专利名称：Par1多态性对于心血管疾病的危险性评估的分析和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及多核苷酸序列，其包含PAR1基因在3090位和/或3329位上的遗传性变异。
蛋白酶激活受体1(PAR1)是属于G蛋白偶联受体(GCPR)一类的凝血酶受体。PAR1的基因定位于染色体5q13，由两个外显子组成并覆盖大约27kb的区域。PAR1表达于内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞、神经元和人血小板等等。在血小板中，PAR1是涉及血小板聚集起始的重要的信号转导受体。
PARs经所述PARs N末端部分的蛋白水解切除而激活，由此随后暴露新的N末端序列，其激活所述受体。
PAR1和PAR4在血小板激活中充当中心角色；血小板中这些受体的激活导致形态改变、ADP的释放和所述血小板的聚集。
在一组韩国患者中，冠心病与PAR1启动子区域中单核苷酸多态性(SNP)的联系还未确定。在另一研究中，显示了PAR1启动子变体对静脉血栓栓塞的发展具有保护作用。
人PAR1基因的序列是已知的。可以在NCBI核苷酸数据库以编号NM-001992得到该基因的多核苷酸序列。同样，可以在NCBI蛋白质数据库中以编号NP-001983获得蛋白质序列。NCBI是国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(通讯地址NationalCenter for Biotechnology Information，National Library of Medicine，Building 38A，Bethesda，MD 20894，USA；网址www.ncbi.nhm.nih.gov)。PAR1基因的克隆已描述，尤其在“Schmidt等人，J.Biol.Chem.271，9307-9312，1996.”中。
有PAR1基因的多种新的多态性，通过所述多态性可能确定个体对于冠心病相对强的倾向。染病的个体因此能够通过相应地调整他们的生活方式及时消除此危险因素，例如通过对其它破坏性影响例如吸烟、酒精消费、高胆固醇食物、高血压等等的增强控制来弥补以消除所述危险因素。
没有对PAR1多态性及其在相应方法中用途的认识，此类健康相关的预防机制将是不可能的，所述PAR1多态性在下面有更详细的解释。
在单独的位置含有替换的特定核苷酸序列的变体为技术人员以术语SNP(＝单核苷酸多态性)公知。
本发明涉及PAR1基因的分离的多核苷酸序列，其包含根据NM-001992的PAR1序列在3090位上的C代替T的替换，所述根据NM-001992的PAR1序列作为现有技术是可公开得到的。在优选的实施方案中，在3090位上具有T到C的替换的PAR1基因的多核苷酸序列包含根据SEQ ID NO2的序列并且，在所述多核苷酸序列的特别优选的实施方案中，所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO2的序列。
本发明还涉及PAR1基因的分离的多核苷酸序列，其包含根据NM-001992的PAR1序列在3329位上的C代替A的替换，所述根据NM-001992的PAR1序列作为现有技术是可公开得到的。在优选的实施方案中，在3090位上具有A到C的替换的PAR1基因的多核苷酸序列包含根据SEQ ID NO3的序列并且，在所述多核苷酸序列的特别优选的实施方案中，所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO3的序列。
本发明还涉及PAR1基因的分离的多核苷酸序列，其包含根据NM-001992的PAR1序列在3090位上的C代替T的替换并且，同时，在所述PAR1序列的3329位上C代替A的替换。在优选的实施方案中，具有在3090位上T到C的替换和同时在3329位上A到C的替换的PAR1基因的多核苷酸序列包含根据SEQ ID NO4的序列并且，在所述多核苷酸序列的特别优选的实施方案中，所述多核苷酸序列包含SEQ ID NO4的序列。
本发明还涉及PAR1基因的分离的部分多核苷酸序列，其包含根据SEQ ID NO5的序列。
本发明还涉及PAR1基因的分离的部分多核苷酸序列，所述序列包含基于根据NM-001992的PAR1序列在3090位上C代替T的替换，该部分包含根据SEQ ID NO6的序列。
本发明还涉及PAR1基因的分离的部分多核苷酸序列，所述序列包含基于根据NM-001992的PAR1序列在3329位上C代替A的替换，该部分包含根据SEQ ID NO7的序列。
本发明还涉及PAR1基因的分离的部分多核苷酸序列，所述序列包含基于根据NM-001992的PAR1序列在3090位上C代替T的替换，并且同时在所述PAR1序列的3329位上C代替A的替换，该部分包含根据SEQID NO8的序列。
本发明进一步包含PAR1 cDNA基因的3592个碱基对的多核苷酸序列的制备，该序列可以包含或不包含单独地或组合地如上定义的在3090和3329位上的多态性，所述制备包括下列方法步骤a]提供包含根据SEQ ID NO2的PAR1序列和/或根据SEQ ID NO3的PAR1序列和/或根据SEQ ID NO4的PAR1序列的人DNA，b]提供具有根据SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的序列的引物对，c]通过聚合酶链延伸反应(PCR)扩增PAR1多核苷酸序列，d]分离和/或纯化从c]所获得的3.56kb的片段，e]将来自d]的片段测序。
本发明还涉及根据SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7或SEQ ID NO8的多核苷酸序列的制备，该制备包括下列方法步骤a]提供包含根据SEQ ID NO1的PAR1序列和/或根据SEQ ID NO2的PAR1序列和/或根据SEQ ID NO3的PAR1序列和/或根据SEQ IDNO4的PAR1序列的人基因组DNA，b]提供根据SEQ ID NO11和SEQ ID NO12的引物对，c]通过聚合酶链延伸反应(PCR)扩增PAR1多核苷酸序列的片段，d]分离和/或纯化从c]所获得的片段，
e]将来自d]的片段测序。
本发明还涉及用于检测在PAR1基因中是否具有在根据NM-001992的序列的3090位上T到C的替换和/或在根据NM-001992的序列的3329位上A到C的替换的方法，该方法包括下列方法步骤a]提供包含人的细胞的生物材料，b]从a]的材料获得染色体DNA，c]利用PCR反应，借助于根据SEQ ID NO11和SEQ ID NO12的引物扩增多核苷酸片段，d]将来自c]的多核苷酸片段测序。
本发明还涉及用于检测在PAR1基因中是否具有在根据NM-001992的序列的3090上T到C的替换和/或在根据NM-001992的序列的3329位上A到C的替换的方法，该方法包括下列方法步骤a]提供包含人的细胞的生物材料，b]从a]的材料中获得RNA，c]借助于逆转录酶将所述RNA转录成cDNA，d]利用所述PCR反应，借助根据SEQ ID NO10和SEQ ID NO11的引物，可能扩增多核苷酸片段，e]将来自c]的cDNA和/或来自d]的多核苷酸片段测序。
本发明还涉及用于检测在PAR1基因中是否具有在根据NM-001992的序列的3090位上T到C的替换和/或根据NM-001992的序列的3329位上A到C的替换的方法，该方法包括下列方法步骤a]提供包含人的细胞的生物材料，b]从a]的材料获得染色体DNA，c]将来自b]的染色体DNA进行DNA印迹，d]提供根据SEQ ID NO5和/或SEQ ID NO6和/或SEQ ID NO7和/或SEQ ID NO8的探针，e]将来自c]的DNA印迹与来自d]的探针在严格杂交条件下杂交，f]通过比较来自e]的杂交结果，确定PAR1基因中在根据NM-001992的3090和/或3329位上的遗传性变异的存在或缺乏。
本发明还涉及用于检测PAR1基因中是否具有在根据NM-001992的序列3090位上T到C的替换和/或根据NM-001992的序列的3329位上A到C的替换的方法，该方法包括下列方法步骤a]提供包含人的细胞的生物材料，b]从a]的材料中获得RNA，c]将来自b]的RNA进行RNA印迹，d]提供根据SEQ ID NO5和/或SEQ ID NO6和/或SEQ ID NO7和/或SEQ ID NO8的探针，e]将来自c]的RNA印迹与来自d]的探针在严格杂交条件下杂交，f]通过比较杂交结果，确定PAR1基因中在根据NM-001992的3090和/或3329位上的遗传性变异的存在或缺乏。
PAR1基因中在3090和/或3329位上的遗传性变异或多态性的检测可用作(a)用于评价心房纤维性颤动、急性冠状动脉综合症、心肌病和/或不稳定心绞痛的危险性的遗传标记，用作(b)用于相应遗传变体的携带者的心房纤维性颤动、急性冠状动脉综合症、心肌病和/或稳定心绞痛的预防性治疗的标记，用作(c)用于调整对心房纤维性颤动、急性冠状动脉综合症、心肌病和/或不稳定心绞痛所给药的药物活性物质剂量的标记，用作(d)用于确定高通量筛选策略的标记，所述策略用于鉴定针对心房纤维性颤动、急性冠状动脉综合症、心肌病和/或不稳定心绞痛的药物活性物质，用作(e)为了测试用于心房纤维性颤动、急性冠状动脉综合症、心肌病和/或不稳定心绞痛的药物物质的耐受性、安全性和功效，用作为临床研究确定相关个体或患者的标记，以及用作(f)开发用于在DNA、RNA或蛋白质水平分析PAR1基因中遗传性变异的试验系统的基础。
本发明还涉及具有21至50个核苷酸的分离的核苷酸序列，其包含根据SEQ ID NO11的序列。所述序列优选地包含SEQ ID NO11。本发明还涉及具有20至50个核苷酸的分离的多核苷酸序列，其包含根据SEQ IDNO12的序列。所述序列优选地包含SEQ ID NO12。
本发明还涉及具有21至50个核苷酸的分离的核苷酸序列的用途，所述序列包括或包含根据SEQ ID NO11的序列联合具有20至50个核苷酸的分离的多核苷酸序列，其包括或包含根据SEQ ID NO12的序列，所述序列用于通过于聚合酶链延伸反应(PCR)扩增PAR1基因的相应片段。此用途优选地涉及PAR1基因片段的扩增，所述基因片段在根据NM-001992的序列的3090位上具有T到C的替换和/或在根据NM-001992的序列的3329位上具有A到C的替换。
而且，本发明包含试剂盒，其包含a]长度为21至50个核苷酸的分离的多核苷酸序列，其包括或包含根据SEQ ID NO11的序列，b]长度为20至50个核苷酸的分离的多核苷酸序列，其包括或包含根据SEQ ID NO12的序列，c]至少一种用于进行聚合酶链延伸反应(PCR)的酶，d]任选用于进行聚合酶链延伸反应的物质和/或溶液，e]任选的多核苷酸序列，其包含在根据NM-001992的PAR1序列的3090位上和/或根据NM-001992的3329位上具有或没有替换的PAR1基因的全长和/或其部分，f]任选用于进行测序反应的试剂。
此处及下面的试剂盒指所述成分的组合，已将所述成分彼此空间并列地组合进一个功能单元。
本发明还涉及上述试剂盒的制备，其包含a]提供长度为20至50个多核苷酸的分离的多核苷酸序列，其包括或包含根据SEQ ID NO11的序列，
b]提供长度为20至50个核苷酸的分离的多核苷酸序列，其包括或包含根据SEQ ID NO12的序列，c]提供用于进行聚合酶链延伸反应(PCR)的酶，d]适宜时，提供用于进行测序的试剂，e]任选提供用于进行所述聚合酶链延伸反应(PCR)的物质和/或溶液，f]任选提供多核苷酸序列，其包含在根据NM-001992的PAR1序列的3090位上具有或没有T到C的替换和/或根据NM-001992的3329位上具有或没有A到C的替换的PAR1基因，在每种情况下所述序列是全长的和/或其部分，g]将来自a]至f]的组分在每种情况下分别引入合适的容器，h]适宜时，将来自g]的容器组成一个或多个包装单元。
上述试剂盒可用于扩增PAR1基因的片段。
在下列的实施方案中对本发明的技术方面做了更详细的讨论。
PAR1基因的分离的多核苷酸序列可例如，通过借助于聚合酶链延伸反应(PCR)扩增来制备。用于此目的的合适的引物在SEQ ID NO9和SEQ ID NO10中描述。
PCR是可用来选择性地复制多核苷酸片段的体外技术，所述多核苷酸片段侧翼为两个已知序列。扩增需要与限定的DNA或RNA模板序列的末端互补的短的单链DNA分子(引物)。DNA聚合酶在正确的反应条件和脱氧核苷三磷酸(dNTPs)存在下沿着单链且变性的多核苷酸模板延伸引物，并因而合成序列与所述模板互补的新的DNA链。在此过程中，温度以有规律的间隔变化，因此一次又一次地，多核苷酸链受到变性且引物可以附着并延伸。使用热稳定的DNA聚合酶，例如Taq聚合酶。常用的PCR反应混合物除多核苷酸模板外，还包含两种合适的引物核苷酸，例如0.2到2μM浓度的引物核苷酸，此外还包含dNTPs，例如每种dNTP 200μM的浓度，此外还含有浓度为1-2mM的MgCl2，以及1-10个单位的热稳定的DNA聚合酶，例如，Taq聚合酶(水生栖热菌(Thermus aquaticus)聚合酶)。热稳定的DNA聚合酶和用于进行同样工作的成分以及方案由众多公司在商业上提供例如，所述公司为例如，Roche Diagnostics、Clontech、Life Technologies、New England Biolabs、Promega、Stratagene等等。
所用于扩增多核苷酸序列的分离的多核苷酸模板可以以RNA或DNA的形式存在。如果多核苷酸模板是RNA，然后在实际的PCR反应前借助于逆转录酶将RNA转录成DNA。用于进行PCR反应的多核苷酸模板量可为例如0.01至20ng。
多核苷酸模板是利用技术人员公知的用于从生物材料获得DNA和/或RNA的技术而获得。此处生物材料应包括脊椎动物(包括人类)的组织或器官的细胞(例如，脑、血液、肝脏、脾脏、肾脏、心脏、血管)，或者来自真核细胞培养物的细胞(例如，Hela细胞、CHO细胞、3T3细胞)或者包括细菌或酵母的细胞，在所述细胞中所要分离的DNA序列以克隆的形式存在。
包括人类的脊椎动物的组织集聚或器官的细胞可通过取血、组织穿刺或外科技术获得。多核苷酸模板可从细胞获得，例如，通过破裂细胞，可能浓缩个别细胞器，尤其是细胞核，并通过沉淀和离心回收DNA或RNA获得多核苷酸模板。
用于制备PAR1基因的分离的多核苷酸序列的另一方法包含克隆PAR1基因，随后在细菌或酵母菌中表达它，并纯化所表达的多核苷酸。前面所提到的PCR反应，例如，适合于制备可克隆的多核苷酸片段。对于所要克隆的片段，利用带有互补序列5’的反应酶识别序列的引物是有利的。在每种情况下两种引物可使用相同或不同的限制酶识别序列。
通常的限制酶实例是BamHI(GGATCC)、Clal(ATCGAT)、EcoRI(GAATTC)、EcoRV(GATATC)、HindIII(AAGCTT)、NcoI(CCATGG)、SaII(GTCGAC)、XbaI(TCTAG1)。
为了克隆，用与引物所附着的识别序列相应的限制酶处理载体。通过分离和用同样的限制酶处理，借助于连接酶将片段连接到载体上。载体意指DNA分子例如，质粒，噬菌体或粘粒，借助于它们可能克隆基因或其它DNA序列并将它们引入细菌或真核细胞进行复制。载体的实例有DNA分子例如pBR322、pUC18/19、pBluescript、pcDNA3.1。载体可从经营生物技术材料的专门公司通过商业途径获得，所述公司为例如RocheDiagnostics、New England Biolabs、Promega、Stratagene等等。
进行PCR反应、提供多核苷酸或进行克隆程序所需的说明书可由技术人员在标准手册中以方法或方案的形式找到，所述手册为例如，a]由Frederidk M.Ausubel(编者)、Roger Brent(编辑)、Robert E.Kingston(编者)、David D.Moore(编辑)、J.G.Seidman(编者)、Kevin Struhl(编者)编辑的“Current Protocols in Molecular biology，活页版，连续更新的，John Wiley&Sons，有限公司，纽约”中或者b]由Frederick M.Ausubel(编者)、Roger Brent(编者)、Robert E.Kingston(编者)、David D.Moore(编者)、J.G.Seidman(编者)、John A.Smith(编辑)、Kevin Struhl(编者)编辑的“Short protocols in Molecular Biology，第五版，2002年10月，John Wiley&Sons，有限公司，纽约”中或者在c]“由J.Sambrock、E.F.Fritsch、T.Maniatis编辑的Molecular Cloning，冷泉港实验室出版社”。
例如，通过化学合成提供合适的引物序列，，所述化学合成可商业上由公司例如MWG Biotech等等定制来完成。
来自不同组织的人cDNA可从公司例如，Promega、Stratagene或其他公司通过商业途径获得。
多核苷酸测序借助于技术人员公知的常规方法，通过利用，例如，来自公司例如，Life Technologies、Applied Biosystems、BioRad或其他公司的实验室机器人来完成。
PAR1变体及其片段的分离的多核苷酸序列也可用于在不同的严格性下杂交。严格性描述了影响两条单链核苷酸分子杂交或附着的特异性的反应条件。反应的严格性以及因而还有特异性可通过提高温度和降低离子强度来提高。例如，如果杂交是在室温下2×SSC溶液中进行的，那么存在低严格性条件。例如，如果杂交是在68℃下0.1×SSC/0.1％SDS溶液中进行的，那么存在高严格性条件。
根据本申请的严格杂交条件下的杂交指1]将标记探针与所要研究的样品在65℃下(或者，在寡核苷酸情况下，低于解链温度5℃)在50mM Tris pH7.5、1NaCl、1％SDS、10％硫酸葡聚糖、0.5mg/ml变性的鲑精DNA中杂交过夜。
2]室温下2×SSC中洗涤10分钟。
3]65℃下(或者，在寡核苷酸情况下，低于解链温度5℃)1×SSC/0.1％SDS中洗涤30分钟。
4]65℃下(或者，在寡核苷酸情况下，低于解链温度5℃)0.2×SSC/0.1％SDS中洗涤30分钟。
5]65℃下(或者，在寡核苷酸情况下，低于解链温度5℃)0.1×SSC/0.1％SDS中洗涤30分钟。
全长为20个核苷酸的DNA片段被认为是用于此目的寡核苷酸。解链温度来自公式Tm＝2(A+T的数目)+4(G+C的数目)℃。
2×SSC或0.1×SSC溶液可通过相应地稀释20×SSC溶液制备。20×SSC溶液包含3M NaCl/0.3柠檬酸钠2H2O溶液。SDS是十二烷基硫酸钠。
电泳分级分离和随后的变性后，通过将所要研究的多核苷酸转移至尼龙或硝酸纤维素膜上来进行杂交(DNA印迹——DNA；RNA印迹——RNA)。利用探针进行杂交，所述探针为放射性同位素标记的或已以另一种方式标记的，例如借助于荧光染料标记。探针包含通常地单链的和/或变性的DNA或RNA多核苷酸序列，其结合至再次单链化和/或变性的所要研究的DNA或RNA多核苷酸序列的互补核苷酸序列。
PAR1基因的单核苷酸多态性可借助于本发明的引物，也可通过SSCP分析来检测。SSCP代表单链构象多态性(Single Stranded ConformationPolymorphism)，其为用于鉴定单个碱基对替换的电泳技术。所要研究的多核苷酸通过PCR借助于标记的引物来扩增，并且在变性成为单链后，在聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)中分离分级。如果所要研究的片段显示单个碱基对替换，它们于是拥有不同的构象因而在PAGE中以不同的速率迁移。
用于进行PCR的物质的实例是缓冲液例如Hepes或Tris，另外dATP、dGTP、dTTP、dCTP和Mg2+以及可能的其他二价或单价离子。溶液包含溶解形式的这些物质。
实施例PAR1基因的基因组区域的扩增PAR1序列中3090位上T到C的替换和3329位上A到C的替换利用下列引物检测引物15’-ACAGAGTGGAATAAGACAGAG-3’(SEQ ID NO11)引物25’-CCAGTGCTAGCTTCTACTTAC-3’(SEQ ID NO12)引物1(SEQ ID NO11)对应于NM-001992参考序列的2767至2789位。引物2衍生自PAR1基因的1号外显子。
用于扩增的PCR方案所用试剂来自Applied Biosystems(Foster city，美国)20ng的基因组DNA；1单位的TaqGold DNA聚合酶；1×Taq聚合酶缓冲液；500μM的dNTPs；2.5mM MgCl2；200nM的每种扩增引物对；加水至5μl。
用于基因分型(genotyping)的PCR扩增程序95℃10分钟 ×1个循环95℃30秒70℃30秒 ×2个循环95℃30秒65℃30秒 ×2个循环
95℃30秒60℃30秒 ×2个循环95℃30秒56℃30秒72℃30秒 ×40个循环72℃10分钟4℃30秒 ×1个循环SNPs的鉴定用于SNPs的微测序(minisequencing)和检测的方案。
所有试剂来自Applied Biosystems(Foster city，美国)。2μl纯化的PCR产物，1.5μl BigDye Terminator Kit，200nM测序引物，加水至10μl。
用于测序的扩增程序96℃2分钟 ×1个循环96℃10秒55℃10秒65℃4分钟 ×30个循环72℃7分钟4℃30秒 ×1个循环测序产物的分析首先利用序列分析软件(Applied Biosystems，Foster City，美国)分析序列以获得原始数据，然后利用Phred、Phrap、Polyphred和Consed进行处理。Phred、Phrap、Polyphred和Consed是由华盛顿大学(Washington University)的Phil Green编写的软件(http//www.genome.washington.edu)。
将PAR1 SNPs分配至冠状动脉疾病在临床研究中，研究了来自基因3’非编码区域的两个PAR1多态性与一群患者中血栓形成和心血管并发症的联系。
下面用到下列缩写(所有标明的位置指的是在参考序列NM-001992中的核苷酸位置)。
PAR1 T3090T描述了一组个体，他们的PAR1基因的等位基因在3090位都具有胸腺嘧啶核苷(T)。这些个体对于此PAR1变体是纯合的。
PAR1 T3090C描述了一组个体，他们的PAR1基因的一个等位基因在3090位具有胞嘧啶核苷(C)且PAR1基因的另一个等位基因在3090位具有胸腺嘧啶核苷(T)。这些个体对于此PAR1变体是杂合的。
PAR1 C3090C描述了一组个体，他们的PAR1基因的等位基因在3090位都具有胞嘧啶核苷(C)。这些个体对于此PAR1变体是纯合的。
PAR1 A3329A描述了一组个体，他们的PAR1基因的等位基因在3329位都具有腺苷(A)。这些个体对于此PAR1变体是纯合的。
PAR1 A3329C描述了一组个体，他们的PAR1基因的一个等位基因在3329位具有胞嘧啶核苷(C)且PAR1基因的另一个等位基因在3329位具有腺苷(A)。这些个体对于此PAR1变体是杂合的。
PAR1 C3329C描述了一组个体，他们的PAR1基因的等位基因在3329位都具有胞嘧啶核苷(C)。这些个体对于此PAR1变体是纯合的。
在所分析的一组患者中(
图1)，观察到PAR1变体C3090C的纯合携带者与心房纤维性颤动和心肌病统计学上显著相关。在进行逻辑回归后，发现了PAR1变体C3090C的纯合携带者与PAR1变体T3090/T3090T的携带者相比心房纤维性颤动危险性增加1.97倍和心肌病危险性增加1.84倍(图3)。
对于PAR1变体C3329C的携带者，所述变体与PAR1变体C3329A/A3329A的携带者相比，与心房纤维性颤动的危险性增加2.35倍相关。另外，在PAR1变体C3329C的携带者中，所述变体似乎对于急性冠状动脉综合症和不稳定心绞痛的出现是保护性的。PAR1变体C3329C的携带者与PRA1变体A3329C/A3329A的携带者相比急性冠状动脉综合症和/或不稳定心绞痛出现的危险性降低到1/2.78(图4)。
因此可能，借助于本发明的方法并利用特定SNP类型的分离的PAR1序列或其片段，根据所呈现的结果确定人类个体是否分配到危险组。
质粒DNA的制备将1ml细菌过夜培养物转移至Eppendorf管中并在Heraeus Biofuge中离心(5000转/分钟，共5分钟)。将细菌细胞沉淀重悬于100μl冷的溶液I中然后置于冰上5分钟。
溶液I25mM tris-HCl，pH 8.0，50mM葡萄糖(无菌过滤的)、10mMEDTA、100μg/ml RNA酶A。
加入200μl的溶液II后，将全部混合物充分混合，致使DNA碱性变性。
溶液II200mM NaOH、1％SDS。
随后在冰上孵育5分钟后，将150μl溶液III加入至混合物中。然后再一次混匀并在冰上再孵育15分钟。
溶液III3M醋酸钠(pH4.8)。
在Heraeus Biofuge中以12000转/分钟离心15分钟，除去细胞碎片、基因组DNA和变性的蛋白质。将所产生的包含质粒DNA的上清液轻轻倒入另一个Eppendorf管中并用1ml 96％浓度的乙醇(或300μl异丙醇)混合。将沉淀混合物彻底混合并再一次离心(在Heraeus Biofuge中12000转/分钟共15分钟)。这致使质粒DNA沉淀。用冰预冷的70％浓度的乙醇洗涤质粒DNA沉淀，然后在空气中干燥。最后，将干燥的沉淀物溶解在50μl灭菌的蒸馏水中。
DNA的乙醇沉淀沉淀混合物DNA溶液、1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.4)、2至3体积的96％乙醇(1体积的异丙醇)。
将混合物混匀并可储存于-20℃，尽管这并不能增加沉淀产率。通过12000转/分钟共20分钟的离心使质粒DNA沉淀。
为了除去所用醋酸钠的残余物，沉淀后必须用1ml 70％浓度的乙醇将质粒DNA再洗涤一次。
DNA的苯酚萃取用相同体积的苯酚(Rotiphenol，用TE缓冲液平衡，pH 7.6，Roth，Karlsruhe，德国)将DNA溶液混合好，振荡5分钟并5000转/分钟离心5分钟。大多数现在已变性的蛋白质积聚在界面上。上层水相包含DNA并小心地将其吸走，然后为除去苯酚残余用氯仿/异戊醇混合物(24∶1)与水相混合。然后再一次离心，其后弃去水性上清液并通过乙醇沉淀从溶液中分离DNA。
扩增的DNA分子的纯化利用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化DNA扩增子。这除去了起始分子、核苷酸(dNTPs)、聚合酶及盐。为此，将PCR反应混合物与5、倍体积的PB缓冲液混合，混匀并应用于Qiaquick柱。所扩增的DNA于是选择性地结合到柱材料上，并且通过用750μl的PE缓冲液洗涤两次除去dNTPs。然后用所需体积的水洗脱扩增的DNA，水的体积最好与PCR反应混合物起始物质体积相同。
用限制酶切割DNA混合物3μl的DNA、2μl的10×切割缓冲液、2.5-5U的限制酶(例如EcoRI、BamHI、SalI、XbaI、XhoI等等)，加蒸馏水至20μl体积。
取决于限制酶，切割反应在25-55℃进行2小时。为了分析，将片段与长度标准物平行地在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中电泳分级分离。如果反应是双切割，那么首先将一种酶加入混合物。一小时后，将等分试样应用于合适的凝胶，那么，如果发生了切割，可加入第二种酶。如果第二种酶不在同样的切割缓冲液中切割，则首先需要乙醇沉淀。
DNA的琼脂糖凝胶电泳将琼脂糖(Roth)以所需的浓度溶解于1×琼脂糖缓冲液中并在微波炉中煮沸，直至琼脂糖完全溶解。然后将溶液倒入密封的Plexiglass水平床凝胶小室(flat bed gel chamber).
用1/10体积的加样蓝(loading blue)(50％v/v甘油；50mM EDTA；0.005％w/v BPB[Merck，Darmstadt，德国]和0.005％二甲苯腈蓝)混合DNA样品并移液到通过梳子产生的凝胶孔(gel pockets)中。
在作为运行缓冲液的1×琼脂糖缓冲液中以80-140V的恒定电压水平进行电泳，所述电压取决于凝胶的大小和电极间的距离。
1×琼脂糖缓冲液40mM Tris-HCl(pH7.8)、5mM醋酸钠、1mMEDTA。
DNA的聚丙烯酰胺凝胶电泳7.5％聚丙烯酰胺凝胶溶液；0.94ml的40％浓度的丙烯酰胺-双丙烯酰胺贮存液，0.5ml的10×TBE缓冲液(400mM Tris-HCl，pH 8.3；200mM醋酸钠，20mM EDTA)，0.25ml的1％AMPS，10μl的TEMED，3.33ml的蒸馏水。
将混合物注入安装在垂直装置中洗净的垂直玻璃板间进行聚合(大约10-20分钟)，凝胶在1×TBE缓冲液中以140V的恒定电压允许。
DNA测序将1-2μg DNA溶解于81μl蒸馏水中并加入9μl NaOH(2N)用于变性。在室温孵育10分钟后，沉淀混合物，用冰预冷的80％浓度的乙醇对所得DNA沉淀的彻底洗涤对于随后的测序反应是重要的。将2μl的5×测序酶缓冲液(200mM Tris-Cl pH 7.5/100mM MgCl2/250mM NaCl)，1μl寡核苷酸(1pM/μl)以及，最后，蒸馏水加入沉淀物达到总体积10μl。在随后37℃水浴30分钟的孵育过程中，起始寡核苷酸与DNA杂交。
将试剂加入到用于测序反应的杂交混合物中1.0μl的DTT(0.1M)、2.0μl的标记混合物(1∶5稀释)、0.5μl的[α-35S]dATP、2μl的SequenaseTM(13U/μl，United States Biochemical)，(用酶稀释缓冲液1∶8稀释)。
在随后室温5分钟的孵育过程中，相反链得以合成，通过放射性标记的dATP的掺入标记的合成DNA。其后在每例中将3.5μl标记混合物加入到2.5μl四种不同的终止混合物中。37℃下5分钟的另一次孵育导致相反链合成的随机分布的终止反应。通过加入4μl停止缓冲液来停止反应，其后将混合物在80-90℃变性然后应用于6％浓度的变性测序凝胶。加样后，在30-50W并且，分别地，1300-1600V进行主要运行(main run)共2-5小时。然后在10％浓度的醋酸浴中固定凝胶(15分钟)，在流水中释放尿素残余然后干燥(利用热风器45分钟，或在70℃的培养箱中2小时)。随后在4℃进行放射自显影16-24小时(Fuji Medical X-ray-Film RX，30×40；Kodak Scientific Imaging Film X-omat AR)。
标记混合物贮存液每例中7.5μM dATP、dTTP、dGTP、dCTP终止混合物每例中80μM dATP、dTTP、dGTP、dCTP以及每例中8μM各自的ddNTP测序酶稀释缓冲液10mM Tris/HCl，pH 7.5、5mM DTT、0.5mg/mlBSA停止缓冲液95％甲酰胺、20mM EDTA、0.005％(w/v)二甲苯腈蓝FF自动DNA测序混合物1μg的质粒DNA(在PCR片段的情况下，例如，100ng/500核苷酸)，3-5pmol的起始分子(如果可能，PCR引物，55℃的Tm，)，4μl的Dye Terminator ready-mix(FddNtps-AmpliTaqFS混合物)，加蒸馏水至20μl的体积。
用乙醇沉淀PCR反应物[25×(94℃15秒，50℃15秒，60℃4分钟)]并用4μl加样缓冲液吸收。然后样品在95℃下变性3分钟，通过离心除去并应用于垂直聚丙烯酰胺凝胶(34cm长，供以24个平行泳道)。
通过氩激光束在488nm激发后，染料发出525nm和605nm间的不同波长的光，所述光经过光栅——“光谱仪”分离成其光谱色。随后借助于CCD相机的高分辨率像素域检测光谱色。借助计算机(MacintoshQuadra/650 Macllcx Apple Share)和相应的数据分析软件(PE Biosystems，Weiterstadt，德国)记录数据。
测序凝胶30g的尿素(Sigma)、21.5ml的蒸馏水、6ml的10×TBE将混合物溶解于在50℃的加热器上的广口烧瓶中，接下来加入9ml的40％双丙烯酰胺(滤过的)、180μl的10％APS、24μl的Temed。
聚合酶链反应(PCR反应)可以使用下列DNA聚合酶Taq(水生栖热菌)DNA聚合酶(重组的，Gibco/BRL)和10×PCR缓冲液[200mM Tris/HCl(pH 8.4)、500mM KCl]Tfl(Thermus flavus)DNA聚合酶(Master AmpTM，Biozym，Oldendorf，德国)和20×PCR缓冲液[20mM(NH2)SO4、1M Tris/HCl(pH 9.0)]PCR反应混合物
接下来应用在74℃下30分钟内，1U催化10nM脱氧核糖核苷三磷酸转化为酸不溶的DNA产物。PCR反应通常起始于“热启动”为使DNA首次变性，首先在94℃无聚合酶存在下孵育混合物。在温度达到80℃后，将DNA聚合酶加入混合物以避免仍在低温下的非特异扩增。其后，实际的PCR反应进行25-35个循环。
对于每个循环，应用下列反应条件
最终和额外地，在72℃进行链延伸10分钟，最后冷却。
总RNA的分离所有离心步骤都以13000转/分钟在16℃下进行。
将细胞用600μl裂解缓冲液(100RLT缓冲液1巯基乙醇)裂解。细胞裂解物应用于QiaSchredder柱并离心2分钟除去。洗脱液与600μl 70％乙醇混合，混匀，并将DNA应用于RNAeasy mini旋转柱并离心15秒(RNA结合到硅基质)。将柱洗涤三次(用700ml RW1缓冲液洗涤1次并用500μl RPE缓冲液洗涤两次)。然后将柱转移到高压灭菌的1.5mlEppendorf管并用15μl蒸馏水洗脱RNA。这样所得总RNA的平均浓度为1μg/μl。
通过琼脂糖凝胶电泳进行RNA分级分离变性琼脂糖凝胶1g琼脂糖，37ml蒸馏水，10ml 10×MOPS(0.2mM MOPS，10mMEDTA，100mM NaAc)，煮沸混合物并冷却到60℃，加入16ml 37％浓度的甲醛。
凝胶固化后，将其与RNA凝胶运行缓冲液插入到电泳装置中。RNA与特定样品缓冲液一起应用。
RNA凝胶运行缓冲液40ml 10×MOPS，65ml 37％浓度的甲醛，295ml蒸馏水。
RNA样品缓冲液1-5μg的RNA、5μl的RNA-NEW缓冲液(7.5μl 37％浓度的甲醛、4.5μl的10×MOPS、25.9μl的甲酰胺、7.5μl的蒸馏水)、2μl的甲酰胺染料标记[50％(v/v)甘油、1mM EDTA(pH 8.0)、0.25％(v/v)溴酚蓝、0.25％(v/v)二甲苯腈蓝]。
以80V跑胶大约3小时。由于此工作用的只是真核的RNA分离物，胶上可见的显著条带应当是28S和18S rRNA的条带。
利用MMLV-RT(莫洛尼鼠白血病毒-逆转录酶)的逆转录酶逆转录酶混合物5μg的RNA、100μM的起始分子为了避免RNA模板可能形成二级结构作为干扰转录酶的因素，将RNA制备物和起始分子在75℃下孵育10分钟。然而，即使没有此步骤，转录反应也通常发生。
逆转录酶反应混合物28U的Rnasin(Promega)、25mM dNTPs、5μl的10×逆转录酶缓冲液[10m Tris/HCl(pH 8.3)、75mM KCl、3mMMgCl2]、50U的逆转录酶(StrataScriptTM，Stratagene)，用蒸馏水加至50μl。
通过将混合物在42℃下孵育15分钟和在37℃下孵育45分钟来进行逆转录。对于相对长的RNA模板建议42℃下2小时的更长孵育，其具有55℃下30秒的中断。混合物在95℃下5分钟的随后孵育导致了所述逆转录酶的失活。随后，将5-20μl的逆转录混合物用于PCR反应。
从组织制备基因组DNA将100mg组织在液氮中粉碎得到粉末。将组织粉末导入包含6ml反应缓冲液(将30μl的蛋白酶K[20mg/ml]新鲜加入到缓冲液中)的Falcon管中并在56℃小心振动孵育过夜(12-18小时)。孵育后，加入100μl RNA酶A(10μg/μl)并在37℃下进一步振动孵育混合物1小时。
此后加入4ml苯酚并手工上下颠倒地转动管子大约5分钟。立即加入4ml Cl(氯仿/异戊醇)并再次上下颠倒转动管子5分钟然后离心15分钟(3000转/分钟)。将上清液小心移去并转移到10ml Falcon管中。如果上清液仍然不澄清，必须重复苯酚萃取，否则再加入4ml Cl并手工上下颠倒地转动管子5分钟，然后离心15分钟(3000转/分钟)。将上清液小心移去并重复萃取。将所得的最后的上清液与1/10体积的醋酸钠溶液(3M，pH6)和2.5倍体积的乙醇(99.8％)相混合。小心旋转管子，直到DNA沉淀成结。借助玻璃钩(glass hook)将此DNA结转移至大约25ml的乙醇(70％)中并静置3分钟。重复洗涤两次。然后在室温下空气中干燥DNA并将其溶解在0.5ml双蒸水中。
DNA印迹经琼脂糖凝胶的DNA分离分级将凝胶置于短波紫外线下大约5分钟使较大的DNA分子(＞6kBp)中发生链断裂。
在变性溶液中不断地摇动凝胶30分钟使DNA变性。
在中和溶液中不断地摇动凝胶30分钟使之中和。
印迹结构(从底至顶)凝胶、尼龙膜、干滤纸、印迹纸、板、重物(大约1kg)。用20×SSC印迹过夜。
在2×SSC中洗膜10分钟在滤纸上干燥膜。通过80℃烘烤1小时或紫外线交联(例如，在“Stratalinker”中，自动定位)固定核酸。然后将膜贮存直到杂交。
膜在杂交溶液中预杂交大约1-2小时。覆盖膜上非特异结合位点。
杂交溶液5×SSC、5×Denhardt’s溶液、0.5％SDS、100μg/ml鲱精DNA变性溶液0.5M NaOH(20g)、1M NaCl中和溶液1.5M NaCl/0.5M Tris pH 7.420×SSC是3M NaCl、0.3M柠檬酸钠175.3g的NaCl、88.2g的柠檬酸钠×2H2O，用双蒸水加至1升，用HCl调pH至7.0。
50×Denhard’s溶液5g的Ficoll 400、5g的PVP(聚乙烯吡咯烷酮)、5g的BSA，用双蒸水加至500ml。
RNA印迹利用甲醛琼脂糖凝胶的RNA分级分离印迹结构(从底至顶)凝胶、尼龙膜、干滤纸、印迹纸、板、重物(大约1kg)。
用20×SSC印迹过夜。
通过80℃烘烤(1小时)将RNA固定在过滤器上。
将过滤器引入沸腾的20mM Tris pH 8中使RNA去乙醛酸化并冷却至室温。
附图描述图1研究组的特征。
图2PAR1变体T3090C和A3329C在所分析的1362个个体中的分布。
图3PAR1变体C3090C与心房纤维性颤动和心肌病的联系。
图4PAR1变体C3329C与心房纤维性颤动、急性冠状动脉综合症和不稳定心绞痛的联系。
图5人PAR1基因的cDNA在5’/3’方向的多核苷酸序列。该序列相应于通过NCBI核苷酸数据库编号NM-001992的公共可得的序列一致。所制备的序列与SEQ ID NO1相同。
图6人PAR1基因的cDNA在5’/3’方向的多核苷酸序列，其在根据NM-001992的序列的3090位上具有多态性，所述多态性包含T到C的替换。所描述的序列与SEQ ID NO2相同。
图7人PAR1基因的cDNA在5’/3’方向的多核苷酸序列，其在根据NM-001992的序列的3329位上具有多态性，所述多态性包含A到C的替换。所描述的序列与SEQ ID NO3相同。
图8人PAR1基因的cDNA在5’/3’方向的多核苷酸序列，其在根据NM-001992的序列的3090位上具有多态性，所述多态性包含T到C的替换，并同时在根据NM-001992的序列的3329位上具有第二个多态性，所述多态性包含A到C的替换。所描述的序列与SEQ ID NO4相同。
图9人PAR1基因的片段在5’/3’方向的多核苷酸序列。所述序列与SEQ IDNO5相同。
图10人PAR1基因的片段在5’/3’方向的多核苷酸序列，其在根据NM-001992的序列的3090位上具有多态性，所述多态性包含T到C的替换。所描述的序列与SEQ ID NO6相同。
图11人PAR1基因的片段在5’/3’方向的多核苷酸序列，其在根据NM-001992的序列的3329位上具有多态性，所述多态性包含A到C的替换。所描述的序列与SEQ ID NO7相同。
图12人PAR1基因的片段在5’/3’方向的多核苷酸序列，其在根据NM-001992的序列的3090位上具有多态性，所述多态性包含T到C的替换，并同时在根据NM-001992的序列的3329位上具有第二个多态性，所述多态性包含A到C的替换。所描述的序列与SEQ ID NO8相同。
图13人PAR1基因的cDNA的5’端在5’/3’方向的多核苷酸序列。所描述的序列与SEQ ID NO9相同。
图14人PAR1基因的cDNA的3’端在5’/3’方向的多核苷酸序列。所描述的序列与SEQ ID NO10相同。
图15人PAR1基因的cDNA在5’/3’方向的多核苷酸序列，涉及根据NM-001992的2767至2789位。所描述的序列与SEQ ID NO11相同。
图16人PAR1基因的1号外显子在5’/3’方向的多核苷酸序列。所描述的序列与SEQ ID NO12相同。
图17人PAR1受体的蛋白质序列。该序列与通过NCBI蛋白质数据库编号NP-001983公共可得的序列一致。所描述的序列与SEQ ID NO13相同。
序列表<110>塞诺菲-安万特德国有限公司<120>PAR1多态性对于心血管疾病的危险性评估的分析和用途<130>DEAV 2003/0030<140>
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Gln Lys Gln Leu Pro Ala Phe Ile Ser Glu Asp Ala Ser Gly Tyr Leu85 90 95Thr Ser Ser Trp Leu Thr Leu Phe Val Pro Ser Val Tyr Thr Gly Val100 105 110Phe Val Val Ser Leu Pro Leu Asn Ile Met Ala Ile Val Val Phe Ile115 120 125Leu Lys Met Lys Val Lys Lys Pro Ala Val Val Tyr Met Leu His Leu130 135 140Ala Thr Ala Asp Val Leu Phe Val Ser Val Leu Pro Phe Lys Ile Ser145 150 155 160Tyr Tyr Phe Ser Gly Ser Asp Trp Gln Phe Gly Ser Glu Leu Cys Arg165 170 175Phe Val Thr Ala Ala Phe Tyr Cys Asn Met Tyr Ala Ser Ile Leu Leu180 185 190Met Thr Val Ile Ser Ile Asp Arg Phe Leu Ala Val Val Tyr Pro Met195 200 205Gln Ser Leu Ser Trp Arg Thr Leu Gly Arg Ala Ser Phe Thr Cys Leu210 215 220Ala Ile Trp Ala Leu Ala Ile Ala Gly Val Val Pro Leu Val Leu Lys225 230 235 240Glu Gln Thr Ile Gln Val Pro Gly Leu Asn Ile Thr Thr Cys His Asp245 250 255Val Leu Asn Glu Thr Leu Leu Glu Gly Tyr Tyr Ala Tyr Tyr Phe Ser260 265 270Ala Phe Ser Ala Val Phe Phe Phe Val Pro Leu Ile Ile Ser Thr Val275 280 285Cys Tyr Val Ser Ile Ile Arg Cys Leu Ser Ser Ser Ala Val Ala Asn290 295 300Arg Ser Lys Lys Ser Arg Ala Leu Phe Leu Ser Ala Ala Val Phe Cys
305 310 315 320Ile Phe Ile Ile Cys Phe Gly Pro Thr Asn Val Leu Leu Ile Ala His325 330 335Tyr Ser Phe Leu Ser His Thr Ser Thr Thr Glu Ala Ala Tyr Phe Ala340 345 350Tyr Leu Leu Cys Val Cys Val Ser Ser Ile Ser Ser Cys Ile Asp Pro355 360 365Leu Ile Tyr Tyr Tyr Ala Ser Ser Glu Cys Gln Arg Tyr Val Tyr Ser370 375 380Ile Leu Cys Cys Lys Glu Ser Ser Asp Pro Ser Ser Tyr Asn Ser Ser385 390 395 400Gly Gln Leu Met Ala Ser Lys Met Asp Thr Cys Ser Ser Asn Leu Asn405 410 415Asn Ser Ile Tyr Lys Lys Leu Leu Thr420 42权利要求
1. PAR1基因的分离的多核苷酸序列，其包含根据NM-001992的序列在3090位上C代替T的替换。
2.如权利要求1要求保护的分离的多核苷酸序列，其中PAR1基因的多核苷酸序列包括根据SEQ ID NO2的序列。
3.如权利要求1要求保护的分离的多核苷酸序列，其中PAR1基因的多核苷酸序列包含根据SEQ ID NO2的序列。
4. PAR1基因的分离的多核苷酸序列，其包含根据NM-001992的序列在3329位上C代替A的替换。
5.如权利要求4要求保护的分离的多核苷酸序列，其中PAR1基因的多核苷酸序列包括根据SEQ ID NO3的序列。
6.如权利要求4要求保护的分离的多核苷酸序列，其中PAR1基因的多核苷酸序列包含根据SEQ ID NO3的序列。
7. PAR1基因的分离的多核苷酸序列，其包含每种情况下基于NM-001992在3090位上C代替T的替换和在3329位上C代替A的替换。
8.如权利要求7要求保护的分离的多核苷酸序列，其中PAR1基因的多核苷酸序列包括根据SEQ ID NO4的序列。
9.如权利要求7要求保护的分离的多核苷酸序列，其中PAR1基因的多核苷酸序列包含根据SEQ ID NO4的序列。
10. PAR1基因的分离的部分多核苷酸序列，其包含根据SEQ ID NO5的序列。
11. PAR1基因的分离的部分多核苷酸序列，其包含根据SEQ ID NO6的序列。
12. PAR1基因的分离的部分多核苷酸序列，其包含根据SEQ ID NO7的序列。
13. PAR1基因的分离的部分多核苷酸序列，其包含根据SEQ ID NO8的序列。
14.制备如权利要求1至9中任意一项要求保护的多核苷酸序列的方法，该方法借助于下列方法步骤实施a]提供人的cDNA，其包含根据SEQ ID NO2的PAR1序列和/或根据SEQ ID NO3的PAR1序列和/或根据SEQ ID NO4的PAR1序列，b]提供根据SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的引物对，c]通过聚合酶链延伸反应(PCR)扩增PAR1多核苷酸序列，d]分离和/或纯化从c]所获得的3.56kb的片段，e]对来自d]的片段测序。
15.制备如权利要求10至13中任意一项要求保护的多核苷酸序列的方法，该方法借助于下列方法步骤实施a]提供人的基因组DNA，其包含根据SEQ ID NO1的PAR1序列和/或根据SEQ ID NO2的PAR1序列和/或根据SEQ ID NO3的PAR1序列和/或根据SEQ ID NO4的PAR1序列，b]提供根据SEQ ID NO11和SEQ ID NO12的引物对，c]通过聚合酶链延伸反应(PCR)扩增PAR1多核苷酸序列的片段，d]分离和/或纯化从c]所获得的片段，e]将来自d]的片段测序。
16.检测方法，其用于检测在PAR1基因中是否具有在根据NM-001992的序列的3090位上T到C的替换和/或在根据NM-001992的序列的3329位上A到C的替换，该方法包括下列方法步骤a]提供包含人细胞的生物材料，b]从a]的材料获得染色体DNA，c]利用PCR反应，借助于根据SEQ ID NO11和SEQ ID NO12的引物扩增多核苷酸片段，d]将来自c]的多核苷酸片段测序。
17.检测方法，其用于检测在PAR1基因中是否具有在根据NM-001992的序列的3090上T到C的替换和/或在根据NM-001992的序列的3329位上A到C的替换，该方法包括下列方法步骤a]提供包含人细胞的生物材料，b]从a]的材料中获得RNA，c]借助于逆转录酶将所述RNA转录成cDNA，d]备选地借助于根据SEQ ID NO10和SEQ ID NO11的引物，利用PCR反应扩增多核苷酸片段，e]将来自c]的cDNA和/或来自d]的多核苷酸片段测序。
18.检测方法，其用于检测在PAR1基因中是否具有在根据NM-001992的序列的3090位上T到C的替换和/或根据NM-001992的序列的3329位上A到C的替换，该方法包括下列方法步骤a]提供包含人细胞的生物材料，b]从a]的材料获得染色体DNA，c]将来自b]的染色体DNA进行DNA印迹，d]提供根据SEQ ID NO5和/或SEQ ID NO6和/或SEQ ID NO7和/或SEQ ID NO8的探针，e]将来自c]的DNA印迹与来自d]的探针在严格杂交条件下杂交，f]通过比较来自e]的杂交结果，确定PAR1基因中在根据NM-001992的3090和/或3329位上的遗传性变异的存在或缺乏。
19.检测方法，其用于检测在PAR1基因中是否具有在根据NM-001992的序列的3090位上T到C的替换和/或根据NM-001992的序列的3329位上A到C的替换，该方法包括下列方法步骤a]提供包含人细胞的生物材料，b]从a]的材料中获得RNA，c]提供根据SEQ ID NO5和/或SEQ ID NO6和/或SEQ ID NO7和/或SEQ ID NO8的探针，e]将来自c]的RNA印迹与来自d]的探针在严格杂交条件下杂交，f]通过比较杂交结果，确定PAR1基因中在根据NM-001992的3090和/或3329位上的遗传性变异的存在或缺乏。
20.具有21至50个核苷酸的分离的多核苷酸序列，其包含根据SEQ IDNO11的序列。
21.分离的多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO11。
22.具有21至50个核苷酸的分离的多核苷酸序列，其包含根据SEQ IDNO12的序列。
23.分离的多核苷酸序列，其包含SEQ ID NO12。
24.如权利要求20或21要求保护的分离的多核苷酸序列与如权利要求22或23要求保护的分离的多核苷酸序列的用途，用于借助PCR反应来扩增PAR1基因的片段。
25.如权利要求24要求保护的用途，其中PAR1基因具有在根据NM-001992的序列的3090位上T到C的替换和/或在根据NM-001992的序列的3329位上A到C的替换。
26.试剂盒，其包含a]如权利要求20或21要求保护的多核苷酸序列，b]如权利要求22或23要求保护的多核苷酸序列，c]用于进行PCR反应的至少一种酶，d]任选地用于进行聚合酶链延伸反应(PCR)的物质和/或溶液，e]任选地如权利要求1至17中一项或更多项要求保护的多核苷酸序列，f]任选地用于进行测序的试剂。
27.用于制备如权利要求26所述的试剂盒的方法，该方法包括a]制备如权利要求20或21要求保护的多核苷酸序列，b]提供如权利要求22或23要求保护的多核苷酸序列，c]提供用于进行PCR反应的酶，d]适宜时，提供用于进行测序的试剂，e]任选地提供用于进行聚合酶链延伸反应(PCR)的物质和/或溶液，f]任选地提供如权利要求1至13中的一项或多项要求保护的多核苷酸序列，g]将来自a]至e]的成分在每种情况下分别引入合适的容器，h]适宜时，将来自g]的容器组合在一个或多个包装单元中。
28.如权利要求26或27要求保护的试剂盒的用途，用于扩增PAR1基因的片段并任选用于进一步分析PAR1基因中在根据NM-001992的3090位和/或3329位上是否存在遗传性变异。
全文摘要
本发明涉及多核苷酸序列，其包含PAR1基因在3090位和/或3329位上的遗传性变异。令人惊奇地，人类中所述变异的存在与特定的心血管疾病相关。本发明还涉及用于检测所述遗传性变异的方法。
文档编号C12Q1/68GK1791613SQ200480013663
公开日2006年6月21日 申请日期2004年4月16日 优先权日2003年4月24日
发明者D·科齐安, J·采奇, K-E·西格勒, J-F·德勒兹, S·里卡德, S·马赛 申请人:塞诺菲-安万特德国有限公司