一株应用于原油脱硫的兼性嗜热古地分枝杆菌的制作方法

专利名称：一株应用于原油脱硫的兼性嗜热古地分枝杆菌的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体的说涉及一株可在嗜热条件下脱除原油中有机硫的古地分枝杆菌。
背景技术：
化石燃料中含有大量的硫元素，在燃烧过程中形成SOx类有毒气体，释放到大气中转化为酸雨严重污染大气和水源，破坏生态环境，威胁着人类赖以生存的绿色家园。随着能源危机的进一步加剧，低硫化石燃料越来越少，重质油的开采成为必然，重质油硫含量高，粘度大，脱硫工艺复杂。
欧洲2005年已实施欧IV排放标准，要求汽油硫含量小于50ppm，车用柴油硫含量小于50ppm；2010年将实施欧V排放，主要要求将车用汽柴油硫含量降到10ppm以下。我国也将对车用燃油实施越来越严格的控硫标准，2005年7月1日全国开始执行欧洲II排放标准，这要求汽油硫含量不大于500ppm。按照国家环保局要求，2007～2010年全国开始实施国家第三/四阶段排放标准(等效采用欧III/IV排放标准)。北京于2005年7月提前实施欧洲III排放标准，要求汽油硫含量不大于150ppm，柴油硫含量不大于350ppm。
传统加氢脱硫技术(HDS)脱硫过程中，使用无机催化剂在200～450℃高温和150～200psig高压下反应才能达到脱硫的要求。HDS技术存在着高温高压、使用大量氢气、能耗大、引起二次污染等缺点，并且HDS技术不能脱除苯并噻吩类杂环含硫化合物中的硫。由于HDS的局限性及各国立法对油品中硫含量的严格限制，迫切需要寻找新的石油脱硫方法。
近年来，迅速发展的生物催化脱硫技术(BDS)在常温下即可进行，并且具有高专一性，这使得BDS方法成为一种可供选择的方法。化石燃料中有机硫主要为噻吩类，包括噻吩、苯并噻吩、二苯并噻吩(DBT)以及含有更多苯环的噻吩类及其甲基取代物，生物脱硫研究以DBT为模式化合物进行。现在已经证实许多菌属如红球菌属(Rhodococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒杆菌属(Corynebacterium)、节杆菌属(Arthrobacte)、分枝杆菌属(Mycobacterium)等，能够沿着硫专一途径降解DBT，它们不打开苯环，从而保留了燃烧值。
与柴油、汽油相比，原油具有硫含量大，成分复杂，粘度高等特点。现有的精练技术费用高，并且不适用于深度脱硫。如果在原油冶炼前将硫含量降到一个较低的水平就可以大大降低下游处理压力，降低成本。由于原油中硫成分复杂，含有无机硫及大量有机硫，有机硫主要为硫醇、硫醚和噻吩类杂环化合物，要求生物脱硫菌株具有较宽的底物范围。根据专利和文献检索，Toshiki等2003年报道了Mycobacterium phlei WU-F1在45℃下对轻质柴油达到60％～70％的脱硫率，Yoshitaka等2004年报道了Mycobacteriumphlei WU-0103在45℃下处理直馏轻质柴油达到52％的脱硫率，但是，尚无在高温下对原油具有明显脱硫效果的菌株报道。目前，为了提高采油率，很多油田采用注水驱油，使得原油中水份含量高达80％～90％，这给后处理带来很多麻烦，却为生物脱硫创造了更好的条件。如此高的含水量可以保证生物催化剂的活力。
然而，由于原油出井后常处于较高温度，为了将生物催化剂真正应用到炼油，工厂进行生物脱硫时，要求所用的生物催化剂在较高的温度下具有活力。因此使用嗜热微生物脱硫表现出明显的优势，如嗜热微生物可以省去精炼中油品冷却过程带来的麻烦，并可提高生物脱硫的反应速率；嗜热微生物酶催化制剂稳定性好；嗜热微生物在较高温度下生长，可抑制其它微生物的生长，减少生物催化剂的污染；高温下原油粘度降低，降低操作难度。因此嗜热微生物脱硫具有更大的应用前景，成为近年来研究的热点。

发明内容
针对现有技术中脱除原油中有机硫方法的不足，本发明要解决的问题是提供一株应用于原油脱硫的兼性嗜热古地分枝杆菌，此菌株能够在45℃下专一性降解DBT，生成2-羟基联苯，并可以进一步作用于2-羟基联苯生成2-甲氧基联苯，并且本发明所提供的菌株在45℃下所具有的对原油的生物脱硫能力是首次发现。
本发明提供的菌株为兼性嗜热古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)。该菌株于2005年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国武汉)，保藏中心编号为CCTCC NO.M 205142。
上述古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142经德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Braunschweig，Germany)鉴定，具有如下生物学特征菌体为弯曲杆状菌，大小为0.3～0.5×2.0～3.0μm，生长初期菌落为乳白色，渐变为黄色，菌株好氧，不运动，无孢子，过氧化物酶阳性，氧化酶阴性，硝酸盐还原阳性，酸染色不着色，革兰氏染色阳性。菌株细胞壁含有谷氨酸，丙氨酸，消旋二氨基庚二酸。主要的细胞壁糖成分为阿拉伯糖，半乳糖。16S rDNA序列比对分析发现所述菌与分枝杆菌属古地分枝杆菌具有99％的相似性。
根据上述生理特征及16S rDNA序列分析确定本发明所述CCTCC NO.M 205142菌株为古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)。
上述古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142的16S rDNA基因序列长度为1384个碱基，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142的培养温度为25～50℃，可以在MAM(modification of A Medium)液体培养基上以有机含硫化合物如二甲基亚砜(DMSO)或噻吩类化合物作为唯一硫源生长，也可以在LB培养基上生长。
上述的兼性嗜热古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142可在30～50℃下专一性脱除二苯并噻吩、二苯并噻吩衍生物中的硫，不破坏碳架，保留了燃烧值。
其中，上述的二苯并噻吩衍生物为4，6-二甲基-二苯并噻吩、DBT-砜、4-甲基-二苯并噻吩之一。
本发明所述的兼性嗜热古地分枝杆菌在原油脱硫中的应用，其脱硫方法涉及的步骤顺序如下(1)菌种选择选用兼性嗜热古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142；(2)斜面培养将菌种接种于含有质量体积比为1.5～2.0％的琼脂并加有0.5～2.0mmol/L的二甲基亚砜(DMSO)的固体斜面MAM培养基上，25～50℃条件下，静止培养36～60小时；(3)种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于100ml含有0.5～2.0mmol/L的二甲基亚砜(DMSO)的液体MAM培养基中，25～50℃条件下，振荡培养12～24小时，制得种子液；(4)扩大培养以5～10％的体积比的接种量，将种子液接种于1000ml含有0.5～2.0mmol/L的二甲基亚砜(DMSO)液体MAM培养基中，25～50℃条件下，振荡培养12～24小时；(5)生物催化剂制备取步骤(4)所得的培养液，4,000～5,000转/分钟离心10～20分钟，收集沉淀细胞，使用100mmol/L，pH7.0磷酸缓冲液重悬细胞，再以相同的条件离心，重复2～3次，收集沉淀细胞，并重悬于此磷酸缓冲液中，使菌体浓度达到9～18克干细胞/升，即为制备好的古地分枝杆菌休止细胞悬浊液，也称生物催化剂；(6)处理样品在反应体系中(100～1000ml)，以步骤(5)所得的休止细胞悬浊液作为水相，加入原油，使原油与水相的体积比为1∶10～20，在30～45℃条件下，180转/每分钟振荡50～72小时，进行样品处理；(7)分离样品以10,000转/分钟离心5～10分钟分离步骤(6)中处理后的样品，得到上层原油样品；(8)样品检测取1～5μl步骤(7)中的原油样品，使用硫氮元素分析仪测定原油中残留的硫含量，然后对照未处理的样品硫含量，得出经所述兼性嗜热古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142处理原油的脱硫率。
在上述的脱硫方法涉及的步骤中，步骤(2)、(3)、(4)中所述的菌体培养温度优选是40～50℃；二甲基亚砜(DMSO)的浓度优选为1.0～1.5mmol/L。
在上述的脱硫方法涉及的步骤中，步骤(3)、(4)中所述的菌体培养时间优选是16～18小时。
在上述的脱硫方法涉及的步骤中，步骤(5)中所述的生物催化剂的菌体浓度优选是12～18克干细胞/升。
在上述的脱硫方法涉及的步骤中，步骤(6)中所述的原油与水相的体积比例优选为1∶15～20，处理样品的温度优选为40～45℃，样品振荡时间优选为60～72小时。
在上述利用古地分枝杆菌休止细胞高温脱除原油中有机硫的方法中，菌株培养使用液体MAM培养基(modification of A Medium MAM)，配方为葡萄糖10g/L；0.5g/KH2PO4；4g/L升K2HPO4；1g/L NH4Cl；质量百分比浓度为1％的CaCl22ml/L；质量百分比浓度为10％的MgCl2·6H2O 2ml/L；质量百分比浓度为1％的FeCl3200μl/L；质量百分比浓度为5％的NaCl 200μl/L；质量百分比浓度为1％的酵母浸膏5ml/L；维生素混合液200μl/L；金属离子混合液5ml/L，115℃灭菌20分钟。
上述固体斜面基本无机盐培养基为上述液体无机盐培养基成分添加质量体积百分比浓度为1.6％的琼脂粉。
上述的金属离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O 0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl120mmol。
上述的维生素混合液的配方为，每升蒸馏水含有400mg泛酸钙(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/烟酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
上述LB培养基配方如下，1L蒸馏水中含10g蛋白胨，5g酵母粉，10g NaCl，固体LB培养基在上述配方的基础上加入质量体积比为1.6％的琼脂粉，121℃条件下灭菌20分钟。
利用本发明所述的古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142可以在高温下有效降解二苯并噻吩(DBT)及其甲基衍生物，上述古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142降解二苯并噻吩中间产物和终产物的质谱图请参见说明书附图(图1、图2、图3、图4)。上述古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142尤其可以脱除以二苯并噻吩(DBT)为代表的有机含硫化合物中的硫元素。在脱除以二苯并噻吩(DBT)为代表的一大类化石燃料中的含硫化合物时，专一性的攻击C-S键，对C-C键不起作用，保留了化合物的碳架结构。
本发明采用古地分枝杆菌休止细胞作为生物催化剂，能够有效地在高温条件下脱除原油中的含硫有机化合物。
例如使用GC-PFPD(气相色谱-脉冲式火焰光度检测器)测定休止细胞处理前后的原油中的含硫化合物的变化。总硫含量使用Antek 7000硫氮元素分析仪(美国，Antek公司产品)进行分析测定，总硫含量测定为3,600ppm。在40℃条件下，使用本发明所述的古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142休止细胞可将硫含量为3,600ppm的原油中的硫含量降低到1,478ppm，脱除率达到了58.9％。
参见说明书附图，图5所示的是经过休止细胞处理之后，GC-PFPD测定原油中的含硫化合物的分布情况，此时总硫含量为1,478ppm。经处理前后含硫化合物的比较，可以明显看出经过休止细胞处理之后，原油中的大部分可检测到的含硫化合物，如噻吩类，二苯并噻吩类及更加复杂的含硫化合物都基本脱除，起到了很好的脱硫效果。
根据文献和专利检索，虽然Setti等人1992年报道采用一株能降解烷烃的假单胞菌降解重油中的硫化合物，但是脱硫的过程造成了烷烃的损失。Fedorak等人在1984年采用混合菌处理原油，也造成了烷烃的损失。对生物脱硫模式菌株红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)ATCC 53968也进行了原油脱硫的试验，但是发现处理前后对原油总硫含量没有明显的变化，即没有明显的脱硫效果。
本发明的古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142是一个耐温的专一性降解含硫化合物的菌，不损失燃烧值。处理原油结果发现在较高温度下有明显的脱硫效果，因此，本菌株具有重要的实际应用价值。


本发明提供的一株兼性嗜热古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)，于2005年12月5日保藏于中国典型微生物菌种保藏中心，保藏地址湖北省武汉市武汉大学，邮政编码430072，其保藏编号为CCTCC NO.M 205142。
图1使用气相-质谱联用技术分析模式化合物DBT的结构。
图2使用气相-质谱联用技术分析古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCCNO.M 205142降解模式化合物DBT中间产物二苯并噻吩结构。
图3使用气相-质谱联用技术分析古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCCNO.M 205142降解模式化合物DBT中间产物2-羟基联苯结构。
图4使用气相-质谱联用技术分析古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCCNO.M 205142降解模式化合物DBT终产物2-甲氧基联苯。
图5使用GC-PFPD检测休止细胞处理原油前后，原油中的含硫化合物的变化。
其中空白是古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142处理原油之前的原油含硫化合物的色谱图，样品是古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142处理之后的原油含硫化合物的色谱图。
具体实施例方式
实施例1古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142菌株的筛选从齐鲁石化，济南炼油厂，胜利油田等地附近石油污染处采取土样及含油废水，按照土样3～5g，水样10％比例，加入到含0.5mmol/L二苯并噻吩的50ml MAM液体培养基中，在45℃培养2～3天，转接4～5次，在254nm紫外线下照射，观测菌种产生荧光的情况，同时用Gibbs试剂及GC，HPLC方法确认有无终产物2-HBP的产生。5次转接后，进行Gibbs试剂反应，选取阳性结果。使用生理盐水稀释涂布于MAMD固体平板。通过反复划线和培养，终于获得一株在45℃具有脱硫活力的细菌，经过常规活力测定表明该菌株具有非常高的稳定性，连续培养后降解二苯并噻吩的能力没有降低。
该菌株为轻微弯曲杆菌，大小为0.3～0.5×2.0～3.0μm。该菌株好氧，不运动，无孢子，过氧化物酶阳性，氧化酶阴性，硝酸盐还原阳性，酸染色不着色，革兰氏染色阳性。菌株细胞壁含有谷氨酸，丙氨酸，消旋二氨基庚二酸。主要的细胞壁糖成分为阿拉伯糖，半乳糖。该菌株可以在麦康凯培养基中生长，不产生结晶紫，能抗5％的NaCl。能够利用阿拉伯糖，葡萄糖，果糖，半乳糖，甘露糖，纤维糖，甘露醇，鼠李糖，木糖，棉子糖等为唯一碳源生长，部分利用柠檬酸，乳糖。
该菌株鉴定为古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)，定名为Mycobacterium goodiiX7B，已于2005年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.M 205142。
上述菌株培养使用液体MAM培养基(modification of A Medium)，配方为葡萄糖10g/L；0.5g/L KH2PO4；4g/L升K2HPO4；1g/L NH4Cl；质量百分比浓度为1％的CaCl22ml/L；质量百分比浓度为10％的MgCl2·6H2O 2ml/L；质量百分比浓度为1％的FeCl3200μl/L；质量百分比浓度为5％的NaCl 200μl/L；质量百分比浓度为1％的酵母浸膏5ml/L；维生素混合液200μl/L；金属离子混合液5ml/L，115℃湿热灭菌20分钟。
上述固体斜面基本无机盐培养基为上述液体无机盐培养基成分添加质量体积百分比浓度为1.6％的琼脂粉。
上述的金属离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O 0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl120mmol。
上述的维生素混合液的配方为，每升蒸馏水含有400mg泛酸钙(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/烟酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
实施例2上述古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142菌株16SrDNA基因的提取取生长到稳定期的古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142的菌体10ml，5,000转/分钟离心5分钟收集菌体，去上清加入250μl溶液I(质量百分比浓度25％蔗糖/50mmol/L Tris-HCl，pH8.0/50mmol/L EDTA)，再加入500μg/ml的溶菌酶，37℃水浴振荡过夜；加入250μl溶液II(100mmol/L Tris-HCl，pH8.0质量百分比浓度0.1％SDS)加入终浓度为0.4mg/ml的蛋白酶K(Merck，USA)，55℃水浴振荡4小时；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，12,000转/分钟离心5分钟，将上清转入一支新管中；加入等体积的氯仿/异戊醇，混匀，12,000转/分钟离心5分钟，将上清液转入一个新管中；加入2倍体积的预冷的无水乙醇沉淀DNA 1小时，12,000转/分钟离心5分钟，弃上清，用70％乙醇洗涤；12,000转/分钟离心5分钟，弃上清，室温干燥10分钟，加入100μl TE缓冲液〖10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1mmol/L的乙二胺四乙酸(EDTA)、用盐酸调整pH为8.0〗。以提取的基因组DNA为模板，利用真细菌引物27f和1492r，进行PCR扩增，在50μl反应体系依次混匀下列试剂38μlH2O，5μl 10倍浓度的PCR反应缓冲液，10倍浓度的PCR反应缓冲液配方如下500mmol/L的KCl、30mmol/L的二硫苏糖醇(DTT)、100mmol/L的用盐酸调整pH为8.8的Tris缓冲液、1mg/ml的牛血清白蛋白，4μl 25mmol/L MgCl2，1μl 4种dNTP的混合物，0.5μl上游引物，0.5μl下游引物，0.5μl模板DNA即上述古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142的基因组DNA，0.5μl Taq DNA聚合酶，混匀后离心5秒钟。加入50μl矿物油再离心5秒钟；将混合物在94℃加热5分钟。94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，总共30个循环。最后一个循环后，于72℃下保温10分钟，使反应混合物扩增充分，得到古地分枝杆菌(Mycobacteriumgoodii)CCTCC NO.M 205142的16S rDNA的PCR扩增产物，将产物测序。
测序结果古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142的16SrDNA基因序列长度为1,384bp，核苷酸序列如下acatgcaagt cgaacggaaa ggcccttcgg ggtgctcgag tggcgaacgg gtgagtaaca 60cgtgggtgat ctgccctgca ctttgggata agcctgggaa actgggtcta ataccgaata 120taccctgctg gtcgcatggc ctggtggggg aaagcttttg cggtgtggga tgggcccgcg 180gcctatcagc ttgttggtgg ggtgatggcc taccaaggcg acgacgggta gccggcctga 240gagggtgacc ggccacactg ggactgagat acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt 300
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(8)样品检测取5μl步骤(7)中的原油样品，使用硫氮元素分析仪测定原油中残留的硫含量，然后对照未处理的样品硫含量，得出经古地分枝杆菌(Mycobacteriumgoodii)CCTCC NO.M 205142处理的原油脱除率为40.5％。
在上述利用古地分枝杆菌休止细胞高温脱除原油中有机硫的方法中，菌株培养使用液体MAM培养基(modification of A Medium MAM)，配方为葡萄糖10g/L；0.5g/KH2PO4；4g/L升K2HPO4；1g/L NH4Cl；质量百分比浓度为1％的CaCl22ml/L；质量百分比浓度为10％的MgCl2·6H2O 2ml/L；质量百分比浓度为1％的FeCl3200μl/L；质量百分比浓度为5％的NaCl 200μl/L；质量百分比浓度为1％的酵母浸膏5ml/L；维生素混合液200μl/L；金属离子混合液5ml/L，115℃湿热灭菌20分钟。
上述固体斜面基本无机盐培养基为上述液体无机盐培养基成分添加质量体积百分比浓度为1.6％的琼脂粉。
上述的离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol。
上述的维生素混合液的配方为，每升蒸馏水含有400mg泛酸钙(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/烟酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
实施例4利用古地分枝杆菌休止细胞脱除原油中有机硫的方法，其中加入的原油与水相的体积比为1∶20，处理温度为40℃(1)菌种选择选用古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142；(2)斜面培养将菌种接种于含有质量体积比为1.6％的琼脂并加有1.0mmol/L的二甲基亚砜(DMSO)的固体斜面MAM培养基上，45℃条件下，静止培养48小时；(3)种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于100ml含有1.0mmol/L的二甲基亚砜(DMSO)的液体MAM培养基中，45℃条件下，振荡培养16小时，制得种子液；(4)扩大培养以9％的体积比的接种量，将种子液接种于1000ml含有1.0mmol/L的二甲基亚砜(DMSO)液体MAM培养基中，45℃条件下，振荡培养16小时；(5)生物催化剂制备取步骤(4)所得的培养液5,000转/分钟离心10分钟，收集沉淀细胞，使用100mmol/L，pH7.0磷酸缓冲液重悬细胞，再以相同的条件离心，重复2～3次，收集沉淀细胞，并重悬于此磷酸缓冲液中，使菌体浓度达到12克干细胞/升，即为制备好的古地分枝杆菌休止细胞悬浊液，即生物催化剂；(6)处理样品在反应体系中(800ml)，以步骤(5)所得的休止细胞悬浊液作为水相，加入原油，使原油与水相的体积比为1∶20，在40℃条件下，180转/分钟振荡72小时，进行样品处理；(7)分离样品以10,000转/分钟离心8分钟分离步骤(6)中处理后的样品，得到上层原油样品；(8)样品检测取3μl步骤(7)中的原油样品，使用硫氮元素分析仪测定原油中残留的硫含量，然后对照未处理的样品硫含量，得出经古地分枝杆菌(Mycobacteriumgoodii)CCTCC NO.M 205142处理的原油脱除率为58.9％。
在上述利用古地分枝杆菌休止细胞高温脱除原油中有机硫的方法中，菌株培养使用液体MAM培养基(modification of A Medium MAM)，配方为葡萄糖10g/L；0.5g/L KH2PO4；4g/L升K2HPO4；1g/L NH4Cl；质量百分比浓度为1％的CaCl22ml/L；质量百分比浓度为10％的MgCl2·6H2O 2ml/L；质量百分比浓度为1％的FeCl3200μl/L；质量百分比浓度为5％的NaCl 200μl/L；质量百分比浓度为1％的酵母浸膏5ml/L；维生素混合液200μl/L；金属离子混合液5ml/L，115℃湿热灭菌20分钟。
上述固体斜面基本无机盐培养基为上述液体无机盐培养基成分添加质量体积百分比浓度为1.6％的琼脂粉。
上述的离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol。
上述的维生素混合液的配方为，每升蒸馏水含有400mg泛酸钙(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/烟酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
实施例5利用古地分枝杆菌休止细胞脱除原油中有机硫的方法，其中加入的原油与水相的体积比为1∶15，处理温度为45℃(1)菌种选择选用古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142；(2)斜面培养将菌种接种于含有质量体积比为1.6％的琼脂并加有2.0mmol/L的二甲基亚砜(DMSO)的固体斜面MAM培养基上，50℃条件下，静止培养36小时；(3)种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于100ml含有2.0mmol/L的二甲基亚砜(DMSO)的液体MAM培养基中，50℃条件下，振荡培养12小时，制得种子液；(4)扩大培养以7％的体积比的接种量，将种子液接种于1000ml含有2.0mmol/L的二甲基亚砜(DMSO)液体MAM培养基中，50℃条件下，振荡培养12小时；(5)生物催化剂制备取步骤(4)所得的培养液5,000转/分钟离心10分钟，收集沉淀细胞，使用100mmol/L，pH7.0磷酸缓冲液重悬细胞，再以相同的条件离心，重复2～3次，收集沉淀细胞，并重悬于此磷酸缓冲液中，使菌体浓度达到9克干细胞/升，即为制备好的古地分枝杆菌休止细胞悬浊液，即生物催化剂；(6)处理样品在反应体系中(600ml)，以步骤(5)所得的休止细胞悬浊液作为水相，加入原油，使原油与水相的体积比为1∶15，在45℃条件下，180转/分钟振荡60小时，进行样品处理；(7)分离样品以10,000转/分钟离心7分钟分离步骤(6)中处理后的样品，得到上层原油样品；(8)样品检测取4μl步骤(7)中的原油样品，使用硫氮元素分析仪测定原油中残留的硫含量，然后对照未处理的样品硫含量，得出经古地分枝杆菌(Mycobacteriumgoodii)CCTCC NO.M 205142处理的原油脱除率为32.6％。
在上述利用古地分枝杆菌休止细胞高温脱除原油中有机硫的方法中，菌株培养使用液体MAM培养基(modification of A Medium MAM)，配方为葡萄糖10g/L；0.5g/L KH2PO4；4g/L升K2HPO4；1g/L NH4Cl；质量百分比浓度为1％的CaCl22ml/L；质量百分比浓度为10％的MgCl2·6H2O 2ml/L；质量百分比浓度为1％的FeCl3200μl/L；质量百分比浓度为5％的NaCl 200μl/L；质量百分比浓度为1％的酵母浸膏5ml/L；维生素混合液200μl/L；金属离子混合液5ml/L，115℃灭菌20分钟。
上述固体斜面基本无机盐培养基为上述液体无机盐培养基成分添加质量体积百分比浓度为1.6％的琼脂粉。
上述的离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol。
上述的维生素混合液的配方为，每升蒸馏水含有400mg泛酸钙(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/烟酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
实施例6利用红平红球菌ATCC 53968休止细胞脱除原油中有机硫的方法，其中加入的原油与水相的体积比为1∶20，处理温度为40℃；(1)菌种选择红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)ATCC 53968〖该菌株保藏于美国典型微生物收藏中心(12301 Park Lawn Drive，Rockville，Md.20852)〗；(2)斜面培养将菌种接种于含有质量体积比为1.6％的琼脂并加有1.0mmol/L二甲基亚砜(DMSO)的固体斜面无机盐基本培养基上，30℃条件下，静止培养42小时；(3)种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接2环于100ml含有1.0mmol/L二甲基亚砜(DMSO)的液体无机盐基本培养基中，30℃条件下，振荡培养42小时，制得种子液；(4)扩大培养以10％的体积比的接种量，将种子液接种于100ml含有1.0mmol/L二甲基亚砜(DMSO)液体无机盐基本培养基中30℃条件下，振荡培养36小时；(5)生物催化剂的制备取步骤(4)所得的培养液5,000转每分钟离心15分钟，收集沉淀细胞，使用100mmol/L，pH7.0磷酸缓冲液重悬细胞，再以相同的条件离心，重复2次，收集沉淀细胞，并重悬于pH7.0磷酸缓冲液，使菌体浓度达到18克干细胞/升。此细胞悬浊液即为制备好的红平红球菌休止细胞，也称生物催化剂；(6)处理样品在300ml的反应体系中，以步骤(5)所得的休止细胞悬浊液作为水相，加入原油，使原油与水相的体积比为1∶20，在40℃条件下，180转/分钟振荡72小时，进行样品处理；(7)分离样品以10,000转/分钟离心10分钟分离步骤(6)中处理后的样品，得到上层原油样品；(8)样品检测取3μl步骤(7)中的原油样品，使用Antek7000硫氮元素分析仪(美国，Antek公司产品)测定原油中残留的硫含量。对照未处理的样品硫含量，得出原油脱除率为8.5％。
在上述利用红平红球菌休止细胞脱除原油中有机硫的方法中，菌株培养使用液体基本无机盐培养基(Basal Salts Medium，BSM)，配方为甘油4g/L，KH2PO42.44g/L，Na2HPO414.04g/L，NH4Cl 2g/，质量百分比为1％的CaCl2100μl/L，质量百分比为10％的MgCl2·6H2O 2ml/L，质量百分比为1％的FeCl3100μl/L，维生素混合液200ml/L，离子混合液5ml/L。121℃湿热灭菌20分钟。
上述固体基本无机盐斜面培养基为上述液体无机盐培养基成分添加质量体积百分比1.6％的琼脂粉。
上述的离子混合液的配方为，每升蒸馏水含有ZnCl20.5g；FeCl20.5g；MnCl2·4H2O0.5g；Na2MoO4·2H2O 0.1g；CuCl2·2H2O 0.05g；Na2WO4·2H2O 0.05g；HCl 120mmol。
上面所述的维生素混合物的配方为，每升蒸馏水含有400mg泛酸钙(Calciumpantothenate)；200mg肌醇(Inositol)；400mg尼克酸/烟酸(Niacin)；400mg VB6(Pyridoxine hydrochloride)；200mg对氨基苯甲酸(p-aminobenzoic acid)；0.5mg VB12(Cyanocobalamin)。
通过实施4与实施例6的对比可以看到，古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142在40℃、油水比为1∶20条件下，对原油的总硫含量达到58.9％的脱除率；脱硫率明显高于红平红球菌(Rhodococcus erythropolis)ATCC 53968。说明上述的古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142在较高温度下具有很好的处理效果，具有很高的实际应用价值。
序列表SEQ ID NO.1<110>山东大学<120>一株应用于原油脱硫的兼性嗜热古地分枝杆菌<141>2006-03-07<211>1384<212>DNA<213>古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)<221>古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M205142 16S rDNA<222>(1)…(1384)<400>
acatgcaagt cgaacggaaa ggcccttcgg ggtgctcgag tggcgaacgg gtgagtaaca 60cgtgggtgat ctgccctgca ctttgggata agcctgggaa actgggtcta ataccgaata 120taccctgctg gtcgcatggc ctggtggggg aaagcttttg cggtgtggga tgggcccgcg 180gcctatcagc ttgttggtgg ggtgatggcc taccaaggcg acgacgggta gccggcctga 240gagggtgacc ggccacactg ggactgagat acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt 300ggggaatatt gcacaatggg cgcaagcctg atgcagcgac gccgcgtgag ggatgacggc 360cttcgggttg taaacctctt tcagcacaga cgaagcgtaa gtgacggtat gtgcagaaga 420aggaccggcc aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt agggtccgag cgttgtccgg 480aattactggg cgtaaagagc tcgtaggtgg tttgtcgcgt tgttcgtgaa aactcacagc 540ttaactgtgg gcgtgcgggc gatacgggca gactagagta ctgcagggga gactggaatt 600cctggtgtag cggtggaatg cgcagatatc aggaggaaca ccggtggcga aggcgggtct 660ctgggcagta actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct 720ggtagtccac gccgtaaacg gtgggtacta ggtgtgggtt tccttccttg ggatccgtgc 780cgtagctaac gcattaagta ccccgcctgg ggagtacggc cgcaaggcta aaactcaaag 840gaattgacgg gggcccgcac aagcggcgga gcatgtggat taattcgatg caacgcgaag 900aaccttacct gggtttgaca tgcacaggac gcccgtagag atatgggttc ccttgtggcc 960tgtgtgcagg tggtgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc 1020gcaacgagcg caacccttgt ctcatgttgc cagcacgtga tggtggggac tcgtgagaga 1080ctgccggggt caactcggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcatcatgc cccttatgtc 1140cagggcttca cacatgctac aatggccggt acaaagggct gcgatgccgt gaggtggagc 1200gaatcctttc aaagccggtc tcagttcgga tcggggtctg caactcgacc ccgtgaagtc 1260ggagtcgcta gtaatcgcag atcagcaacg ctgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac 1320acaccgcccg tcacgtcatg aaagtcggta acacccgaag ccggtggcct aaccccttgt 1380ggga 138权利要求
1.一株应用于原油脱硫的兼性嗜热古地分枝杆菌，其特征在于该菌名为古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)，已于2005年12月5日保藏于中国典型微生物菌种保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO.M 205142。
2.如权利要求1所述的兼性嗜热古地分枝杆菌，其特征是所述兼性嗜热古地分枝杆菌为弯曲杆状菌，大小为0.3～0.5×2.0～3.0μm，生长初期菌落为乳白色，渐变为黄色，菌株好氧，不运动，无孢子，过氧化物酶阳性，氧化酶阴性，硝酸盐还原阳性，酸染色不着色，革兰氏染色阳性；菌株细胞壁含有谷氨酸，丙氨酸，消旋二氨基庚二酸；主要的细胞壁糖成分为阿拉伯糖，半乳糖；所述兼性嗜热古地分枝杆菌的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。
3.如权利要求1或2中所述的兼性嗜热古地分枝杆菌，其特征在于所述的兼性嗜热古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142可在30～50℃下专-性脱除二苯并噻吩、二苯并噻吩衍生物中的硫，不破坏碳架，保留了燃烧值。
4.如权利要求3所述的兼性嗜热古地分枝杆菌，其特征在于，所述的二苯并噻吩衍生物为4，6-二甲基-二苯并噻吩、DBT-砜、4-甲基-二苯并噻吩之一。
5.权利要求1或2所述的兼性嗜热古地分枝杆菌在原油脱硫中的应用。
6.如权利要求5所述的兼性嗜热古地分枝杆菌在原油脱硫中的应用，其脱硫方法涉及的步骤顺序如下(1)菌种选择选用兼性嗜热古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142；(2)斜面培养将菌种接种于含有质量体积比为1.5～2.0％的琼脂并加有0.5～2.0mmol/L的二甲基亚砜(DMSO)的固体斜面MAM培养基上，25～50℃条件下，静止培养36～60小时；(3)种子培养将步骤(2)培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环于100ml含有0.5～2.0mmol/L的二甲基亚砜(DMSO)的液体MAM培养基中，25～50℃条件下，振荡培养12～24小时，制得种子液；(4)扩大培养以5～10％的体积比的接种量，将种子液接种于1000ml含有0.5～2.0mmol/L的二甲基亚砜(DMSO)液体MAM培养基中，25～50℃条件下，振荡培养12～24小时；(5)生物催化剂制备取步骤(4)所得的培养液4,000～5,000转/分钟离心10～20分钟，收集沉淀细胞，使用100mmol/L，pH 7.0磷酸缓冲液重悬细胞，再以相同的条件离心，重复2～3次，收集沉淀细胞，并重悬于此磷酸缓冲液中，使菌体浓度达到9～18克干细胞/升，即为制备好的古地分枝杆菌休止细胞悬浊液，也称生物催化剂；(6)处理样品在反应体系中，以步骤(5)所得的休止细胞悬浊液作为水相，加入原油，使原油与水相的体积比为1∶10～20，在30～45℃条件下，180转/分钟振荡50～72小时，进行样品处理；(7)分离样品以10,000转/分钟离心5～10分钟分离步骤(6)中处理后的样品，得到上层原油样品；(8)样品检测取1～5μl步骤(7)中的原油样品，使用硫氮元素分析仪测定原油中残留的硫含量，然后对照未处理的样品硫含量，得出经所述兼性嗜热古地分枝杆菌(Mycobacterium goodii)CCTCC NO.M 205142处理原油的脱硫率。
7.如权利要求5所述的兼性嗜热古地分枝杆菌在原油脱硫中的应用，其特征在于，步骤(2)、(3)、(4)中所述的菌体培养温度是40～50℃；二甲基亚砜(DMSO)的浓度为1.0～1.5mmol/L。
8.如权利要求5所述的兼性嗜热古地分枝杆菌在原油脱硫中的应用，其特征在于，步骤(3)、(4)中所述的菌体培养时间是16～18小时。
9.如权利要求5所述的兼性嗜热古地分枝杆菌在原油脱硫中的应用，其特征在于，步骤(5)中所述的生物催化剂的菌体浓度是12～18克干细胞/升。
10.如权利要求5所述的兼性嗜热古地分枝杆菌在原油脱硫中的应用，其特征在于，步骤(6)中所述的原油与水相的体积比例为1∶15～20，处理样品的温度为40～45℃，样品振荡时间为60～72小时。
全文摘要
本发明公开了一株应用于原油脱硫的兼性嗜热古地分枝杆菌，该菌株于2005年12月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学，中国武汉)，保藏中心编号为CCTCC NO.M 205142。该菌株为弯曲杆状菌，好氧，不运动，无孢子，过氧化物酶阳性，氧化酶阴性，硝酸盐还原阳性，酸染色不着色，革兰氏染色阳性；所述菌具有嗜热、脱硫率高等特点，可以在30～45℃下脱除原油中的硫，40℃条件下，脱硫率达到58.9％。在石油炼制及大气污染治理方面具有很大的应用前景。
文档编号C12S1/00GK1858204SQ20061004444
公开日2006年11月8日 申请日期2006年3月10日 优先权日2006年3月10日
发明者许平, 李福利, 马翠卿, 张正芝, 冯进辉, 于波 申请人:山东大学