专利名称：一种表达人骨形态发生蛋白的方法及其专用表达载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种表达人骨形态发生蛋白的方法及其专用表达载体。
背景技术：
组织器官工程是利用细胞的培养技术在体外人工控制细胞分化、增殖并生长成需要的组织，用来修复由于意外损伤等引起的功能丧失的体内组织。在细胞增殖，生长和定向分化过程中，需要多种生长因子对其进行调控。人的骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)对骨器官的形成起重要的调节作用。BMP属于TGF-β超家族(Urist，M.R.，Lietze，A.，Mizutani，H.，Takagi，K.，Triffitt，J.T.，Amstutz，J.，DeLange，R.，Termine，J.，Finerman，G.A.，(1982).Abovine low molecular weight bone morphogenetic protein(BMP)fraction.Clin.Orthop.162，219-232)，目前已发现了13种BMP(BMP-1～BMP-13)，诱骨活性最强的是BMP2。BMP2首先由Wozney(Wozney，J.M.，Rosen，V.，Celeste，A.J.，Mitsock，L.M.，Whitters，M.J.，Kriz，R.，Hewick，R.，Wang，E.A.(1988).Novelregulators of bone formationMolecular clones and activities.Science 242.1528-1534)从人的cDNA文库中克隆出来。BMP2的生物活性是诱导骨形成，促进骨损伤的修复，诱导未分化的间充质细胞向成骨、成软骨细胞分化，同时，对胚胎肢芽和心、眼、肾、神经等组织器官的发育亦有重要调节作用。BMP2的独特的生物学活性使其不仅在组织器官工程研究领域中具有不可替代的作用，而且对骨折、骨缺损、骨质疏松、牙周病等多种骨性疾病的治疗具有巨大的应用价值。BMP2通常表达量极低，虽然采用生物化学方法可从各种骨组织中提取天然的BMP2，但产量低和动物蛋白抗原性等的原因使其远远不能满足组织器官工程研究的需要和临床的要求。运用基因工程的方法可获得足够量的人BMP2蛋白。骨形态发生蛋白-2在体内以前体形式合成，经蛋白酶切去除信号肽和前肽，得到由114个氨基酸残基组成的成熟肽，并进行糖基化修饰方可成为成熟的人BMP2。目前人BMP基因在COS、CHO、昆虫等真核细胞和大肠杆菌中得到表达(Hammonds，R.G.Jr.，Schwall，R.，Dudley，A.，Berkemeier，L.，Lai，C.，Lee，J.，Cunningham，N.，Reddi，A.H.，Wood，W.I.，Mason，A.J.(1991)，Bone-inducing activity of mature BMP-2b produced froma hybrid BMP-2a/2b precursor.Mol.Endocrinol.Jan；5(1)，149-155；Ishida，N.，Tsujimoto，M.，Kanaya，T.，Shimamura，A.，Tsuruoka，N.，Kodama，S.，Katayama，T.，Oikawa，S.，Matsui，M.，Nakanishi，T.，et al.(1994)，Expressionand characterization of human bone morphogenetic protein-2 in silkworm larvaeinfected with recombinant Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus.J.Biochem(Tokyo).Feb；115(2)279-85)，但产量低、成本高或活性低等缺点制约了其应用。
虽然，细菌、酵母、昆虫、哺乳动物细胞和转基因动物都可以作为表达系统生产药用蛋白，但植物作为生产药用蛋白的生物反应器具有很多潜在的优势1)能对真核生物蛋白进行准确的翻译后加工和蛋白糖基化，而细菌在发酵过程中常常产生不溶性聚合物，降低了蛋白活性，提高成产成本；2)植物中不含有潜在的人类病原，其生产系统较为安全，细菌本身是人类的病原体，而动物病毒对人类有潜在危害；3)易于扩大生产和储藏运输，降低生产成本；4)通过有效手段可以简化蛋白提取和纯化的环节；5)很多人或动物的基因在原生物体内受到细胞整体调控的影响表达量极低，即使通过基因工程的方法也很难在动物细胞或体内得到高效表达，而这些蛋白的积累又可能伤害动物或动物细胞，用转基因植物作为表达系统有望克服这一缺点。
近年来，随着植物转基因技术的不断发展和成熟，越来越多的疫苗基因、抗体基因、和药用蛋白基因转入到不同的植物中并进行了表达，如HBsAg基因转入烟草中并得到表达(Mason，H.S.，Ball，J.M.，Shi，J.J.，Jiang，X.，Estes，M.K.，and Arntzen，C.J.(1996).Expression of Norwalk virus capsid protein intransgenic tobacco and potato and its oral immunogenicity in mice.Proc.Natl.Assoc.Sci.93，5335-5340)；人的β-干扰素、血红素、血清白蛋白都在烟草中得到表达(Cramer，C.，Boothe，J.G.，Oishi，K.K.(1999).Transgenic plantsfor therapeutic proteinslinking upstream and downstream technologies.Current Topics in Microbiology and Immunology.240，95-118)。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种可在烟草中表达人骨形态发生蛋白的植物表达载体。
本发明所提供的人骨形态发生蛋白植物表达载体，是在花椰菜花叶病毒的35S启动子下游插入有人骨形态发生蛋白的成熟肽编码基因的pBI121质粒。
pBI121质粒可购自CLONTECH公司。
人骨形态发生蛋白的成熟肽具有序列表中序列1的氨基酸残基序列；所述人骨形态发生蛋白的成熟肽编码基因可为具有序列表中序列2的核苷酸序列。
序列表中的序列1由114个氨基酸残基组成，自氨基端(N端)的第1-12位氨基酸残基为肝素结合区(Ruppert，R.，Hoffmann，E.，and Sebald，W.(1996).Humanbone morphogenetic protein 2 contains a heparin-binding site which modifiesits biological activity.Eur.J.biochem.237，295-302)。序列表中的序列2由345个碱基组成，自5′端的第1-36位碱基为肝素结合区的编码序列。
为了提高表达后的BMP2的活性，所述人骨形态发生蛋白的成熟肽的编码基因中缺失人骨形态发生蛋白的成熟肽的N端12个氨基酸的肝素结合区的编码序列，得到具有序列2的自5’端第37到第345位碱基的人骨形态发生蛋白的成熟肽的编码基因。
为了便于人骨形态发生蛋白的纯化，所述人骨形态发生蛋白的成熟肽编码基因的5′端连接有组氨酸标签(His-tag)。
为了便于人骨形态发生蛋白的纯化和转基因植物的筛选，所述人骨形态发生蛋白成熟肽编码基因位于花椰菜花叶病毒的35S启动子和和β-葡萄糖醛酸酶基因之间，和β-葡萄糖醛酸酶基因形成融合基因。
为了便于在纯化过程中将本发明表达的人骨形态发生蛋白和β-葡萄糖醛酸酶融合蛋白中的β-葡萄糖醛酸酶切除，所述人骨形态发生蛋白成熟肽编码基因的3′端连接有肠激酶识别酶切位点。
为了提高表达效率，所述植物表达载体的花椰菜花叶病毒的35S启动子取代为双35S启动子。
所述双35S启动子具有序列表中序列3的核苷酸序列。
为了提高植物体内的mRNA翻译效率，所述启动子的3′端连接有AMV增强序列(植物病毒苜蓿花叶病毒的RNA4前导序列)。
所述AMV增强序列具有序列表中序列4的核苷酸序列。
所述双35S启动子的3′端紧密连接AMV增强序列得到双35S-AMV，它具有序列表中序列5的核苷酸序列。
所述人骨形态发生蛋白的植物表达载体具体可为11ds2(图1b)和pBIb2-11(图1a)；优选为11ds2。。
本发明的第二个目的是提供一种可在烟草中表达人骨形态发生蛋白的方法。
本发明所提供的表达人骨形态发生蛋白的方法，是将上述人骨形态发生蛋白的植物表达载体导入烟草中得到转基因烟草，表达得到人骨形态发生蛋白。
所述人骨形态发生蛋白的植物表达载体可通过农杆菌介导的叶盘转化法导入烟草。
转基因烟草全植株均表达人骨形态发生蛋白，以叶片的表达量最高，收获人骨形态发生蛋白的最佳时机是植株长至20-40cm高(转基因小苗已至生根培养基中大约2-4个月)。所述转基因烟草的培养方法与未转基因烟草的培养方法相同。
本发明利用植物双元表达载体PBI 121构建含有人骨形态发生蛋白的成熟肽编码基因的人骨形态发生蛋白植物表达载体，利用易于繁殖和基因转化的烟草作为转基因的宿主表达人骨形态发生蛋白，该方法可表达人骨形态发生蛋白为全蛋白的0.02％(质量百分含量)。
图1a为植物表达载体pBIb2-11的含有人骨形态发生蛋白的成熟肽编码基因的载体片段的物理图谱图1b为植物表达载体11ds2载体的含有人骨形态发生蛋白的成熟肽编码基因的载体片段的物理图谱图2为11ds2转化抗性植株和pBIb2-11转化抗性植株群体中部分植株的基因组DNA用引物1和引物2 PCR检测的结果图3为11ds2转化抗性植株和pBIb2-11转化抗性植株群体中部分植株的基因组DNA用引物1和引物3 PCR检测的结果图4为11ds2群体和对照群体pBIb2-11群体GUS活性检测结果平均水平比较的柱形5为GUS活性检测较高的植株的RT-PCR检测结果图6为GUS活性检测较高的植株的Western-blot检测结果具体实施方式
以下实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、植物表达载体pBIb2-11和11ds2的构建1、引物设计计算机辅助设计人BMP2正向引物和反向引物，在正向引物中引进6个组氨酸的His-tag、根据Joshi的研究成果(Joshi，C.P.，Zhou，H.，Huang，X.，Chiang，V.L.(1997)，Context sequences of translation initiation codonin plants.Plant.Mol.Biol.Dec；35(6)993-1001)符合Kozak规则的起始密码子及其周围序列和XbaI酶切位点。反向引物中引进肠激酶的蛋白酶酶切位点和BamHI的酶切位点。
hBMP2正向引物(Prb2-2a)5’CGTCTAGATAMCA GCTXbaI KozakCATCATCATCATCATCATAGCTGTAAGAGACAC 3’His-tag
hBMP2反向引物(Prb2-2b)5’GCGGATCCCTTGTCATCGTCATCBamHI 肠激酶的酶切位点GCGACACCCACAACCC双35SAMV正向引物5’ACGCCAAGCTTGCATGCCTGC 3’HindIII双35SAMV反向引物5’ACTCTAGATGGAAGTATTTGAAAGAAAATTAAAAATAAAAAGXbaI2、植物表达载体pBIb2-11的构建提取人的总RNA，反转录为cDNA，以此为模板，在hBMP2正反向引物的引导下进行PCR扩增。其中，反应体系为两个引物各20pmol/L、2mmol/L dNTPs 3μl、Taq酶2U、10×Taq酶 缓冲液(QIAGEN)3μl，总体积为30μl。反应条件为94℃下预变性10min；然后94℃下变性30s，67℃下退火45s，72℃下延伸1min，循环35次；72℃下充分延伸5min。扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，结果得到一条360bp左右的条带。扩增条带经回收后，克隆至pGEM-T载体，进行基因序列分析，结果表明扩增得到的人骨形态发生蛋白成熟肽编码基因为自序列表中SEQ ID NO2的5’端第37到第345位碱基。PCR扩增产物回收后，经XbaI和BamHI双酶切后连接入同样双酶切的pBI121上。将得到的连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞。在含卡那霉素的LB平板培养筛选后，提取质粒以hBMP2正反向引物进行PCR鉴定，结果表明得到360bp左右的条带，将该质粒命名为pBIb2-11(图1b)。对pBIb2-11进行测序，结果表明插入的人骨形态发生蛋白成熟肽编码基因序列(为序列2的自5’端第37到第345位碱基)正确。
3、植物表达载体11ds2的构建以含有花椰菜花叶病毒的双35S启动子和AMV增强子序列的质粒pGPTV(Kohler，R.H.，Zipfel，W.R.，Webb，W.W.，Hanson，M.R.(1997)，The green fluorescentprotein as a marker to visualize plant mitochondria in vivo.PlantJ.Mar；11(3)613-21.)为模板，在双35SAMV正反向引物的引导下进行PCR扩增。其中，反应体系为两个引物各20pmol/L、2mmol/L dNTPs 3μl、Taq酶2U、10×Taq酶缓冲液(QIAGEN)3μl，总体积为30μl。反应条件为94℃下预变性10min；然后94℃下变性30s，67℃下退火45s，72℃下延伸1min，循环35次；72℃下充分延伸5min。扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳，结果得到一条约700bp左右的条带。扩增条带经回收后，克隆至pGEM-T载体，进行基因序列分析，结果表明扩增得到的双35S-AMV具有序列表中SEQ ID NO5的核苷酸序列。PCR扩增产物回收后，经HindIII和XbaI双酶切后连接入同样双酶切的pBIb2-11上。将得到的连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞。在含卡那霉素的LB平板培养筛选后，提取质粒以双35SAMV正反向引物进行PCR鉴定，结果表明得到约700bp左右的条带，将该质粒命名为11ds2(图1b)。对11ds2进行测序，结果表明插入的双35S-AMV序列正确。
实施例2、表达人骨形态发生蛋白1、转基因植株的获得按照文献(王关林，方宏均，植物基因工程的原理与技术 北京科学出版社1998)通过农杆菌LBA4404介导的叶盘转化法用pBIb2-11或11ds2转化烟草NC89，在含500mg/L羧苄青霉素和100mg/L卡那霉素的MS培养基上筛选，结果得到126株在抗性培养基上生根的11ds2转化植株(11ds2群体)，90株pBIb2-11转化植株(pBIb2-11群体)。分别以上述216株的基因组DNA为模板，利用hBMP2正反向引物扩增人骨形态发生蛋白成熟肽编码基因，利用hBMP2正向引物和Prpb-1b扩增人骨形态发生蛋白成熟肽编码基因并融合了GUS N端44bp的融合肽部分，结果表明该216株抗性植株利用hBMP2正反向引物均扩增到367bp的阳性片段(图2)，利用hBMP2正向引物和Prpb-1b均扩增到411bp的阳性片段(图3)。图2和图3显示了部分植株的扩增结果。该结果说明，BMP2和GUS的融合基因已正确地连接在载体上并已经成功地整合到经过抗生素筛选的植株的基因组中。其中，Prpb-1b为GUS基因5’端向上游扩增的反向引物，其序列为5’GTTGGGGTTTCTACAGGAC 3’。
2、转基因植物中GUS活性的检测步骤1中的抗生素筛选出的植株长至20-40cm时进行GUS活性定量检测及组织化学染色，按Jefferson等人的方法进行(Jefferson，R.A.，Kavanagh，T.A.，Bevan，M.W.(1987)，GUS fusionsβ-Glucuronidase as a Sensitive and Versatile GeneFusion Marker in Higher Plants.EMBO.J.63901-3907)。结果如表1和图4所示，表明11ds2群体GUS活性整体水平明显高于pBIb2-11群体GUS活性水平(P＜0.01)，平均高出3.94倍，而11ds2群体GUS活性最高水平比pBIb2-11群体高出5.92倍。图4中，1为11ds2群体GUS表达的平均水平，2为对照组pBIb2-11群体GUS表达的平均水平。
表1. 11ds2群体和对照群体pBIb2-11群体GUS活性检测结果的比较
3、RT-PCR和Western-Blot检测(1)RT-PCR检测用QIAGEN公司的RNeasy Plant Kit按其提供的实验方案对11ds2群体中部分GUS检测活性较高的植株进行RT-PCR检测(所用的引物为hBMP2正反向引物)，结果如图5所示，表明GUS活性检测较高的五个植株基因组中，均扩增到367bp的片段。回收该367bp的片段并测序，结果表明该片段与插入的BMP2基因序列完全一致。该结果说明，在转录水平上BMP2基因能够正确进行转录。图5中，1、3、5、7、9泳道为GUS活性检测较高的五个植株，2、4、6、8泳道为上述五个植株中的四株不加逆转录酶的对照。
(2)Western-Blot检测取11ds2群体中部分GUS检测活性较高的植株的叶片，按常规方法提取植株总蛋白，用阴离子交换柱(Hiprep 16/10 QXLTM，Amersham)，His-tag柱(ChelatingsepharoseTMfast flow，Amersham)和分子筛柱(Hiload 16/60 superdexTM75 prepgrade，Amersham)进行纯化，结果得到纯度为91％的人骨形态发生蛋白，其表达量为全蛋白的0.02％(质量百分含量)。
用BMP2单克隆抗体(购于SIGMA公司)对纯化得到的蛋白进行Western-blot检测，结果如图6所示，表明BMP2蛋白在转基因植株中获得表达。图6中，1-8为11ds2群体中GUS检测活性较高的植株，0为未转基因烟草对照。
序列表<160>5<210>1<211>114<212>PRT<213>人属人(Homo sapiens)<400>1Gln Ala Lys His Lys Gln Arg Lys Arg Leu Lys Ser Ser Cys Lys Arg1 5 10 15His Pro Leu Tyr Val Asp Phe Ser Asp Val Gly Trp Asn Asp Trp Ile20 25 30Val Ala Pro Pro Gly Tyr His Ala Phe Tyr Cys His Gly Glu Cys Pro35 40 45Phe Pro Leu Ala Asp His Leu Asn Ser Thr Asn His Ala Ile Val Gln50 55 60Thr Leu Val Asn Ser Val Asn Ser Lys Ile Pro Lys Ala Cys Cys Val65 70 75 80Pro Thr Glu Leu Ser Ala Ile Ser Met Leu Tyr Leu Asp Glu Asn Glu85 90 95Lys Val Val Leu Lys Asn Tyr Gln Asp Met Val Val Glu Gly Cys Gly100 105 110Cys Arg<210>2<211>345<212>DNA<213>人属人(Homo sapiens)<400>2
caagccaaac acaaacagcg gaaacgcctt aagtccagct gtaagagaca ccctttgtac 60gtggacttca gtgacgtggg gtggaatgac tggattgtgg ctcccccggg gtatcacgcc120ttttactgcc acggagaatg cccttttcct ctggctgatc atctgaactc cactaatcat180gccattgttc agacgttggt caactctgtt aactctaaga ttcctaaggc atgctgtgtc240ccgacagaac tcagtgctat ctcgatgctg taccttgacg agaatgaaaa ggttgtatta300aagaactatc aggacatggt tgtggagggt tgtgggtgtc gctag345<210>3<211>634<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3acgccaagct tgcatgcctg caggtccgat tgagactttt caacaaaggg taatatccgg 60aaacctcctc ggattccatt gcccagctat ctgtcacttt attgtgaaga tagtggaaaa120ggaaggtggc tcctacaaat gccatcattg cgataaagga aaggccatcg ttgaagatgc180ctctgccgac agtggtccca aagatggacc cccacccacg aggagcatcg tggaaaaaga240agacgttcca accacgtctt caaagcaagt ggattgatgt gatggtccga ttgagacttt300tcaacaaagg gtaatatccg gaaacctcct cggattccat tgcccagcta tctgtcactt360tattgtgaag atagtggaaa aggaaggtgg ctcctacaaa tgccatcatt gcgataaagg420aaaggccatc gttgaagatg cctctgccga cagtggtccc aaagatggac ccccacccac480gaggagcatc gtggaaaaag aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag tggattgatg540tgatatctcc actgacgtaa gggatgacgc acaatcccac tatccttcgc aagacccttc600ctctatataa ggaagttcat ttcatttgga gagg634<210>4<211>32<212>DNA<213>人工序列
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<223>
<400>4ttattttt aattttcttt caaatacttc ca 32<210>5<211>672<212>DNA<213>人工序列<220>
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1.人骨形态发生蛋白植物表达载体，是在花椰菜花叶病毒的35S启动子下游插入有人骨形态发生蛋白的成熟肽编码基因的pBI121质粒。
2.根据权利要求1所述的植物表达载体，其特征在于所述人骨形态发生蛋白的成熟肽的编码基因中缺失人骨形态发生蛋白的成熟肽的N端12个氨基酸的肝素结合区的编码序列。
3.根据权利要求2所述的植物表达载体，其特征在于所述人骨形态发生蛋白的成熟肽编码基因的5′端连接有组氨酸标签。
4.根据权利要求2所述的植物表达载体，其特征在于所述人骨形态发生蛋白成熟肽编码基因位于花椰菜花叶病毒的35S启动子和和β-葡萄糖醛酸酶基因之间，和β-葡萄糖醛酸酶基因形成融合基因。
5.根据权利要求2所述的植物表达载体，其特征在于所述人骨形态发生蛋白成熟肽编码基因的3′端连接有肠激酶识别酶切位点。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的植物表达载体，其特征在于所述植物表达载体的花椰菜花叶病毒的35S启动子取代为双35S启动子。
7.根据权利要求6所述的植物表达载体，其特征在于所述启动子的3′端连接有AMV增强序列。
8.根据权利要求7所述的植物表达载体，其特征在于所述人骨形态发生蛋白的植物表达载体为11ds2和pBIb2-11。
9.一种表达人骨形态发生蛋白的方法，是将权利要求1-7中任一项所述的人骨形态发生蛋白的植物表达载体导入烟草中得到转基因烟草，表达得到人骨形态发生蛋白。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述人骨形态发生蛋白的植物表达载体通过农杆菌介导的叶盘转化法导入烟草。
全文摘要
本发明公开了一种表达人骨形态发生蛋白的方法及其专用表达载体。本发明所提供的人骨形态发生蛋白植物表达载体，是在花椰菜花叶病毒的35S启动子下游插入有人骨形态发生蛋白的成熟肽编码基因(并去掉5′端12个氨基酸的肝素结合区)的pBI121质粒。本发明所提供的表达人骨形态发生蛋白的方法，是将上述人骨形态发生蛋白的植物表达载体导入烟草中得到转基因烟草，培育转基因烟草细胞，表达得到人骨形态发生蛋白。该方法可表达人骨形态发生蛋白占全蛋白的0.02％。
文档编号C12N15/82GK1782076SQ20041009649
公开日2006年6月7日 申请日期2004年12月2日 优先权日2004年12月2日
发明者索广力, 陈冰, 薛勇彪, 戴建武 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所