专利名称：一种解旋高分子量全基因组超螺旋结构的方法
技术领域：
一种解旋高分子量全基因组超螺旋结构的方法，属于生物基因技术领域，特别涉及高分子量全基因组超螺旋结构的解旋方法。
背景技术：
生物遗传信息储存在基因组DNA分子中。除简单生物外，绝大多数生物基因组DNA分子分子量巨大，这使所期望的全基因组排序工作工程浩大，费力费时。例如，6国科学家共同努力完成的人类基因组计划(HGP)所耗用时间就超达10年。基因组测序计划中，工作量最大、耗时最长的任务是测序前需要绘制待测序生物全基因组图谱(包括遗传图、物理图、STS图、EST图等)，其工作几乎占据整个基因组计划的一半时间(人类基因组计划计划的前6年主要用于绘制基因组图谱)。因此，探索一种一次性解旋高分子量全基因组超螺旋结构的方法，为构建全基因组各标记位点图谱提供更加简便易行的基础方法，对于生物全基因组测序与研究具有重要实用价值和理论意义。
目前，解旋小分子量核酸或者核酸片段已有较多文献报道，常用方法有CytoC(细胞色素C)铺展法、BAC(苄甲基烷基氯化胺)铺展法、溴乙锭铺展法、SLS-CytoC(月桂酰肌苷酸钠-细胞色素C)铺展法等。其中以CytoC铺展法使用较多。然而，将这些方法用于铺展高分子量基因组并要达到完全解旋超螺旋结构，其效果均不理想，主要表现在①基因组解旋不完全，所获图像超螺旋纽节多，且数目难以分辨。②解旋后的基因组分子常出现断裂，难能得到完整基因组分子。③常规CytoC铺展法需加入较高浓度的CytoC才能将DNA分子展开，较高浓度的CytoC本身可遮盖核酸-蛋白质复合体显现，这难能观察研究核酸-蛋白质相互作用，且该方法完全解旋高分子量基因组仍然困难。④BAC和溴乙锭铺展法在一定程度上虽能铺展小分子量基因组并可用于观察到核酸-蛋白质复合体(因无CytoC存在)，但铺展单链基因组分子时常出现纽节；而且，BAC方法制样时，铜网上的样品易被污染，图像反差低，背景欠干净而不易区别，碳膜需新鲜制作且需活化，铺展的基因组分子对醋酸氧铀和酸性磷钨酸染料亲和力低。⑤Zollinger等人在总结前人工作的基础上，提出了SLS-CytoC铺展法(见Zollinger M，Gaertin M，Mamet-Bratley MD.Anal Biochem，1977，82196-203)，该方法虽能克服BAC和溴乙锭铺展法的一些不足，相对也可观察到核酸-蛋白质复合体，但图像背景仍差，核酸-蛋白质复合体显示不够清楚(因所用细胞色素C浓度仍未能有效克服对核酸-蛋白质复合体的遮暗效应)，且仅适合于小分子基因组及其片段观察。
发明内容
本发明对Zollinger等人的SLS-CytoC铺展法方法进行改进，提出一种解旋高分子量基因组超螺旋结构的方法。通过本发明可简单、方便地获得解旋后的高分子量完整基因组，并为基因组各相关标记位点图谱(如全基因组特异蛋白结合位点图谱、酶切物理图谱、STS图谱、EST图谱、变性图谱、异源双链图谱等)的绘制提供信息，从而大大加速高分子量基因组生物(尤其是真核生物)基因组测序进程。
本发明详细技术方案为一种解旋高分子量全基因组超螺旋结构的方法，其特征是，它包括以下步骤1、生物完整基因组制备。按常规方法制备并提纯生物基因组DNA分子，并在-20℃温度条件下保存备用。
2、支持膜制备。1)、利用火棉胶和醋酸异戊酯制成2％火棉胶醋酸异戊酯溶液，备用；2)、洁净培养皿中铺放适当大小干净滤纸一张，盛双蒸水达3/4左右体积，用镊子放洁净铜网于滤纸上，待水面平静后，于水面轻轻滴入一滴2％火棉胶醋酸异戊酯液，静置5分钟使其成膜，用洗耳球从皿边缘吸去双蒸水，50-60℃条件下烘干备用。
3、电子显微学样品制备，1)、按下表配制铺展液(上相液)
毕后，用微量进样器针头轻微拌动约100圈。
2)、按下表配制下相液
3)、基因组铺展取洁净载玻片一张，斜放于Teflon皿中(如图1所示)，倾下相液于Teflon皿内。用Teflon棒于下相液液面趋赶污物，之后，轻轻抖下少量滑石粉，待滑石粉散开后，用微量进样器吸取适量上相液于载玻片斜面上小心均匀排出。待上相液迅速下滑至Teflon皿的边缘呈现出光亮单层膜区约10秒钟后用镊子夹住覆有火棉胶膜的铜网捞片，得到未经染色的电子显微学样品。
4)、样品染色将未经染色的电子显微学样品用90％乙醇脱水约10秒钟后转入5×10-5％摩尔/升浓度的醋酸双氧铀(UAc)中染色30分钟左右，之后转入90％乙醇中清洗约1秒钟，吸干滤纸后得到最终的电子显微学样品。
本发明的实质是对Zollinger等人的SLS-CytoC的电镜核酸方法进行了如下改进①将铺展液中的SLS浓度提高5倍；②将CytoC浓度降至50mg/mL；③操作中并辅之以适当的流体切力拌动，结果获得了较之Zollinger原方法效果更佳、且能获得一次性充分解旋全基因组超螺旋结构的完整基因组分子。本方法能较好用于生物基因组(尤其是高分子量真核基因组)测序所需的各种定位标记图谱构建、核酸-蛋白质相互作用研究、基因组结构研究等领域。
最终的电子显微学样品制作好后，可借助透射电镜观察并拍摄生物基因组DNA分子的解旋结果。
与同类技术比，本发明所述方法有如下特点(1)一次性完全解旋高分子量全基因组超螺旋结构，电镜观察证明交叉点＝0，所获基因组分子图像背景清晰、反差好、光滑、柔韧、无缠结与断裂、且无纵向伸长。(2)电镜观察证明，特异结合于基因组分子上的互作蛋白质(酶)分子显示十分清楚。(3)利用电镜能直接观察并测定到基因组解旋后的每一完整分子信息，如分子量、不均一性等。
需要说明的是高分子量基因组超螺旋结构的解旋是一个非常“微妙”的过程，影响因素较多，有时一个因子未能满足，可能会影响整个铺展效果。操作时应同时注意考虑如下因素①通常认为基因组体外解旋可能是通过流体切力先使基因组的一条链断裂，让其周绕另一链旋转而达到解旋超螺旋。但也有实验证明，流体切力是随机的，不能完全破坏基因组所有超螺旋纽节。因此，完全开环DNA分子的获得除了流体切力的随机作用外，可能还与SLS的铺展性能有重要关系。
②基因组样品纯度可能会影响铺展效果和重复率，样品越纯，效果越佳。在进行病毒基因组铺展中，为保证铺展后基因组分子完整而不断裂，建议最好用离心纯化的病毒粒子按本方法进行直接释放铺展。
③器具清洁度会影响铺展液面的推开程度，进而可能会直接影响DNA的分散度。操作时，尤其应是用洁净的载玻片、Teflon棒和Teflon皿。
④制样过程中，因拌动而产生的流体切力强度应适当，过强可能会造成基因组分子断裂。而且这在观察核酸-蛋白质相互作用时可能会导致基因组上特异结合的互作蛋白数量减少；但强度不足，基因组解旋超螺旋可能会不完全。具体操作过程中可使用微量进样器针头轻微拌动铺展液约100圈，不仅必要，而且效果好。
⑤下相液表面性质可影响基因组分散度。建议下相液表面单层膜形成后约10秒钟后再开始捞片。经验表明，该时间少于10秒钟或大于20分钟，基因组分散度均有所降低。而且，时间过长，观察核酸-蛋白质相互作用时基因组上特异结合的互作蛋白数量减少。
本发明有益效果1、技术上①样品用量少，仅需毫微克基因组材料就能满足制样需要；②制样过程迅速，数小时即能得到结果；③方法简便，直观，易掌握。
2、适于生物全基因组各种物理图谱绘制。
利用本发明所述方法可一次性简易绘制全基因组各相关标记位点图谱(如基因组特异蛋白结合位点图谱、酶切物理图谱等)，从而大大加速高分子量基因组生物(尤其是真核生物)基因组测序进程。
3、可为从全基因组角度直观研究生物遗传结构提供技术支撑。
电镜能直接观察到每一基因组分子，所获结果能在电镜图片上真实反映并一一检测出来。电镜显示的是基因组的单分子行为，可很好克服生化凝胶电泳分析方法只能反映基因组分子集合行为的众多不足。利用本发明所述方法能解旋高分子量基因组并获得完整分子，从而为从全基因组角度直观研究生物遗传结构提供了较好技术支撑。
4、可直接用于蛋白质--核酸相互作用研究。
蛋白质--核酸相互作用是分子生物学领域有关基因识别、切割、复制、重组、表达、调控等过程的一个基本问题。本技术解决了核酸-蛋白质相互作用领域所涉及的两个最基本问题①高分子量全基因组超螺旋结构体外解旋；②基因组互作蛋白(酶)在解旋基因组上的清晰显现。例如，用本技术研究基因组与限制性酶结合关系，限制酶一定时限内在基因组各位点上结合的先后快慢、单酶或多酶结合、各限制酶片段长短、切割先后等，都可在电镜图片上一一反映出来，并能一次性绘制成物理图谱供全基因组测序作定位标记参考。这些工作毋需DNA重组技术、酶切探针标记、片段杂交等繁琐操作，较之生化方法快捷且容易得多(尤其当基因组存在若干限制酶位点时)。
图1为基因组铺展示意图。
图2-4所示为PbGv(大菜粉蝶颗粒体病毒)基因组经本发明所述方法解旋后，JEM-100CX电镜下拍摄到的完整开环PbGv-DNA分子。照片显示，解旋后的PbGv-DNA分子光滑、舒展、分散性良好，显示出天然柔性，金属投影后直径为6-8nm(24000X)。
图5-图10为PbGv-DNA分子经本发明所述方法解旋后，PbGv-DNA开环分子上结合的EcoRI示意图。电镜显示EcoRI显示清楚，它们并不被本技术条件下的细胞色素C所遮盖；EcoRI可分为大、小颗粒，大颗粒直径20-27nm，小颗粒16-18nm；Mg2+存在时，结合在PbGv-DNA分子的EcoRI主要为大颗粒。
其中图5-6显示解旋后PbGv-DNA开环分子上有两个EcoRI酶点，JEM-100CX拍摄，24000X；图7显示解旋后PbGv-DNA开环分子上有五个EcoRI酶点，JEM-100CX拍摄，24000X；图8显示同一视野下可见到三个开环PbGv-DNA分子，其中一个PbGv-DNA分子上有两个EcoRI，另两个PbGv-DNA分子上各有一个EcoRI。JEM-100CX拍摄，12500X；图9显示PbGv-DNA上结合有一个大颗粒EcoRI(直径26.7nm)，有一个小颗粒EcoRI(直径17.8nm)游离于环境中，DNA直径8nm。JEM-100CX拍摄，22500X；图10PbGv-DNA上的大颗粒EcoRI进一步放大。JEM-100CX拍摄。
图11采用本技术一次性构建的PbGv-DNA-EcoRI相互作用结合位点物理图谱。
图12所示经本发明所述方法随机测定的74个PbGv-DNA分子量分布。表明PbGv-DNA基因组分子长度存在多态性，即个体遗传结构有明显差异。其中，PbGv-DNA的最大分子长度为124.1Kb，最小分子长度为95.8Kb，群体分子模态长度为109.7±7Kb(群体分子量分布中该分子量分子表现为最大峰)，此与凝胶电泳分离得到的分子量(108.2Kb)十分吻合。
具体实施例方式
按照本发明所述的方法，对大菜粉蝶颗粒体病毒(PbGv)基因组进行解旋，所制得的解旋样品经JEM-100CX电镜观察并拍摄结果，如图2至图10所示。照片显示，解旋后的PbGv-DNA分子光滑、舒展、分散性良好，显示出天然柔性，金属投影后直径为6-8nm(24000X)。另外，EcoRI显示清楚，它们并不被本技术条件下的细胞色素C所遮盖；EcoRI可分为大、小颗粒，大颗粒直径20-27nm，小颗粒16-18nm；Mg2+存在时，结合在PbGv-DNA分子的EcoRI主要为大颗粒。用本技术研究PbGv-DNA，除发现群体模态分子的平均分子量(109.7±7Kb)与凝胶电泳分离得到的分子量(108.2Kb)十分吻合外，也发现部分PbGv-DNA分子存在“个体差异”。利用本技术于电镜下一次性初步绘制的高分子量PbGv-DNA-EcoRI相互作用结合位点物理图谱如图11所示。用本技术随机测定的74个PbGv-DNA(大菜粉蝶颗粒体病毒DNA)分子，其模态分子长度(109.7±7Kb)与生化凝胶电泳方法得到的分子量(108.2Kb)十分吻合。
权利要求
1.一种解旋高分子量全基因组超螺旋结构的方法，其特征是，它包括以下步骤1)、生物完整基因组制备，按常规方法制备并提纯生物基因组DNA分子，并在-20℃温度条件下保存备用；2)、支持膜制备，包括(1)、利用火棉胶和醋酸异戊酯制成2％火棉胶醋酸异戊酯溶液，备用；(2)、洁净培养皿中铺放适当大小干净滤纸一张，盛双蒸水达3/4左右体积，用镊子放洁净铜网于滤纸上，待水面平静后，于水面轻轻滴入一滴2％火棉胶醋酸异戊酯液，静置5分钟使其成膜，用洗耳球从皿边缘吸去双蒸水，50-60℃条件下烘干备用；3)、电子显微学样品制备，包括(1)、按下表配制铺展液(上相液)
毕后，用微量进样器针头轻微拌动约100圈；(2)、按下表配制下相液
(3)、基因组铺展取洁净载玻片一张，斜放于Teflon皿中，倾下相液于Teflon皿内。用Teflon棒于下相液液面趋赶污物，之后，轻轻抖下少量滑石粉，待滑石粉散开后，用微量进样器吸取适量上相液于载玻片斜面上小心均匀排出。待上相液迅速下滑至Teflon皿的边缘呈现出光亮单层膜区约10秒钟后用镊子夹住覆有火棉胶膜的铜网捞片，得到未经染色的电子显微学样品；(4)、样品染色将未经染色的电子显微学样品用90％乙醇脱水约10秒钟后转入5×10-5％摩尔/升浓度的醋酸双氧铀(UAc)中染色30分钟左右，之后转入90％乙醇中清洗约1秒钟，吸干滤纸后得到最终的电子显微学样品。
全文摘要
一种解旋高分子量全基因组超螺旋结构的方法，属于生物基因技术领域，特别涉及高分子量全基因组超螺旋结构的解旋方法。本发明实质上是对Zollinger等人报道的核酸电镜铺展技术进行了改进①将铺展液中的SLS浓度提高5倍；②将细胞色素C浓度降至50mg/mL；③操作中辅之以适当的流体切力拌动。本发明可一次性获得充分解旋全基因组超螺旋结构的完整基因组分子；结合于基因组分子上的特异互作蛋白质(酶)分子显示清楚；能直接观察并测定到基因组解旋后的每一完整分子信息，如分子量、不均一性等；所获基因组分子图像背景清晰、反差好、光滑、柔韧、无缠结与断裂、且无纵向伸长。本技术能较好用于生物基因组测序所需的各种定位标记图谱构建、核酸－蛋白质相互作用研究、基因组结构研究等领域。
文档编号C12N15/00GK1807615SQ20051002243
公开日2006年7月26日 申请日期2005年12月29日 优先权日2005年12月29日
发明者马义才 申请人:电子科技大学