专利名称：一种细胞培养支架材料及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种医用生物材料及其制备方法，特别涉及一种以丝素蛋白层为基材，与胶原蛋白、明胶或胶原蛋白、明胶与丝素蛋白的混合物复合而成的纳米纤维无纺毡结构的细胞培养支架材料及其制备方法，属于高分子材料技术领域。
背景技术：
在本发明做出之前，曾经采用天然或合成高聚物经静电纺丝制成纳米纤维无纺膜作为细胞培养载体，例如PCL、PLA、PLGA、胶原蛋白等，前三者具有憎水性，在亲水性的生物环境中不利于细胞的粘附；后者为亲水性天然高聚物，有利于细胞的粘附生长，但由于可纺性及强度较差，且价格昂贵，难以真正投入使用。
丝素蛋白是由十八种氨基酸组成的天然蛋白质，与人体的胶原蛋白有较大的相似性，具有良好的组织兼容性，它是一种亲水性高聚物，在亲水性的生物环境中有利于细胞的粘附生长；丝素蛋白来源于蚕丝纤维，来源丰富、价格低廉，制备方便。因此丝素蛋白是作为组织工程材料理想的基础原料。
公开号为CN1260363A的中国发明专利“一种多孔丝素膜及其制备方法”公开了一种多孔膜，它以蚕丝为主要成膜原料，采用真空冷冻干燥法制得多孔丝素膜，该法制得的膜厚、孔隙率较低、孔隙上下贯通性较差，不利于细胞的生长与培养。
发明内容
本发明的目的克服现有技术存在的不足，提供一种既与人体兼容性好，又具有优异的细胞生长环境，且制备方便的细胞培养支架材料及其制备方法。
本发明采用的技术方案是一种细胞培养支架材料，它由两层三维网状纳米纤维无纺毡结构的材料组成，基材以丝素蛋白层为原料；其上复合的另一层原料选自胶原蛋白、明胶、胶原蛋白与丝素蛋白的混合物、或者明胶与丝素蛋白的混合物；所述的纳米纤维无纺毡的纤维平均直径为40～100nm，平均孔径为1.0～5.0μm，孔隙率为70～90％；以整个支架材料的重量计，含有1～5％的添加剂；所述的添加剂为硼酸钠、氯化钙、醋酸铈中的一种或几种。
优选的技术方案是，以整个支架材料的重量计，丝素蛋白的含量为50～79％，胶原蛋白或明胶的含量为20～45％。
本发明所述的一种细胞培养支架材料的制备方法，先将蚕丝经脱胶、溶解、透析、纯化制得纯丝素溶液后，经干燥制得纯的丝素蛋白，再进行如下步骤的加工a、将上述纯的丝素蛋白、胶原蛋白、明胶或胶原蛋白、明胶与丝素蛋白的混合物分别溶解于同种极性溶剂中制成溶液，所述的极性溶剂为六氟异丙醇、三氟乙醇、无水甲酸及88％甲酸中的一种；b、在制备得到的上述溶液中分别加入1～5％的添加剂，所述的添加剂为硼酸钠、氯化钙、醋酸铈中的一种或几种，制成质量分数为10～20％的丝素蛋白、胶原蛋白、明胶、胶原蛋白与丝素蛋白的混合物、或者明胶与丝素蛋白的混合物的纺丝原液；c、先将丝素蛋白纺丝原液采用静电纺丝工艺，在接收板上得到三维网状纳米纤维丝素蛋白无纺毡；d、再将胶原蛋白、明胶、胶原蛋白与丝素蛋白的混合物、或者明胶与丝素蛋白的混合物的纺丝原液采用静电纺丝工艺，在接收板上得到以丝素蛋白无纺毡为基材，复合另一层三维网状胶原蛋白、明胶、胶原蛋白与丝素蛋白的混合物、或者明胶与丝素蛋白的混合物的纳米纤维无纺毡；e、用50％甲醇、无水甲醇、无水乙醇或甲醇∶乙醇比为1∶1的混合醇中的一种，对上述所得的纳米纤维无纺毡浸渍处理0.5～1h，真空干燥后得到细胞培养支架材料。
上述技术方案中，所述的静电纺丝工艺条件为静电压15～34Kv、纺丝距离为8～20cm、纺丝液喂入量为0.1～5.0ml/h。并可对制得的细胞培养支架材料进行γ射线辐照消毒。
在本发明的技术方案中，选用六氟异丙醇、三氟乙醇、无水甲酸及88％甲酸中的一种作为制备纺丝原液的溶剂，是因为它们不仅是一种容易挥发的极性溶剂，同时，也是丝素蛋白、胶原蛋白或明胶的共溶剂，有利于提高纺丝性能及均匀性，所形成的复合纳米纤维的两层组分结合牢固、不脱落、不分离。
纺丝原液中的添加剂硼酸钠、氯化钙、醋酸铈均为电解质，静电纺丝时它可增高喷射的纺丝原液表面的电荷密度，从而增大喷射液在电场下的牵伸力，有利于形成均匀连续的纳米纤维。
与现有技术相比，本发明的优点在于1、本发明所提供的一种细胞培养支架材料是以丝素蛋白与胶原或明胶复合而成，所用的材料均为由十八种氨基酸组成的天然蛋白质，与人体胶原蛋白有较大的相似性，因此，与人体有优异的组织兼容性，无毒、无刺激和致敏性；尤其是胶原蛋白和明胶，胶原蛋白是由动物细胞合成的一种生物高分子，是缔结组织的主要成份；明胶是由动物体内的骨、筋、腱等胶原蛋白精制而成，与人体具有更佳的组织兼容性。
2、所使用的天然蛋白质均为亲水性高聚物，提供了细胞生长要求的亲水性的生物环境，有利于细胞的粘附、增殖；尤其是胶原与明胶，它们的结构与细胞外基质蛋白的结构和生物性能非常相似，且比丝素更能促进细胞粘附、增殖和生长，因此，以丝素蛋白纳米纤维毡为基材，其上复合一层胶原蛋白、明胶、胶原蛋白与丝素蛋白的混合物、或者明胶与丝素蛋白的混合物纳米纤维毡，不仅给细胞提供了更好的生长环境，而且，大大降低了细胞培养支架材料的成本，并克服了胶原或明胶纤维毡强度差的缺陷。
3、采用静电纺丝技术得到的纳米纤维无纺毡呈三维网状结构，具有纤维细、比表面积大的特点，纤维间形成大量上下贯通的孔隙，它与细胞外基质的结构一致，这种结构环境不仅有利于细胞的生长，并且能使细胞容易地迁移到支架内部，对成纤维细胞、平滑肌细胞或人脐血管内皮细胞等均有良好的粘附、增殖作用，可用于人体皮肤创面或血管等组织的修复。
4、在本发明的技术方案中，对所得到的纳米纤维毡进行有机醇处理，一方面，可使蛋白的无规卷曲构象部分转化为β折叠结构，使纳米纤维膜的强度提高，溶解性降低，更有利于作为细胞培养的支架；另一方面，经有机醇处理，可除去纳米纤维毡中残留的溶剂，真空干燥时又去除有机醇，保证了成品材料具有更好的细胞培养环境。
图1是按本发明实施例1所提供的技术方案制得的细胞培养支架材料的扫描电镜(SEM)图；图2是按本发明实施例2所提供的技术方案制备得到的细胞培养支架材料的SEM图。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例一1.将0.2kg废桑蚕丝放入6L浓度为0.05％的碳酸钠水溶液，煮沸0.5h，重复处理三次，脱尽蚕丝外围的丝胶，得到丝素，室温下晾干；2.将干燥丝素用1.2L摩尔比为1∶8∶2的氯化钙、水、乙醇溶液，在78±2℃下加热溶解成丝素蛋白溶液；3.将步骤2制得的丝素蛋白溶液倒入纤维素透析袋中，先用自来水透析，再用去离子水透析，以除去溶液中的乙醇和氯化钙小分子，再用多层脱脂纱布过滤，制得纯丝素蛋白溶液；4.分别取100ml纯丝素蛋白溶液倒入面积为20×20cm2的聚苯乙烯塑料盘中，在恒温恒湿(25℃，RH65％)下干燥成膜，取下再生丝素膜装袋待用；5.称取11.7g再生丝素膜，加入极性溶剂无水甲酸68g，在室温下搅拌30min，再加入添加剂硼酸钠0.2g，搅拌成均匀的再生丝素纺丝液。纺丝液质量分数14.8％。
6.称取3.0g医用明胶，加入极性溶剂无水甲酸18g，在室温下搅拌30min，再加入添加剂硼酸钠0.1g，搅拌成均匀的明胶纺丝液。纺丝液质量分数14.7％。
7.将步骤5制得的再生丝素纺丝液倒入微量注射泵。由泵将纺丝液注入纺丝管内。将静电发生器的阳极插入纺丝管内，阴极接在金属接收板上，调节静电发生器的静电压为30kV，纺丝距离为15cm，开启静电发生器和微量注射泵，调节微量注射泵使纺丝液的喂入量为1.0ml/h，纺丝液连续喷出，极性溶剂无水甲酸在空气中挥发，在接受板上可收集到丝素纳米纤维毡。
8.将步骤6所得的明胶纺丝液倒入微量注射泵。由泵将纺丝液注入纺丝管内，进行静电纺丝，静电纺丝的静电压26kV，纺丝距离13cm、纺丝液喂入量1.0ml/h。接收板为步骤7已形成的丝素纳米纤维毡，即在丝素纳米纤维毡上复合数层明胶纳米纤维毡，形成明胶/丝素复合纳米纤维毡15g。参见附图1，由扫描电镜(SEM)图可以看出，纤维的平均直径约为95nm、纤维间孔隙平均孔径约为1.2um、孔隙率约为78％。可制得面积为15×15cm2，厚度为0.015mm的无纺毡30张左右。
9将步骤8所得的面积为15×15cm2的纤维无纺毡于室温下放入30ml无水甲醇中浸渍0.5h，随后将纤维毡取出放入真空干燥箱内抽真空24h，用双层塑料袋包装并在高频封口机上封口，然后用γ射线辐照消毒备用。
实施例二.
1.将0.1kg下脚蚕丝放入3L浓度为0.05％的碳酸钠水溶液中，煮沸0.5h，重复处理三次，脱尽蚕丝外围的丝胶，得到丝素；2.将步骤1所得的干燥丝素用0.6L摩尔比为1∶8∶2的氯化钙、水、乙醇溶液，在78±2℃下加热溶解成丝素蛋白溶液；3.将上述丝素蛋白溶液倒入纤维素透析袋中，先用自来水透析，再用去离子水透析，以除去溶液中的乙醇和氯化钙小分子，再用多层脱脂纱布过滤，制得纯丝素蛋白溶液；4.分别取100ml纯丝素蛋白溶液倒入面积为20×20cm2的不锈钢盘中，在-20℃下冷冻8h，再置于冷冻干燥机内真空干燥20h，制得海绵状再生丝素膜。
5.称取4.68g再生丝素膜，加入42.66g三氟乙醇中，在室温下搅拌30分钟，再加入添加剂醋酸铈0.06g，搅拌至全溶解，纺丝液质量分数为10％。
6.称取1.2g I型胶原蛋白，加入11.34g三氟乙醇中，在室温下搅拌30分钟，再加入添加剂醋酸铈0.06g，搅拌至全溶解，纺丝液质量分数为10％。
7.将步骤5制得的再生丝素纺丝液倒入微量注射泵。由泵将纺丝液注入纺丝管内。将静电发生器的阳极固定在纺丝管前的金属针头上，阴极接在金属接收板上，调节静电发生器的静电压为30kV，纺丝距离为15cm，开启静电发生器和微量注射泵，调节微量注射泵使纺丝液的喂入量为1.5ml/h，纺丝液通过纺丝管前的金属针头连续喷出，极性溶剂三氟乙醇在空气中挥发，在接受板上可收集到丝素纳米纤维毡。
8.将步骤6所得的胶原纺丝液倒入微量注射泵。由泵将纺丝液注入纺丝管内，进行静电纺丝，静电纺丝的静电压26kV，纺丝距离13cm、纺丝液喂入量1.0ml/h。接收板为步骤7已形成的丝素纳米纤维毡，即在丝素纳米纤维毡上复合数层胶原纳米纤维毡，形成胶原/丝素复合纳米纤维毡6g，参见附图2，由扫描电镜(SEM)图可以看出，其纤维的平均直径约为80nm、纤维间孔隙平均孔径约为1.0um、孔隙率约为70％。可制得面积为15×15cm2，厚度为0.020mm的无纺毡12张左右。
9将步骤8所得的面积为15×15cm2的纤维无纺毡于室温下放入30ml无水甲醇与无水乙醇为1∶1的混合醇中浸渍1h，随后将纤维毡取出放入真空干燥箱内抽真空24h，用双层塑料袋包装并在高频封口机上封口，然后用γ射线辐照消毒备用。
实施例三.
1.将0.2kg废桑蚕丝放入6L浓度为0.05％的碳酸钠水溶液，煮沸0.5h，重复处理三次，脱尽蚕丝外围的丝胶，得到丝素，室温下晾干；2.将干燥丝素用1.2L摩尔比为1∶8∶2的氯化钙、水、乙醇溶液，在78±2℃下加热溶解成丝素蛋白溶液；3.将步骤2制得的丝素蛋白溶液倒入纤维素透析袋中，先用自来水透析，再用去离子水透析，以除去溶液中的乙醇和氯化钙小分子，再用多层脱脂纱布过滤，制得纯丝素蛋白溶液；4.分别取100ml纯丝素蛋白溶液倒入面积为10×20cm2的聚苯乙烯塑料盘中，在恒温恒湿(25℃，RH65％)下干燥成膜，取下再生丝素膜装袋待用；5.称取8g再生丝素膜，加入极性溶剂无水甲酸59.8g，在室温下搅拌30min，再加入添加剂硼酸钠0.15g，搅拌成均匀的再生丝素纺丝液；纺丝液质量分数12％。
6.称取4.0g医用明胶和再生丝素膜1.2g，加入极性溶剂无水甲酸39.2g，在室温下搅拌30min，再加入添加剂硼酸钠0.15g，搅拌成均匀的明胶-丝素纺丝液；纺丝液质量分数12％。
7.将步骤5制得的再生丝素纺丝液倒入微量注射泵。由泵将纺丝液注入纺丝管内。将静电发生器的阳极插入纺丝管内，阴极接在金属接收板上，调节静电发生器的静电压为30kV，纺丝距离为15cm，开启静电发生器和微量注射泵，调节微量注射泵使纺丝液的喂入量为1.0ml/h，纺丝液连续喷出，极性溶剂无水甲酸在空气中挥发，在接受板上可收集到丝素纳米纤维毡。
8.将步骤6所得的明胶纺丝液倒入微量注射泵。由泵将纺丝液注入纺丝管内，按步骤7进行静电纺丝，接收板为步骤7已形成的丝素纳米纤维毡，即在丝素纳米纤维毡上复合数层明胶-丝素纳米纤维毡，形成明胶-丝素/丝素复合纳米纤维毡13.5g，纤维的平均直径约为89nm、纤维间孔隙平均孔径约1.0um、孔隙率约为75％。可制得面积为15×15cm2，厚度为0.020mm的无纺毡22张左右。
9将步骤8所得的面积为15×15cm2的纤维无纺毡于室温下放30ml无水甲醇中浸渍0.5h，随后将纤维毡取出放入真空干燥箱内抽真空24h，用双层塑料袋包装并在高频封口机上封口，然后用γ射线辐照消毒备用。
权利要求
1.一种细胞培养支架材料，其特征在于它由两层三维网状纳米纤维无纺毡结构的材料组成，基材以丝素蛋白层为原料；其上复合的另一层原料选自胶原蛋白、明胶、胶原蛋白与丝素蛋白的混合物、或者明胶与丝素蛋白的混合物；所述的纳米纤维无纺毡的纤维平均直径为40～100nm，平均孔径为1.0～5.0μm，孔隙率为70～90％；以整个支架材料的重量计，含有1～5％的添加剂；所述的添加剂为硼酸钠、氯化钙、醋酸铈中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述的细胞培养支架材料，其特征在于以整个支架材料的重量计，丝素蛋白的含量为50～79％，胶原蛋白或明胶的含量为20～45％。
3.一种细胞培养支架材料的制备方法，先将蚕丝经脱胶、溶解、透析、纯化制得纯丝素溶液后，经干燥制得纯的丝素蛋白，其特征在于再进行如下步骤的加工a、将上述纯的丝素蛋白、胶原蛋白、明胶或胶原蛋白、明胶与丝素蛋白的混合物分别溶解于同种极性溶剂中制成溶液，所述的极性溶剂为六氟异丙醇、三氟乙醇、无水甲酸及88％甲酸中的一种；b、在制备得到的上述溶液中分别加入1～5％重量的添加剂，所述的添加剂为硼酸钠、氯化钙、醋酸铈中的一种或几种，制成质量分数为10～20％的丝素蛋白、胶原蛋白、明胶、胶原蛋白与丝素蛋白的混合物、或者明胶与丝素蛋白的混合物的纺丝原液；c、先将丝素蛋白纺丝原液采用静电纺丝工艺，在接收板上得到三维网状纳米纤维丝素蛋白无纺毡；d、再将胶原蛋白、明胶、胶原蛋白与丝素蛋白的混合物、或者明胶与丝素蛋白的混合物的纺丝原液采用静电纺丝工艺，在接收板上得到以丝素蛋白无纺毡为基材，复合另一层三维网状胶原蛋白、明胶、胶原蛋白与丝素蛋白的混合物、或者明胶与丝素蛋白的混合物的纳米纤维无纺毡；e、用50％甲醇、无水甲醇、无水乙醇或甲醇∶乙醇比为1∶1的混合醇中的一种，对上述所得的纳米纤维无纺毡浸渍处理0.5～1h，真空干燥后得到细胞培养支架材料。
4.根据权利要求3所述的一种细胞培养支架材料的制备方法，其特征在于所述的静电纺丝工艺条件为静电压15～34Kv、纺丝距离为8～20cm、纺丝液喂入量为0.1～5.0ml/h。
5.根据权利要求3所述的一种细胞培养支架材料的制备方法，其特征在于将制得的细胞培养支架材料再经γ射线辐照。
全文摘要
本发明公开了一种细胞培养支架材料及其制备方法。它以蚕丝为主要原料，经脱胶、溶解、纯化、干燥形成丝素蛋白，与胶原蛋白或明胶天然蛋白质分别溶解于同种溶剂后，依次采用高压静电纺丝制得以丝素蛋白为基材、胶原蛋白、明胶等为复合层的三维网状丝素复合纳米纤维无纺毡，再经有机醇处理。纤维平均直径小于100nm，纤维间的孔隙上下贯通，平均孔径为1.0～5.0μm，孔隙率达70～90％。经测试表明，该纳米纤维无纺毡无毒、无刺激和致敏性，与人体具有优异的组织兼容性；同时无纺毡为三维立体结构并有大量上下贯通的孔隙及适宜的孔径，因此可作为细胞培养支架材料用于人体组织修复。
文档编号A61L27/34GK1887362SQ20061004101
公开日2007年1月3日 申请日期2006年7月13日 优先权日2006年7月13日
发明者张幼珠, 尹桂波, 鲍韡韡, 王曙东, 吴佳林 申请人:苏州大学