
公开日2004年12月15日 申请日期2003年12月24日 优先权日2003年12月24日
发明者张玉忠, 何海伦, 陈秀兰, 周百成, 高培基 申请人:山东大学