专利名称：新一代庆大霉素、制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗生素发酵，具体地说是涉及发酵制备提高优质组份含量的新一代庆大霉素、制备方法及其用途。
背景技术：
庆大霉素是1963年在美国发现的抗生素。在世界范围内广泛应用于临床。1967年中国开始生产庆大霉素。目前中国已成为世界上主要的庆大霉素生产国，并成为国际上最大的庆大霉素供应地。
庆大霉素是由绛红小单孢菌(Micromonospora purpurea)生产的抗生素。它是一个多组份的氨基苷类抗生素，其分子由三个环状结构组成，分别为糖胺，2-脱氧链霉胺和绛红糖胺。由于在绛红糖胺上存在不同位置的甲基化，所以庆大霉素由不同甲基化的组份组成。国际上对庆大霉素的质量有明确规定，其标准主要是根据庆大霉素组份的比例而定，如庆大霉素C1应不低于25％，C1a应控制在15-40％，C2和C2a应控制在20-50％。
近40年来，庆大霉素被广泛应用于治疗人类疾病和畜牧业。庆大霉素尤其对绿脓杆菌，肠道杆菌和金葡菌感染的疗效显著，极大的提高了人们的健康质量，并且保证了牧业的稳定生产。但是庆大霉素和其它一些药物抗生素一样，在有显示疗效的同时，伴随产生了严重的副作用。这些毒性主要反映在耳和肾等器官上。
科学家对如何降低庆大霉素的毒性进行了长期的探讨。这些主要集中在制剂方面，即加入添加剂，如甲磺酸去铁胺(陈阳等《中华耳鼻咽喉科杂志》1999年6月第34卷第3期)。但是由于种种原因，添加剂没有得到推广。目前，庆大霉素的副作用还没有得到根本改善。
生产高质量低毒性的庆大霉素的关键是如何从基本上改善庆大霉素的组份。因为庆大霉素中的不同组份，其药效不同，而且，毒性也不同。如对肠球菌和痢疾杆菌的活性，则是组份C1大于C2。但是C1组份的半数保护剂量(PD50)比其它组份低。所以C1组份的治疗指数高，疗效好，而且毒副作用低。因此，生产高质量的庆大霉素，即提高C1组份的生产工艺也成了庆大霉素工业的重要课题。所以，本发明提供了C1高含量的庆大霉素简易制备方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足之处，而提供一种C1含量高、毒副作用小的新一代庆大霉素、制备方法及其用途。
本发明目的可以通过如下措施来实现新一代庆大霉素组份C1含量51-75％、C1a含量5-20％、C2和C2a总含量15-35％；制备方法在常规的发酵培养基中含谷氨酸或谷氨酸钠或谷氨酰胺，有效浓度分别是0.1-50克/升。按常规方法，pH6.8-7.6，培养温度35-37℃进行发酵88-92小时。
培养基组成是玉米粉5-15克/升，淀粉10-50克/升，酵母粉或黄豆粉25-40克/升，硝酸钾0.01-0.45克/升，碳酸钙2.5-7.5克/升，硫酸铵0.1-3.5克/升，蛋白胨3.5-7.5克/升，氯化钴5-50毫克/升。
本发明中使用的菌种是绛红小单孢菌(Micromonospora purpurea菌株NRRL2953)ATCC15835，该菌保藏在美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection，P.O.Box 1549，Manassas，VA 20110)。
庆大霉素提纯采用常规方法。
庆大霉素组份分析使用高压液相色谱法(HPLC)分析庆大霉素组份(图2)。
在庆大霉素主要的4个组份C1，C1a，C2和C2a中，C1毒副作用最小。国际上使用的传统庆大霉素标准的主要依据是美国早期发明专利对庆大霉素组份的定义[马克子(Marquez)等美国专利3,651,042(1972年)]。传统庆大霉素和新一代庆大霉素组份含量定义及其实测值如表1所示。
表1新一代庆大霉素和传统庆大霉素组份比较 从表1可以看出，本发明对新一代庆大霉素组份含量的定义为51-75％的C1，5-20％的C1a，15-35％的C2和C2a，明显的区别于传统庆大霉素组份含量的定义。尤其是新一代庆大霉素C1含量高于传统庆大霉素含量，传统庆大霉素C1含量为25-50％，而本发明取得的新一代庆大霉素组份C1含量的实测值分别为66.8％，64.6％和57.1％。
本发明相比现有技术具有如下优点本发明采用发酵方法，所制得的庆大霉素C1含量51-75％，比传统的C1含量25-50％高，C1毒副用小，是新一代有高含量优质组份的庆大霉素。
图1庆大霉素分子结构图所示为庆大霉素主要组份的结构区别，其区别在于绛红糖胺的不同程度的甲基化。
图中R1，R2和R3分别表示氢原子或者甲基。
庆大霉素C1R1和R2为甲基；R3为氢原子。
庆大霉素C1aR1，R2和R3皆为氢原子。
庆大霉素C2R1和R3为氢原子；R2为甲基。
庆大霉素C2aR1和R2为氢原子；R3为甲基。
图2本发明庆大霉素组份的HPLC分析结果图中X轴是庆大霉素的流出时间，单位为分钟；Y轴是在254纳米的吸光度，单位为毫吸光单位(mA)。
图3传统工艺庆大霉素组份的HPLC分析结果从图2和图3可以看出，本发明发酵工艺制备的庆大霉素，其C1的含量明显高于传统工艺生产的庆大霉素。
具体实施方法下面列举四个实施例，对本发明加以进一步说明。但本发明不只限于这些实施例。
实施例1庆大霉素C1高产培养方法。含玉米粉11克/升，淀粉25克/升，黄豆粉32克/升，硝酸钾0.01克/升，碳酸钙5克/升，硫酸铵0.25克/升，蛋白胨4.5克/升，氯化钴15毫克/升的绛红小单孢菌常规发酵培养基中，添加谷氨酸2.5克/升，pH7.2，培养温度35℃，发酵时间90小时。
实施例2与实施例1相同的发酵培养基中，含有谷氨酸钠2.5克/升，取代实施例1中谷氨酸，其余均与实施例1相同。
实施例3与实施例1相同的发酵培养基中，含有谷氨酰胺2.5克/升，取代实施例1中的谷氨酸，其余均与实施例1相同。
实施例1-3的实测值，见表1。
实施例4把本发明实施例3的产品含C1 57.1％，与传统生产方法生产的庆大霉素C1含量35.4％，按1∶1重量比混合，即得到C1含量为46.25％的庆大霉素产品。
庆大霉素的纯化。向实施例1-3的培养液中加入硫酸，使pH降为2-3，并保持30-60分钟，之后，加入氢氧化钠，将pH调高到6.0-6.5。加入强阳离子交换树脂(Dowex-50)，充分吸附庆大霉素。经过氯化氨(0.4摩尔)和低浓度氨水(0.1摩尔)冲洗，最后用高浓度氨水(1摩尔)解离。
庆大霉素组份分析。使用高压液相色谱法(HPLC)分析庆大霉素组份。分析方法见乔克(Jork)等《色谱杂志》(Journal of Chromatography)1988年19卷115-9页。
说明一点国际标准庆大霉素C1含量25-50％，实际上生产单位制得的庆大霉素C1含量35％左右，达不到C1含量36-50％范围。而本发明庆大霉素与传统的庆大霉素按重量比例混合，可以制得含C1接近50％的国际标准庆大霉素。
本发明庆大霉素广泛用于医疗及畜牧业，作抗生素。
权利要求
1.新一代庆大霉素，其特征在于庆大霉素组份C1含量51-75％、C1a含量5-20％、C2和C2a总含量15-35％。
2.新一代庆大霉素的制备方法，其特征在于在常规的发酵培养基中，含谷氨酸或谷氨酸钠或谷氨酰胺，有效浓度分别是0.1-50克/升。
3.新一代庆大霉素用于与传统方法生产的庆大霉素按重量比例混合，可以制得含C1接近50％的国际标准的庆大霉素。
全文摘要
本发明涉及一种新一代庆大霉素、制备方法及其用途，它是在含有玉米粉、淀粉、酵母粉或黄豆粉、硝酸钾、碳酸钠、硫酸铵、蛋白胨、氯化钴的绛红小单孢菌的常规培养基中，添加谷氨酸或谷氨酸钠或谷氨酰胺。详细配方和发酵方法详见说明书。本发明优点是庆大霉素C1含量高，C1毒副作用小，是新一代有优质组份的庆大霉素。本发明产品被广泛用于医疗及畜牧业，作抗生素。
文档编号C12P19/00GK1557958SQ200410039138
公开日2004年12月29日 申请日期2004年2月12日 优先权日2004年2月12日
发明者窦德献 申请人:窦德献