专利名称：激光－微波诱变选育富硒紫球藻变株的方法
技术领域：
本发明涉及利用激光和微波诱变手段，结合富硒驯化，筛选富硒紫球藻突变株的方法，属于新藻种的诱变选育技术。
紫球藻属于红藻门、红毛菜藻纲、紫球藻目、紫球藻科、紫球藻属的一种单细胞红藻，分布于海水、淡水、咸水及潮湿的土地中。细胞外包围着一层粘质鞘，粘质鞘由细胞分泌出来的水溶性紫球藻多糖形成。生长过程受温度、光照、pH、盐度、碳源、三十烷醇的影响。在生长过程中，紫球藻能合成藻胆蛋白、多糖、不饱和脂肪酸、矿物质等多种生物活性物质。紫球藻所含的多种富有开发价值的生物活性物质引起人们极大的研究兴趣。Ginzberg等将紫球藻粗粉按鸡食量的一定比例喂养来亨鸡，观察到可降低鸡血清胆固醇水平，鸡蛋蛋黄的胆固醇水平有大幅下降，而亚油酸和花生四烯酸含量上升；Dvir等发现紫球藻影响大鼠胃肠生理功能和脂代谢，使大小肠和结肠的长度增加，血清胆固醇水平下降。
紫球藻生长阶段进入稳定期后，细胞大量产生胞外多糖，并逐渐溶入培养液中，使其变得十分粘稠，在其细胞膜外层也分布并形成粘性鞘膜，在适宜条件下，可达到生物量的50％左右。紫球藻多糖含硫酸基团，由木糖、葡萄糖、半乳糖等单糖组成。Minkova等研究表明紫球藻的胞外多糖能抑制流行性感冒病毒A/Sofia/80/93/H3N2的生长；Huleihel等的研究表明，紫球藻细胞壁硫酸多糖对单疱疹病毒I型(HSV-1)和II型(HSV-2)及水痘—带状疱疹病毒(VZV)具有明显抗性；进一步实验证实该多糖能在离体(细胞培养)和活体(鼠和兔)条件下对HSV-1和HSV-2表现出明显抗性。
紫球藻细胞内有一个大而呈星壮的色素体，内含丰富的藻红蛋白和藻蓝蛋白，其中以B-PE含量最多。藻胆蛋白含量可达到细胞总蛋白量的50％，其中藻红蛋白(包括B-PE)占84％，是B-PE的一个重要来源。在较低光强及适宜温度条件下，藻体可合成占总生物量5％-10％的B-PE。通过对光强、光质、培养条件的调控可获得更高的产量。Bermejo等采用两步法快速制备紫球藻B-藻红蛋白，经过均质的藻胆蛋白通过SDS-PAGE测定出与它的三个亚基相对应的迁移带。Bermejo Roma`n等用简便便宜的方法制备紫球藻的自然态的B-藻红蛋白和R-藻蓝蛋白，藻中含有32％的B-藻红蛋白和12％R-藻蓝蛋白。
国内对紫球藻的开发应用研究报道很少，只有福建师范大学生物工程学院、烟台大学海洋生化工程研究所有相关论文报道，烟台大学的王长海等利用内环流气升式光生物反应器就碳源及供给形式、光强和反应器的操作条件等对紫球藻生长的影响进行研究；他们还采用水提法、碱提法、冻融水提法提取藻体细胞中的多糖。福建师范大学生物工程学院结合自身研究基础，对藻种的选育、规模化培养、藻粉降血脂和降血糖等问题进行了有意义的探索工作。
硒是人和动物所必需的微量元素，具有多种重要的生物学功能，构成若干抗氧化酶的活性中心，可影响机体抗氧化能力和对相关疾病的抵抗能力。为了维持生理活动的正常需要，每天的硒摄入量应为150-200μg。我国目前大体上平均一个人每天只摄入30-70μg硒。硒的摄入不足给人和动物造成多种伤害，影响生物体的正常功能，损害机体免疫力，引起诸如克山病、大骨节病、地方性甲状腺肿等多种疾病，我国有10多个省、310个病区县8295万人受缺硒引起的克山病的威胁。
硒的有机态与无机态相比，具有吸收率高、生物活性强、环境污染小等特点。通过生物进行硒的转化为获取有机硒提供一条简便经济的途径，有利于实际生产中大量应用。有机硒与无机硒相比具有以下特点有机硒的生物利用率明显高于亚硒酸钠；从提高人体血硒水平来看，有机硒比无机硒更有效；有机硒的毒性比无机硒小。目前，硒的有机化有两种手段人工合成和生物转化。人工合成的产品很多，有硒化亚油酸、硒化脂多糖、肌醇硒酸脂等。这些产品由于生产工艺复杂，价格昂贵，难以在实际生产应用。硒的生物有机化主要是通过动物、植物、微生物转化无机硒生产有机硒，如富硒螺旋藻、富硒鸡蛋、富硒大蒜、富硒酵母、富硒牛奶和富硒茶。其中的硒主要是以硒代半胱氨酸、硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸等形式存在。尽管在藻类方面已有富硒的产品，如富硒螺旋藻，但是作为富集体的螺旋藻仅仅是未进行有效的正诱变的普通藻株，对硒的吸收、转化能力弱，藻体硒含量低，无实际开发价值。
目前微藻藻种选育，物理诱变方法中常选用激光、紫外线、60Co-γ射线等照射等，化学诱变剂多选用DES及亚硝基胍等。这些方法诱变剂量小，突变株少，而当致死率99.5％时，虽然突变株较多，但大多数为负突变株，不易获的具有优良性状的突变株。激光照射技术在微生物诱变育种中的应用较为广泛，其作用于微生物细胞产生光、热、压力、电磁场、弱刺激作用等，改变了微生物细胞中DNA和RNA遗传密码的次序，引起变异。而把激光应用在藻种的选育方面的技术，则刚刚起步。
本发明专利的目的就是利用紫球藻的吸收、转化作用强的特点，采用YAG(λ＝1060nm)激光辐照和微波辐射相结合的方式以及单独采用微波进行有效诱变，同时结合硒的富集驯化方法，筛选具有高富硒能力的紫球藻突变株。
本发明通过以下技术方案实现首先利用微波(功率600W，脉冲频率2450MHz)进行20～60s辐射处理，或再利用YAG(λ＝1060nm)激光对紫球藻进行10～80s辐照，经处理的紫球藻置于含有浓度为15～500mg/L亚硒酸钠的培养液中培养，从中分离获得富硒紫球藻突变株。本发明具体包括以下内容1、突变株的获得微波辐射取对数生长期的藻液，用无菌培养液稀释、离心、洗净，将悬浮藻液分装于无菌玻璃培养皿内进行微波诱变，采用的微波炉最大功率600W，脉冲频率2450M Hz，以辐照不同的时间(20～60s)对藻细胞进行诱变处理。
激光辐照经微波辐射后的藻液置于无菌小玻璃管内进行YAG激光(λ＝1060nm)辐照10-80s，照射后移入内装培养液的三角瓶中培养，培养液含有亚硒酸钠，浓度为15～500mg/L。处理液稀释后一部分涂布于含一定浓度亚硒酸钠的平板，从中挑出富硒紫球藻突变株；另一部分移入含有300～550mg/L的亚硒酸钠的培养液中进行富硒驯化，从中也可获得富硒紫球藻突变株。
2、富硒紫球藻突变株的培养在培养液中加入亚硒酸钠，其浓度为15-500mg/L，最佳的添加量为80mg/L。接入富硒紫球藻突变株进行培养，培养周期结束，即可得到硒含量高的富硒紫球藻粉和富硒紫球藻多糖。
本发明的具有的优点激光、微波诱变设备简单、方法易行、操作安全，诱变效果远较传统的理化因子好，在微藻藻种选育中有较大的推广价值。本发明利用紫球藻含有多种生理活性物质的特点，通过利用激光辐照和微波辐射相结合方式或单独利用微波进行诱变，结合富硒驯化，选育出富硒紫球藻突变株。该突变株对无机硒的转化率高，当培养液的硒浓度为80mg/L，藻粉的硒含量由0.35μg/g提高到4500μg/g，目前未见有关富硒紫球藻的相关文献报道。通过动物实验表明，富硒紫球藻及其富硒胞外多糖对实验动物血糖和血脂的调节作用、对肿瘤细胞的调节作用、抗流感病毒等作用明显，分离获得富硒藻胆蛋白具有性质稳定、荧光量子产率高、背景干扰小、易于同生物素、抗体和糖蛋白等大分子交联等特点。
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的说明。
实施例1
1、突变株的获得微波辐射/激光辐照诱变取对数生长期的藻液，用无菌培养液稀释、离心、洗净，将悬浮藻液25mL分装于直径9cm无菌培养皿内进行20s的微波辐照诱变，微波诱变采用的微波炉最大功率600W，脉冲频率2450MHz。照射后分别移入内装120mL培养液的300mL三角瓶中，取上述经微波辐照的藻液3mL于直径2cm无菌小玻璃管内进行YAG激光(λ＝1060nm)辐照10s，移入内装20mL培养液的100mL三角瓶中，培养液含有浓度为50mg/L亚硒酸钠。处理液稀释后涂布于含一定浓度亚硒酸钠的平板。
2、富硒紫球藻突变株的培养在培养液中加入浓度为25mg/L亚硒酸钠，接入富硒紫球藻突变株进行培养，培养周期结束，即可得到富硒紫球藻粉和富硒紫球藻多糖。
实施例21、突变株的获得取对数生长期的藻液，用无菌培养液稀释、离心、洗净，将悬浮藻液15mL分装于直径12cm无菌培养皿内进行微波诱变，微波诱变采用的微波炉最大功率600W，脉冲频率2450MHz，辐照60s进行诱变处理，移入内装120mL培养液的300mL三角瓶中，培养液含有浓度为500mg/L亚硒酸钠。处理液稀释后一部分涂布于含一定浓度亚硒酸钠的平板。另一部分移入含有300mg/L的亚硒酸钠的培养液中进行富硒驯化，从中也可获得富硒紫球藻突变株。
2、富硒紫球藻突变株的培养在培养液中加入浓度为80mg/L亚硒酸钠，接入富硒紫球藻突变株进行培养，培养周期结束，即可得到富硒紫球藻粉和富硒紫球藻多糖。
实施例31、突变株的获得
微波辐射/激光辐照诱变取对数生长期的藻液，用无菌培养液稀释、离心、洗净，将悬浮藻液25mL分装于直径9cm无菌培养皿内进行40s的微波辐照诱变，微波诱变采用的微波炉最大功率600W，脉冲频率2450MHz。照射后分别移入内装120mL培养液的300mL三角瓶中，取上述经微波辐照的藻液3mL于直径2cm无菌小玻璃管内进行YAG激光(λ＝1060nm)辐照80s，取一部分移入内装20mL培养液的100mL三角瓶中，培养液含有浓度为300mg/L亚硒酸钠。处理液稀释后一部分涂布于含一定浓度亚硒酸钠的平板。另一部分移入含有520mg/L的亚硒酸钠的培养液中进行富硒驯化，从中也可获得富硒紫球藻突变株。
2、富硒紫球藻突变株的获得在培养液中加入浓度为120mg/L亚硒酸钠，接入富硒紫球藻突变株进行培养，培养周期结束，即可得到富硒紫球藻粉和富硒紫球藻多糖。
权利要求
1.本发明涉及利用激光诱变手段，筛选紫球藻变株的方法，其特征是首先利用微波进行辐射处理，再利用YAG激光对紫球藻进行辐照，或单独利用微波辐射处理，后置于亚硒酸钠的培养液中进行富硒驯化培养。
2.根据权利要求1所述的诱变选育方法，其特征是辐射处理时使用的微波功率为600W，脉冲频率为2450MHz
3.根据权利要求1所述的诱变选育方法，其特征是微波辐射处理的时间20～60s，最佳辐射时间20s。
4.根据权利要求1所述的诱变选育方法，其特征是辐照处理时使用的YAG激光，其波长为1060nm。
5.根据权利要求1所述的诱变选育方法，其特征是辐照处理的时间10-80s。最佳辐照时间30s。
6.根据权利要求1所述的诱变选育方法，其特征是经辐照处理的藻液移入内装培养液的三角瓶中培养，培养液含有亚硒酸钠，浓度为15-500mg/L。
7.根据权利要求6所述的诱变选育方法，其特征是经培养后涂布于含一定浓度亚硒酸钠的平板。
8.根据权利要求6所述的诱变选育方法，其特征是经培养后移入含有300～550mg/L的亚硒酸钠的培养液中进行富硒驯化。
全文摘要
本发明涉及利用激光和微波诱变结合富硒驯化，筛选富硒紫球藻变株的方法。首先利用微波(功率600W，脉冲频率2450MHz)进行20－60s辐射处理，或再利用YAG(λ＝1060nm)激光对紫球藻进行10－80s辐照；经处理的紫球藻置于浓度为15－500mg/L亚硒酸钠的培养液中培养，获得富硒紫球藻突变株。本发明通过诱变和富硒驯化方法，选育出富硒紫球藻变株，该突变株对无机硒的转化率高，当培养液的硒浓度为80mg/L，藻粉的硒含量为4500μg/g；所采用的激光、微波诱变设备简单、操作安全、诱变效果远较传统的理化因子好，在微藻藻种选育中有较大的推广价值。动物实验表明，富硒紫球藻及其富硒多糖对实验动物血糖、血脂、肿瘤细胞的调节、抗流感病毒等作用明显。
文档编号C12N13/00GK1563375SQ20041003982
公开日2005年1月12日 申请日期2004年3月19日 优先权日2004年3月19日
发明者陈必链, 黄键, 王娟 申请人:福建师范大学