专利名称：一种羟氨苯歧位酶及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物生物技术和基因工程技术领域中一种羟氨苯歧位酶及其编码基因与应用。
背景技术：
邻氨基酚是生产染料、医药、香料的中间体，主要用于制造色酚AS-PH、广泛应用于染料行业，也用于医药工艺和香料行业，如邻位香兰素等。因此，随着印染业、香料业和医学界的发展，市场对合成这些产品的中间体的需求也会不断加大。另外，芳香族化合物在相邻的位置上同时具有氨基和羟基，可以使此类芳香族化合物聚合成高分子化合物，形成一些具有新的物化性质的分子材料。
目前，邻氨基酚和邻羟氨苯类芳香族化合物的生产采用铁粉还原法或液相催化加氢法等工艺，不仅成本高(需要纯氢)，而且容易给环境造成污染(产生大量的带有机毒物的铁泥)。利用酶促反应的生物加工和转化是近年来新兴的生物工程技术，可以在常温常压条件下以非常经济、高效的方法转化加工获得高纯度高品质的产品，目前已经在生物制药领域、生物化工领域得到应用，如手性药物的生产和丙烯酰胺的生产。羟氨苯歧位酶或具有类似的羟氨苯歧位酶催化功能的酶蛋白的发现使邻羟氨苯类芳香族化合物的生物转化成为可能。
发明内容
本发明的目的是提供一种羟氨苯歧位酶及其编码基因。
本发明所提供的羟氨苯歧位酶，来源于睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni)CNB1 CGMCC No.1028菌株，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有羟氨苯歧位酶功能的蛋白质。
其中，序列表中的序列1由150个氨基酸残基组成。
上述羟氨苯歧位酶的编码基因也属于本发明的保护范围。它可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №1蛋白质序列的多核苷酸；
3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
所述高严谨条件可为在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下杂交并洗膜。
其中，序列表中的SEQ ID №2由453个碱基组成，其编码序列为自5’端第1到第453位碱基，编码具有序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列的蛋白质。
含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。
本发明的羟氨苯歧位酶可按如下方法表达将含有上述羟氨苯歧位酶编码基因的重组表达载体导入宿主细胞得到转化子，培养该转化子，表达得到羟氨苯歧位酶。
用于构建含有上述羟氨苯歧位酶编码基因的重组表达载体的出发载体可为基因工程领域中的质粒表达载体、病毒表达载体、酵母表达载体等载体，如pGEX系列载体、pET系列载体、Cosmid载体、pPIC9K。宿主选择与上述表达载体相适应的宿主。所述转化子的培养条件与其出发宿主的培养条件相同，需诱导表达外源基因的转化子，采用相应的诱导物诱导表达本发明的羟氨苯歧位酶。当以细菌为宿主时，可将上述羟氨苯歧位酶编码基因连接到载体SuperCos 1后，以Gigapack III XL包装蛋白包装，或将该基因连接到其他表达载体，然后将包装好的载体或连接载体转化到感受态大肠杆菌或其他细菌，经LB培养基或其他培养基培养，含有连接基因片段的菌落就为转化子，以SuperCos 1为载体的转化子不需要诱导就可以表达酶活性，而以其他的表达载体为载体的转化子则需要载体相应的诱导物诱导表达酶活性。这些转化子可以用于生产本发明的羟氨苯歧位酶或直接用于邻氨基(苯)酚类芳香族化合物及其相关衍生化合物的生产。
本发明的羟氨苯歧位酶在大肠杆菌中的表达量可达800-1000mg/L。其以羟氨苯为底物的比活性可达98U·mg-1·min-1。酶促实验表明，本发明的羟氨苯歧位酶不仅可以羟氨苯为底物，而且能以2-羟氨氯代苯、3-羟氨氯代苯、4-羟氨氯代苯和2，4-二羟氨氯代苯为底物进行羟氨基歧位催化。此酶的底物范围很广，不仅能催化羟氨苯的羟基和氨基的歧化反应，而且能以多种含羟氨基的芳香族化合物为底物，催化形成相应的邻羟基氨基芳香族化合物。
本发明为生物生产邻氨基酚类化合物及其相关衍生化合物提供了一种新的羟氨苯歧位酶，该酶可以催化羟氨苯类化合物进行羟氨基歧位反应，形成邻氨基酚及其相关衍生化合物。本发明的羟氨苯歧位酶及其编码基因将在邻氨基(苯)酚类芳香族化合物及其相关衍生化合物的生产中发挥重要作用。
具体实施例方式
以下实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、本发明的羟氨苯歧位酶基因的获得将睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB1 CGMCC No.1028菌株在LB平板上的单菌落挑到LB培养液中，30℃振荡培养，收集菌体，提取基因组DNA，用Mbo I部分酶切至30kb左右的片断。用SuperCos 1作为载体(购自StratageneCompany，USA)，载体先用Xba I酶切后，去磷酸化，再用BamH I酶切成6.8kb和1.1kb的两个片段。将基因组部分酶切的片段和处理后的载体在16℃用T4DNA连接酶连接。连接好的片段用Gigapack III XL包装蛋白(购自Stratagene Company，USA)包装。转染至大肠杆菌XL 1-blue MR(购自Stratagene Company，USA)中，建立Cosmid基因文库。用2-氨基苯酚作为底物筛选文库，在2-氨基苯酚水溶液中30℃培养两天，溶液为无色的克隆为阳性克隆，从基因文库中筛选到3个阳性克隆。将其中一个克隆的质粒提取出来测序。对测序结果进行ORF分析，在NCBI上进行blastx比对，从序列中分析出编码羟氨苯歧位酶的基因序列，其编码的氨基酸序列与hydroxylaminobenzene mutase[Pseudomonas pseudoalcaligenes JS45](登录号为AAB94123)的序列相似性为41％；与hydroxylaminobenzene mutase[Pseudomonasputida HS12](登录号为AAK26516)的序列相似性为40％。该基因的核苷酸序列和其编码的氨基酸序列分别如序列表中序列2和序列1所示。
实施例2、本发明的羟氨苯歧位酶的表达及其功能鉴定1、本发明的羟氨苯歧位酶的表达提取睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB1 CGMCC No.1028菌株的基因组DNA，以其为模板，在引物15’-GTCCGAATTCAAGGAGACCCCTTCATGCC-3’(带下划线的碱基为EcoR I识别位点，粗体为起始密码子)和引物25’-GTCAAAGCTTTGCGGGAAGTCTGATGGT-3’(带下划线的碱基为Hind III识别位点，粗体为终止密码子)的引导下，PCR扩增本发明的羟氨苯歧位酶基因。其中，50μl PCR反应体系为模板(60ng/μl)0.5μl；dNTP(每种10mM)1μl；引物(各25μM)1μl；10×缓冲液5μl；ddH2O 42.1μl；Taq(5U/μl)0.4μl。其中，10×缓冲液来自于TaKaRa Taq试剂盒(TaKaRa公司，Code No.DR100A)。PCR温度条件为先94℃ 2min；然后94℃ 30sec，58℃ 45sec，72℃ 45sec，共30个循环；再72℃ 5min。将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果表明扩增到一条450bp左右的条带，大小与预测结果一致。回收大小约450bp的片段，克隆至pGEM-T载体，进行基因序列分析，结果表明扩增得到的羟氨苯歧位酶基因具有序列表中SEQID NO2的核苷酸序列。利用限制性内切酶EcoRI和HindIII将该PCR扩增产物克隆入pET-21a(+)(购自Novagen公司，USA)中的相应位点，得到重组质粒，将重组质粒转化到感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，然后在抗性LB培养基(氨苄青霉素100μg/ml)上进行筛选；在引物1和引物2的引导下，用菌落PCR的方法验证筛选到的阳性克隆(转化子)；将转化子置于LB液体培养基中37℃、150rpm振荡培养，至菌密度OD600为0.8左右时，加入1mM的IPTG诱导1.5小时，表达羟氨苯歧位酶。羟氨苯歧位酶通过His·Tag柱子纯化(His·Bind Resin Chromatography，Novagen公司，USA)，具体操作步骤按照产品手册进行，其表达量为1000mg/L。
2、本发明的羟氨苯歧位酶活性的测定(1)硝基苯硝基还原酶的制备提取睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)CNB1 CGMCC No.1028菌株的基因组DNA，以其为模板，在引物35’-GACGTTTCATATGCCGACCAGCCCGTTC-3’(带下划线的碱基为NdeI识别位点，粗体为起始密码子)和引物45’-TGGGATCCTAATTCGTGGACGAAGGTGG-3’(带下划线的碱基为BamHI酶切位点，粗体为终止密码子)的引导下，PCR扩增硝基苯硝基还原酶基因。其中，50μl PCR反应体系为模板(60ng/μl)0.5μl；dNTP(每种10mM)1μl；引物(各25μM)1μl；10×缓冲液5μl；ddH2O 42.1μl；Taq(5U/μl)0.4μl。其中，10×缓冲液来自于TaKaRa Taq试剂盒(TaKaRa公司，Code No.DR100A)。PCR温度条件为先94℃ 2min；然后94℃ 30sec，40℃ 45sec，72℃ 45sec，共30个循环；再72℃ 5min。将PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，结果表明扩增到一条700bp左右的条带，大小与预测结果一致。回收大小约700bp的片段，克隆至pGEM-T载体，进行基因序列分析，结果表明扩增得到的硝基苯硝基还原酶基因具有序列表中SEQ ID NO3的核苷酸序列，编码具有序列表中序列4的氨基酸残基序列的硝基苯硝基还原酶。利用限制性内切酶NdeI和BamHI将该PCR扩增产物克隆入pET-21a(+)(购自Novagen公司，USA)中的相应位点，得到重组质粒，将重组质粒转化到感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，然后在抗性LB培养基(氨苄青霉素100μg/ml)上进行阳性克隆筛选；并通过引物3和引物4的引导下，用菌落PCR的方法对筛选的阳性克隆(转化子)的验证；将转化子置于LB液体培养基中37℃、150rpm振荡培养，至菌密度OD600为0.8左右时，加入1mM的IPTG诱导1.5小时，得到硝基苯硝基还原酶。硝基苯硝基还原酶通过His·Tag柱子纯化(His·Bind Resin Chromatography，Novagen公司，USA)，具体操作步骤按照产品手册进行。
(2)羟氨苯的制备以硝基苯为底物并以NADPH为辅酶，用硝基苯硝基还原酶催化制备，具体方法如下3μmol硝基苯，10μmol NADPH，50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)20mL，含有3～9mg硝基苯硝基还原酶的纯蛋白溶液，用无菌水补充到30mL，室温下反应5～10min，反应体系中则含有较高浓度的羟氨苯(0.7～1.0mg/L)。
(3)本发明的羟氨苯歧位酶活性的测定以羟氨苯为例，阐明酶活性的测定方法。羟氨苯在羟氨苯歧位酶的催化作用下形成的产物为邻氨基酚，其在235nm处有最大吸收峰，紫外分光光度计测定单位时间内235nm处的光吸收值的增加量，可测得羟氨苯歧位酶的比活。反应体系包括0.3μmol羟氨苯，50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)1mL，含有0.3～0.9mg羟氨苯歧位酶的纯蛋白溶液，酶促反应总体积为3mL，室温下反应5min。1个单位的酶活力定义为每分钟生成1μmol邻氨基酚所需的酶量。结果表明该羟氨苯歧位酶比活性为98U·mg-1·min-1。
3、羟氨苯歧位酶的功能鉴定以步骤1得到的羟氨苯歧位酶做酶催化反应实验，分别以羟氨苯、2-羟氨氯代苯、3-羟氨氯代苯、4-羟氨氯代苯和2，4-二羟氨氯代苯作为此酶的底物，在235nm检测其产物的生成。反应条件如下0.3μmol底物(如羟氨苯)，50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)1mL，含有0.3～0.9mg羟氨苯歧位酶的纯蛋白溶液，酶促反应总体积为3mL，室温下反应5min，于235nm处检验光吸收值的变化速率。结果如表1所示，表明此酶对这五种含羟氨基的芳香族化合物都具有羟氨基歧位催化活性。
表1本发明羟氨苯歧位酶的底物范围
*底物的制备同上述羟氨苯的制备，将硝基苯分别替换为邻氯代硝基苯、间氯代硝基苯、对氯代硝基苯和2，4-二硝基氯代苯。
4、羟氨苯歧位酶催化产物的鉴定酶促反应总体积为3mL，含有0.3μmol羟氨苯，50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH8.0)1mL，含有0.5mg羟氨苯歧位酶的纯蛋白溶液，室温下反应5min后，加入等体积的乙酸乙酯，振荡萃取10min，5000rpm离心，取上层有机相，用氮气小心将乙酸乙酯吹干，将残留物用水溶解(产物I)，进行下一步分析。以产物I为2-氨基酚1，6-双加氧酶(2-氨基酚1，6-双加氧酶按照申请号为200310118812.8，名称为“2-氨基酚1，6-双加氧酶、其基因及用途”的发明专利申请中描述的方法制备)的作用底物进行酶促反应，得到的产物的紫外光吸收图谱与以邻氨基酚的标准品为2-氨基酚1，6-双加氧酶的作用底物而得到的产物的紫外光吸收图谱一致。将产物I进行HPLC分析，分析条件如下HP1050型液相色谱仪；C-18反相柱(4.6mm，250mm，Agilent，USA)；流动相为甲醇∶水＝60∶40(v/v)；流动相流速为1ml/min；检测波长为210nm和280nm。分析结果表明，产物I和邻氨基酚的标准品的截留时间均为2.766min。由以上两个试验可证明产物I即为邻氨基酚。
序列表<160>4<210>1<211>150<212>PRT<213>睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)<400>1Met Pro Ala Gln Pro Asn Val Ala Tyr Phe Thr His Arg Leu Leu Gln1 5 10 15Ala Gly Phe Val Leu Phe Leu Leu Gly Leu Leu Thr Gly Ile Val Ile20 25 30Pro Ala Ala Gln Leu Pro Arg Met Ala Leu Ser Ser His Leu Gln Gly35 40 45Val Met Asn Gly Ser Phe Leu Ile Ala Leu Gly Leu Cys Trp Lys His50 55 60Leu Val Leu Pro Ser Trp Ala Glu Arg Met Ala Phe Leu Ser Ala Ile65 70 75 80Thr Gly Thr Tyr Ala Asn Trp Ala Ala Thr Leu Leu Ser Ala Phe Thr85 90 95Gly Ala Ala Pro Met Met Pro Ile Ala Gly Gly Gly Ser Val Gly Thr100 105 110Pro Phe His Glu Met Leu Val Ser Gly Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu115 120 125Ala Met Ile Leu Thr Cys Val Leu Val Leu Trp Gly Leu His Arg Arg130 135 140Ser Gly Val Pro Ala Pro145 150<210>2<211>453<212>DNA<213>睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)
<400>2atgcctgccc agccgaatgt cgcttatttc acccatcgcc ttctacaggc agggttcgtg 60cttttccttc ttgggctcct gacgggtatt gtcattccag ccgcccaact tccgcgcatg120gcactgtcca gccatctcca gggcgtcatg aatggctcct tcctcatcgc tctcggactt180tgctggaagc atctcgttct tccgtcctgg gccgagagga tggcgttcct ttcggccatt240acggggacat atgcgaactg ggcggcgacg ctgctttcag ctttcaccgg tgctgccccg300atgatgccca ttgccggtgg cggaagcgtt ggtactccct ttcacgaaat gctggtgtcc360ggcctcctgc tcttcctgat cctggccatg atcctcacct gcgtgcttgt gctgtggggg420cttcaccgtc ggtcgggtgt cccagcacca tga 453<210>3<211>684<212>DNA<213>睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)<400>3atgccgacca gcccgttcat tgatgatctg atacgcgacc gtcgcacgaa gcgtggtttt 60ctggatcagc cagtgccgat agaaatggtg aaggacatcc tttcagtggc aaagtatacg120cctagttcga gtaacaccca gccgtggcgc tgttatgttt taaccggtga ggcgcgcgag180cgcgttacta cggccgcggt ggaggcgtac cgcggagcac ccgaaggcct gaagccggag240tattcatact ttcctgaacc actgcatgaa ccctatgcga cccgtttcaa ttcgtttcgc300ggacaactgg gcgacgctga aggatgctgc cgaagtgata taaccgggcg gcgtcgatac360gtcgagcgcc agttccgttt tttcgacgcg ccggtaggcc tcattttcac gatggatcgc420cgtctggaat gggccagttt catttgctat ggctgctttc tccagaacat catgctggca480gccaagggtc gtggtctcga tacttgccct caaggactat ggtccctgca gcacccggtg540ctgcgcactg aactcaacct tcctgatgat caaatggtgg tagcggggat gtcgctgggc600tgggccgaca atagcatggc agtgaaccag atgagtatgt ccagggtgga actggaagag660ttcaccacct tcgtccacga atga 684
<210>4<211>227<212>PRT<213>睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)<400>4Met Pro Thr Ser Pro Phe Ile Asp Asp Leu Ile Arg Asp Arg Arg Thr1 5 10 15Lys Arg Gly Phe Leu Asp Gln Pro Val Pro Ile Glu Met Val Lys Asp20 25 30Ile Leu Ser Val Ala Lys Tyr Thr Pro Ser Ser Ser Asn Thr Gln Pro35 40 45Trp Arg Cys Tyr Val Leu Thr Gly Glu Ala Arg Glu Arg Val Thr Thr50 55 60Ala Ala Val Glu Ala Tyr Arg Gly Ala Pro Glu Gly Leu Lys Pro Glu65 70 75 80Tyr Ser Tyr Phe Pro Glu Pro Leu His Glu Pro Tyr Ala Thr Arg Phe85 90 95Asn Ser Phe Arg Gly Gln Leu Gly Asp Ala Glu Gly Cys Cys Arg Ser100 105 110Asp Ile Thr Gly Arg Arg Arg Tyr Val Glu Arg Gln Phe Arg Phe Phe115 120 125Asp Ala Pro Val Gly Leu Ile Phe Thr Met Asp Arg Arg Leu Glu Trp130 135 140Ala Ser Phe Ile Cys Tyr Gly Cys Phe Leu Gln Asn Ile Met Leu Ala145 150 155 160Ala Lys Gly Arg Gly Leu Asp Thr Cys Pro Gln Gly Leu Trp Ser Leu165 170 175Gln His Pro Val Leu Arg Thr Glu Leu Asn Leu Pro Asp Asp Gln Met180 185 190Val Val Ala Gly Met Ser Leu Gly Trp Ala Asp Asn Ser Met Ala Val195 200 205Asn Gln Met Ser Met Ser Arg Val Glu Leu Glu Glu Phe Thr Thr Phe210 215 220Val His Glu22权利要求
1.羟氨苯歧位酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有羟氨苯歧位酶功能的蛋白质。
2.权利要求1所述的羟氨苯歧位酶的编码基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述羟氨苯歧位酶编码基因具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №2的DNA序列；2)编码序列表中SEQ ID №1蛋白质序列的多核苷酸；3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。
4.含有权利要求2或3所述的羟氨苯歧位酶编码基因的表达载体。
5.含有权利要求2或3所述的羟氨苯歧位酶编码基因的细胞系。
6.含有权利要求2或3所述的羟氨苯歧位酶编码基因的宿主菌。
7.权利要求1所述的羟氨苯歧位酶在邻氨基酚类芳香族化合物及其相关衍生化合物生产中的应用。
8.权利要求2或3所述的羟氨苯歧位酶编码基因在邻氨基酚类芳香族化合物及其相关衍生化合物生产中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种羟氨苯歧位酶及其编码基因与应用。本发明的羟氨苯歧位酶，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质1)序列表中的SEQ ID №1；2)将序列表中SEQ ID №1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有羟氨苯歧位酶功能的蛋白质。本发明的羟氨苯歧位酶及其编码基因将在邻氨基酚类芳香族化合物及其相关衍生化合物的生产中发挥重要作用。
文档编号C12P7/02GK1796547SQ20041010283
公开日2006年7月5日 申请日期2004年12月28日 优先权日2004年12月28日
发明者刘双江, 吴建峰, 刘志培 申请人:中国科学院微生物研究所