专利名称：一种细胞－材料单元的三维受控堆积成形方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞-材料单元的三维受控堆积成形制造组织器官雏形的工艺方法，属于组织工程技术领域。
背景技术：
人体病损组织与器官的修复与替代是二十一世纪令人瞩目的科学前沿。为了解决这一科学难题，组织工程技术在二十世纪八十年代中期诞生了，它的本质在于将活的细胞通过某种方式与基质材料或支架结合起来制造新的组织。经过二十年左右的发展，组织工程在支架、细胞、生长因子、构建技术、生物学评价、检测技术与标准、临床实验和产业化等方面取得了长足的进步。但是，在构建技术方面，细胞与基质材料或支架的复合方法通常是采用细胞悬液浸泡或者注射装置灌注等方法。这些方法在构建具有复杂的功能梯度结构的组织和器官时，存在以下缺陷一是对于比较厚的组织工程支架，细胞的迁入和繁殖不是特别的理想，血管的长入受到限制；二是不能将不同的细胞在空间准确定位与定点放置，满足构建组织器官的功能梯度结构的需求，然而在复杂组织器官的人工制造过程中，必须将不同细胞和材料堆积到空间指定位置并为它们之间相互作用创造条件。对于细胞-材料的堆积成形，必须满足如下条件①细胞-材料混合物在成形之前呈现一定的流动性，便于挤压和喷射；②喷射到指定位置后，细胞-材料的混合物能够迅速的改变状态，使其保持一定的形状，具有一定的强度；③材料在挤压、喷射之前和堆积成形之后都必须保持适合细胞生存的含大量水分、便于营养和代谢产物交换过程的环境。
中国发明专利(申请号00124985.1)公开了一种“无加热液化过程的挤压、喷射成形工艺方法”，该方法无法在细胞-材料的堆积成形中应用。该方法是将材料经过挤压、喷射后，通过溶剂挥发、水分蒸发、同点或不同点喷射固化剂、粘接剂固化和氢键结合等五种方法使液态的材料固化。所谓固化，材料中就不能包含大量游离的水分，因此这种固化后的环境不适合细胞的生存。
杨洪义，陈立峰和刘海霞等发表于《电加工与模具》2004年第1期的文章“RP技术新进展细胞打印的初步研究”，虽然提出了一种细胞-材料单元的堆积成形工艺方法，但是该方法在材料制备的过程中，将细胞与凝胶混合后，进行挤压和堆积，挤出后的细胞-凝胶材料通过固化成形。这种方法同样基于材料固化的成形机理，固化后的环境同样不适合细胞的生存发明内容本发明的目的在于克服传统的组织工程中的组织器官构建方式，提供一种细胞-材料单元的三维受控堆积成形工艺方法，该方法在现有的计算机控制下的三维快速成形技术的基础上，基于材料在挤压、喷射之后的溶胶-凝胶转变，实现细胞-材料的受控堆积成形。使成形前的细胞生存在材料溶液环境中，成形后的细胞生活在含有大量水分的水凝胶环境中，保证在堆积成形之前和堆积成形之后细胞生存的适合环境，便于细胞的增殖与分化，同时成形后的结构体又具有一定的结构和强度，实现一种或多种细胞在三维空间的准确定位与装配堆积，构建组织器官雏形。
本发明的技术方案如下一种细胞-材料单元的三维受控堆积成形方法，其特征在于该方法按如下步骤进行1)将离子浓度敏感材料和一种或多种促进细胞黏附生长的生物可降解材料制备成水溶液，浓度为10～100g/L，其中的离子浓度敏感材料与促进细胞黏附生长的生物可降解材料的质量比为1∶0.5～10，将所述溶液灭菌备用；2)选定一种或多种细胞，分别与灭菌后的溶液混合均匀，制备成细胞-材料溶液的混合物；根据预先设计的结构和定义规划的路径，在计算机的控制下，将所述的各种细胞-材料溶液的混合物分别通过不同的喷头挤压或喷射出来，形成离散的微滴、微片、微段或连续的微流状细胞-材料单元，堆积到空间指定位置；3)在堆积过程中，细胞-材料单元在有触发离子存在的条件下，迅速发生溶胶-凝胶转变，形成具有一定的形态和强度的细胞-材料凝胶；4).通过逐点逐层的堆积，得到由细胞-材料凝胶构成的且与预先设计结构一致的组织器官雏形。
本发明所述的离子浓度敏感材料为海藻酸钠，触发离子为Ca离子。所述的促进细胞黏附生长的生物可降解材料采用蛋白质、多糖、糖蛋白、蛋白多糖、氨基酸或生长因子。。
本发明具有以下优点及突出性效果1)本发明将离散/堆积成形原理应用于细胞操作。离散堆积成形是一种在计算机驱动控制下的高度柔性的先进成形技术。将它与材料挤压/喷射技术结合，能够解决组织工程研究中具有复杂梯度结构的组织器官构建的难题。
2)将细胞等生物活体纳入了工程技术可加工成形的材料范畴。本发明所采用的工艺方法可以对细胞等生物活体进行装配堆积成形而不损伤其活性。使成形前的细胞生存在材料溶液环境中，成形后的细胞生活在含有大量水分的水凝胶环境中，保证在堆积成形之前和堆积成形之后细胞生存的适合环境，便于细胞的增殖与分化，同时成形后的结构体又具有一定的结构和强度，实现一种或多种细胞在三维空间的准确定位与装配堆积，构建组织器官雏形。通过这些生物活体的装配成形，将工程制造的对象扩大到生命体的范围，是对传统的工程制造概念的重要突破。
图1为细胞-材料溶胶的挤压/喷射堆积成形工艺流程示意图。
图2为实现本发明的工艺方法的设备结构示意图。
具体实施例方式
图1为本发明的工艺路线。将离子浓度敏感材料和一种或多种促进细胞黏附生长的生物可降解材料，在室温下制备成浓度为10～100g/L的生物材料水溶液，其中的离子浓度敏感材料与促进细胞黏附生长的生物可降解材料的质量比为1∶0.5～10，将所述溶液灭菌备用；所选择的材料能够溶解于水形成溶胶，具有特殊的离子浓度敏感特征，能够在特定的离子的触发下发生溶胶-凝胶转变，触发条件要在细胞的生理条件之内，在挤压/喷射之前保持流动态，在挤压/喷射到目标部位后迅速转变为凝胶态。
图2为实现本发明的工艺方法的设备结构示意图。选定一种或多种细胞，分别与灭菌后的溶液混合均匀，制备成细胞-材料溶液的混合物；将这种混合物输入挤压/喷射堆积成形设备中，其结构示意图如图2所示。整个装置包括若干个挤压喷射喷头1、2、3，三维运动平台4，喷射驱动装置5，成形空间和消毒装置6；在计算机CAD模型直接驱动下，通过控制各喷头的扫描运动与挤压喷射运动。根据预先设计的结构和定义规划的路径，将上述细胞-材料溶胶的混合物通过不同的喷头挤压或喷射出来，形成细胞-材料单元(如微滴、微片、微段和微流等)，堆积到空间指定位置；在相应的触发条件下(在空间中充满雾化的触发剂或者喷射触发剂)，堆积后的细胞-材料单元迅速发生溶胶-凝胶转变等，形成具有一定的形态和强度的细胞-材料凝胶。通过逐点逐层的堆积，得到具有一定的结构的组织器官雏形。
3)在堆积过程中，细胞-材料单元在有触发离子存在的条件下，迅速发生溶胶-凝胶转变，形成具有一定的形态和强度的细胞-材料凝胶；4).通过逐点逐层的堆积，得到由细胞-材料凝胶构成的且与预先设计结构一致的组织器官雏形。
实施例1通过该工艺方法制造的软骨细胞-明胶-海藻酸钙三维结构。将海藻酸钠和促进细胞粘附生长的明胶的混合物制备成水溶液，浓度为100g/L，其中海藻酸钠和明胶的质量比为1∶10，灭菌备用；将软骨细胞与材料溶液混合均匀，得到软骨细胞-明胶-海藻酸钠溶液的混合物；制备10％的氯化钙溶液的作为触发剂并使之在成形空间内雾化；根据预先设计的结构和定义规划的路径，将上述混合物通过微滴喷射的方法喷射到充满雾化触发剂的常温无菌成形室中；溶液在喷射到指定位置后，迅速发生溶胶-凝胶转变，形成软骨细胞-明胶-海藻酸钙凝胶；逐层堆积得到含软骨细胞的三维结构。
实施例2通过该工艺方法制造的肝细胞-明胶-肝细胞生长因子-海藻酸钙三维结构。将海藻酸钠、促进细胞粘附生长的明胶和肝细胞生长因子的混合物制备成水溶液，浓度为30g/L，其中海藻酸钠∶(明胶+肝细胞生长因子)为1∶0.67(质量比)，灭菌备用；将肝细胞与材料溶液混合均匀，得到肝细胞-明胶-肝细胞生长因子-海藻酸钠溶液的混合物；制备5％的氯化钙溶液作为触发剂并输入触发剂喷头；根据预先设计的结构和定义规划的路径，将上述混合物通过微滴喷射的方法喷射到成形室中的指定位置，触发剂喷头在相同位置喷射氯化钙溶液，使细胞-材料单元迅速发生溶胶-凝胶转变，形成肝细胞-明胶-肝细胞生长因子-海藻酸钙凝胶；逐层堆积得到含肝细胞的三维结构。
实施例3通过该工艺方法制造的肝细胞-内皮细胞-明胶-海藻酸钙三维结构。将海藻酸钠和促进细胞粘附生长的明胶的混合物制备成水溶液，浓度为10g/L，其中海藻酸钠和明胶的质量比为1∶0.5，灭菌备用；将肝细胞和内皮细胞分别与与材料溶液混合均匀，得到两种细胞-明胶-海藻酸钠溶液的混合物；将两种混合物分别输入不同的喷头；制备20％的氯化钙溶液作为触发剂输入专用的触发剂喷头；根据预先设计的结构和定义规划的路径，将上述混合物通过微滴喷射的方法喷射到制定位置后，触发剂喷头在相同的位置喷射氯化钙溶液，细胞-材料溶液的混合物迅速发生溶胶-凝胶转变，形成细胞-明胶-海藻酸钙凝胶；逐层堆积得到含有准确定位的肝细胞和内皮细胞的三维结构。
权利要求
1.一种细胞-材料单元的三维受控堆积成形方法，其特征在于该方法按如下步骤进行1)将离子浓度敏感材料和一种或多种促进细胞黏附生长的生物可降解材料，制备成水溶液，浓度为10～100g/L，其中的离子浓度敏感材料与促进细胞黏附生长的生物可降解材料的质量比为1∶0.5～10，将所述溶液灭菌备用；2)选定一种或多种细胞，分别与灭菌后的溶液混合均匀，制备成细胞-材料溶液的混合物；根据预先设计的结构和定义规划的路径，在计算机的控制下，将所述各种细胞-材料溶液的混合物分别通过不同的喷头挤压或喷射出来，形成离散的微滴、微片、微段或连续的微流状细胞-材料单元，堆积到空间指定位置；3)在堆积过程中，细胞-材料单元在有触发离子存在的条件下，迅速发生溶胶-凝胶转变，形成具有一定的形态和强度的细胞-材料凝胶；4)通过逐点逐层的堆积，得到由细胞-材料凝胶构成的且与预先设计结构一致的组织器官雏形。
2.按照权利要求1所述的三维受控堆积成形方法，其特征在于所述的离子浓度敏感材料为海藻酸钠，触发离子为Ca离子。
3.按照权利要求1或2所述的三维受控堆积成形方法，其特征在于所述的促进细胞黏附生长的生物可降解材料采用蛋白质、多糖、糖蛋白、蛋白多糖、氨基酸或生长因子。
全文摘要
一种细胞—材料单元的三维受控堆积成形方法，该方法将离子浓度敏感材料和一种或多种促进细胞黏附生长的生物可降解材料制成水溶液，灭菌；然后选定一种或多种细胞，分别与灭菌的溶液混合，制成细胞—材料溶液的混合物；根据预先设计的结构和路径，将各种细胞—材料溶液的混合物分别通过不同的喷头挤压或喷射出来，形成细胞—材料单元，堆积到空间指定位置；在相应的触发条件下，形成一定形态和强度的细胞—材料凝胶；通过逐点逐层的堆积，得到具有一定的结构的组织器官雏形。本发明基于快速成形制造的离散/堆积的基本原理，实现一种或多种细胞在三维空间的准确定位与成形，对细胞等生物活体进行装配堆积成形而不损伤其活性，便于细胞的增殖与分化。
文档编号C12N11/04GK1609210SQ20041000978
公开日2005年4月27日 申请日期2004年11月12日 优先权日2004年11月12日
发明者颜永年, 熊卓, 王小红, 林峰, 吴任东, 张人佶, 卢清萍 申请人:清华大学