专利名称：九孔鲍免疫因子特异抗体的制备及其检测方法
技术领域：
本发明属于无脊椎动物中贝类的免疫因子抗体的制备及其检测方法。
背景技术：
贝类在无脊椎动物中占有重要地位，大多数是经济价值较高的种类。贝类养殖已跃居整个水产养殖业的第一位。随着大规模养殖的兴起，病害成为阻碍贝类养殖的主要因素之一。贝类养殖通常是在开放性的水域中，目前还没有针对贝病的有效控制途径。虽然有专家学者已着手贝病的研究，但其中大量的工作是对病原进行分析与鉴定，而对防治贝病的另一重要方面即贝类自身免疫反应的研究相对较少，研究的方法也相对滞后。九孔鲍是我国南方海水养殖的重要经济贝类，具有很高的营养和药用价值。2000年我国南方养殖面积已达55万m2，育苗量5亿多粒，成品鲍鱼3500t以上。随着鲍鱼养殖规模的扩大，集约化程度的提高，各种病害也越来越频繁地发生并愈演愈烈，严重制约了养鲍业的发展。而现有的防病治病措施远落后于病害的蔓延速度，随着食品安全制度的健全，出口标准的不断提高，使得对养殖中普遍应用的抗生素避而远之。如何利用现代生物技术防治贝类病害将成为保障鲍安全养殖、稳定发展的关键因素，而对其分子免疫机理的掌握是研制新型生物疫苗、安全生物制剂的基础。
发明内容
本发明目的是要利用抗九孔鲍核转录因子(nuclear factor-kappa B，NF-κB)的DBD和TAD两个多克隆抗体，通过间接夹心酶联免疫反应试验(ELISA)和蛋白杂交(Westernblotting)的方法检测该因子在不同时段和不同环境作用下蛋白水平的变化，进而提供一种对养殖贝类，特别是九孔鲍免疫相关因子的检测技术，该项技术操作简单、省时、省力，可快速、可靠的检测出NF-κB这一表达量很少的免疫因子。
自从作者(Sen和Baltimore)由B淋巴细胞核抽提物中首次检测到核因子κB后，NF-κB介导的细胞信号途径一直倍受关注。最近研究发现，NF-κB在免疫应答、炎症反应、细胞分化和生长、细胞粘附和细胞凋亡等一系列细胞功能中发挥重要作用，其不但能启动相关细胞因子的转录，而且还具有调节这些基因的作用。
NF-κB家族的蛋白的N端通常具有一个保守的DNA结合域(DNA binding domain，DBD)，通常大小在300个氨基酸左右，该区域是与DNA结合形成聚合物的功能区；而位于C端的转录激活域(transactivation domain，TAD)具有转录激活功能，该区域在NF-κB家族各成员之间的保守性较低。大量研究表明，多种动物都存在NF-κB介导的信号途径，其功能和结构具有很高的保守性。利用核转录因子的生物学特性，结合现代分子生物学技术研究九孔鲍分子免疫机理将有利于从病原与宿主双方面入手，开创有效的防治贝病的新思路和新技术。
发明的技术方案基于NF-κB的保守结构，从九孔鲍(Haliotis diversicolor supertexta)血淋巴细胞中克隆了NF-κB基因的全长序列，利用原核表达系统分别表达九孔鲍NF-κB的DBD和TAD两个活性结构区，产物经凝胶亲和柱纯化后，分别注射家兔得到相应的抗九孔鲍NF-κB的DBD和TAD两个多克隆抗体。其中，抗DBD抗体对所有NF-κB家族的蛋白都有效；抗TAD抗体只对九孔鲍NF-κB蛋白有效。
抗九孔鲍NF-κB的DBD和TAD两个多克隆抗体的获得，能有效地检测出该蛋白因子在不同时段和不同环境作用下蛋白水平的变化。抗DBD抗体能对所有NF-κB家族的蛋白进行检测；抗TAD抗体只对该物种NF-κB蛋白有效。利用两种抗体分别对九孔鲍NF-κB因子进行Western blotting检测，比对相应的阳性条带，最终结果将更准确、可靠。而在ELISA检测中加入双抗体，将使得抗体与抗原间有更多的结合位点，加入二抗时，原有的信号将会成倍放大，这种利用双抗体与二抗联用的间接夹心ELISA检测方法比用单一抗体检测更灵敏，且操作简单，省时、省力，尤其适用于如NF-κB这样表达量极少的免疫因子的检测。
技术方案的操作步骤1.设计鲍核转录因子(NF-κB)的特异引物，利用3′和5′RACE扩增原理从九孔鲍血淋巴细胞中克隆NF-κB基因的全长序列，利用生物信息软件寻找比对九孔鲍NF-kB因子的DBD和TAD正确的编码框。
2.将编码DNA结合域(DBD)和转录激活域(TAD)的编码框连入pGEX-4T-2原核表达载体，转化大肠杆菌BL21产物。
3.表达产物经Glutathione SepharoseTM(Armersham)凝胶亲和柱纯化后，分别注射家兔得到相应的抗九孔鲍NF-κB的DBD和TAD两个多克隆抗体。
4.用普通间接ELISA方法检测抗体效价。
5.用两种抗体分别对九孔鲍NF-κB因子进行Western blotting检测，分析结果。
6.利用双抗体与二抗联用的间接夹心ELISA检测九孔鲍NF-κB因子。
本发明与现有技术相比所具有的优点和积极效果目前对贝类免疫系统的研究还处于起始阶段，可借鉴的数据和资料非常有限，而对于贝类免疫因子的检测，还没有一套完整、成熟的系统。基于对高等动物和许多模式物种的研究结果以及对现有分子生物技术的整合，该项发明建立了鲍鱼免疫因子NF-κB的检测系统，能为日后创建更有效，成熟的贝类免疫因子的检测方法及贝类免疫系统模型的构建提供参考。
具体实施例方式
具体实施例方式1、九孔鲍NF-κB基因的克隆及其DBD和TAD结构域的表达(1)设计鲍NF-κB的特异性引物，通过RT-PCR扩增目的片断，连接载体，测序。
(2)利用3′和5′RACE扩增原理克隆鲍NF-κB基因的全长序列，用生物信息软件寻找比对正确的DBD和TAD编码框。
(3)设计PCR引物，分别扩增DBD和TAD两个结构域，再分别插入表达载体pGEX-4T-2(Armersham)，转化大肠杆菌BL21，IPTG诱导表达目的蛋白。
2、抗DBD和TAD抗体的制备(1)蛋白纯化①表达GST-DBD和GST-TAD的菌液各100ml，10000×g，离心10分钟；分别加入4mlPBS，超声破碎50次，每次3秒；加入PMSF之终浓度10mmol混匀，10000×g，离心10分钟；上清液经0.22μ的滤器过滤，至于冰上待用。
②用10倍柱体积的PBS平衡Glutathione Sepharose凝胶亲和纯化柱，将超声破碎的滤液，用注射器以1ml/min的速度缓慢通过纯化柱。
③10倍柱体积的PBS洗柱，以10倍柱体积的洗脱液洗脱结合的蛋白。
(2)免疫动物将纯化的蛋白浓度调制2μg/μl，与等量的弗氏完全佐剂混合，乳化，注射免疫家兔。于两周后再以弗氏完全佐剂乳化纯化的蛋白，进行加强免疫。再两周后，耳静脉取2毫升血，检测抗体效价。
(3)抗体效价检测用间接ELISA技术测定抗体效价及最佳工作浓度。
间接ELISA操作包被液稀释抗原→抗原包备→洗板→加入不同稀释倍数的一抗→洗板→加入酶标二抗→洗板→加入底物显色液→终止反应→酶标仪检测。
3、鲍NF-κB的检测(1)样品准备分别取近九孔鲍的足肌、鳃、外套膜和肝胰腺研磨后加入2倍体积的pH为7.4的PBS，离心取上清液，经0.22μ的滤器过滤，待用。
(2)Western blotting检测将待测样品与6×上样缓冲液混合，煮沸5分钟，立即至于冰上。样品加入SDS-PAGE胶中，电泳后，以半干转移法，转至PVDF膜上，转好后的膜放入含5％脱脂奶粉的PBST中封闭1小时，弃封闭液，于新的封闭液中按预先计算的一抗效价加入抗DBD抗体，轻轻摇动1小时，用PBST洗3次，每次5分钟；于PBST中加入HRP标记的羊抗兔二抗，摇动标记1小时；PBST洗3次，每次5分钟；于DAB显色液中显色，待理想的结果出现后，清水中洗净膜，烘干。
用抗TAD抗体的Western blotting的操作步骤同上。将两次结果相比较，同一位置出现的信号为阳性结果。
(3)间接夹心ELISA检测①用碳酸缓冲液将待测样品稀释成蛋白含量为100ug/ml。(300ul lmg/ml+700ul碳酸缓冲液)。
②于微量反应板各孔加100ul稀释的可溶性抗原，4℃18小时后取出，弃去包被液，用PBST洗涤3次，加入5％脱脂奶粉的PBST，37℃作用2小时后，甩干封闭液，用PBST洗涤3次，5min/次，并甩干。
③按预先计算的一抗效价加入用PBS稀释的抗DBD和抗TAD血清，每孔100微升，37℃作用1小时，PBST洗涤3次，5min/次，并甩干。
④加入酶标二抗，每孔100微升，37℃作用1小时后用PBST洗涤3次，5min/次，甩干。
⑤加入TMB显色液，每孔100微升，室温作用5分钟后，加2M硫酸终止反应。测定OD490，或根据阳性及阴性对照直接判定结果。
碳酸缓冲液(pH9.6)NaHCO3 2.93g，Na2CO3 1.59g蒸馏水1L封闭液5％脱脂奶粉的PBST稀释液PBS(pH7.4)-0.02％Tween20底物溶液0.2M Na2HPO4(28.4g/L) 25.7ml，0.1M柠檬酸(19.2g/L) 24.3mlH2O50ml30％H2O2(临用前加入) 15ulTMB(临用前加入) 40mg。
权利要求
1.九孔鲍免疫因子特异抗体的制备方法，其特征是包括以下操作步骤(1)设计鲍核转录因子NF-kB的特异引物，利用3′和5′RACE扩增原理从九孔鲍血淋巴细胞中克隆NF-KB基因的全长序列，使用生物信息软件寻找比对正确的编码框；(2)将编码DNA结合域DBD和转录激活域TAD的编码框插入PGEX-4T-2原核表达载体，转化大肠杆菌BL21；(3)表达产物经谷胱甘肽凝胶亲和柱纯化后，分别注射家兔得到相应的抗九孔鲍核转录因子的DBD和TAD两个多克隆抗体。
2.由权利要求1制备的九孔鲍免疫因子特异抗体的检测方法，其特征是用普通间接酶联免疫反应试验ELISA方法检测抗体效价，其检测程序为包被液稀释抗原→抗原包被→洗板→加入不同稀释倍数的一抗→洗板→加入酶标二抗→洗板→加入底物显色液→终止反应→酶标仪检测。
3.由权利要求1利用制备的特异抗体检测九孔鲍免疫因子的检测方法，其特征是用两种抗体分别对九孔鲍核转录因子进行蛋白杂交Western blotting检测。
4.由权利要求1利用制备的特异抗体检测九孔鲍免疫因子的检测方法，其特征是利用双抗体与二抗联用间接夹心酶联免疫反应试验检测九孔鲍核转录因子。
全文摘要
九孔鲍免疫因子特异抗体的制备及其检测方法，该抗体的制备是先设计核转录因子(NF－kB)的特异引物，寻找比对编码框，将DNA结合域(DBD)和转录激活域(TAD)的编码框连入原核表达载体，转化大肠杆菌，经凝胶亲和柱纯化后，注射家兔得九孔鲍核转录因子的DBD和TAD两个多克隆抗体，该抗体可以用普通间接ELISA检测抗体效价。用两种抗体对九孔鲍核转录因子进行蛋白杂交(Western blotting)检测；亦可利用双抗体与二抗联用间接夹心酶联免疫反应试验(ELISA)检测九孔鲍核转录因子。本发明提供一种对养殖贝类，特别是九孔鲍免疫因子的检测技术，有助于对贝类分子免疫机理的研究，进而有助于利用现代生物技术防治贝类病害。
文档编号C12N15/09GK1775807SQ20051006177
公开日2006年5月24日 申请日期2005年12月2日 优先权日2005年12月2日
发明者吴信忠, 姜玉声, 吴刘记 申请人:浙江大学