专利名称：大气压冷等离子体诱变微生物的方法
技术领域：
本发明属于微生物诱变技术领域，特别涉及利用大气压冷等离子体诱变微生物的方法。
背景技术：
微生物育种对微生物工业的发展起了极为重要的推动作用。大量研究和生产实践表明，诱变育种可克服常规育种周期长、进程慢、难以获得突变性变异品种的缺点，可在创造微生物新菌种、新材料和解决育种工作中某些特殊问题取得突破和快速发展。微生物育种所取得的成就，将导致微生物工业发展的飞跃。
到目前为止，微生物育种仍是以使用化学诱变、物理诱变或两者复合诱变的诱变育种作为最主要的方法。化学诱变剂，如羟胺、亚硝基胍、吖啶类、亚硝酸等，这些诱变剂优点在于具有专一性，对基因的某部位发生作用，对其余部位则无影响。但是绝大部分化学诱变剂都具有毒性，其中90％以上是致癌物质或极毒药品，对人体及环境均有危害，使用时须谨慎。物理诱变通常使用辐射诱变技术，如激光诱变技术、Co60诱变技术、太空诱变技术以及近年兴起的离子注入诱变技术等，激光诱变的后代变异少、效果差；Co60诱变的后代变异大、但可操作性差，后代难以稳定；太空诱变的后代变异类型多，但成本高，处理的品种类型和数量受严重限制；离子注入诱变最早用于农业育种，目前在微生物育种上也取得一定进展，但它要求处理样品必须是干燥的，水分起到能量反射和屏蔽作用，影响离子注入的诱变效果，不利于诱变。此外，离子注入的靶室要求一定的真空度，这些都制约了离子注入在工业微生物育种上的应用。专利(CN 1478892A)报道用等离子体环境改性微生物，但该专利中使用的是真空高压放电等离子体，处理对象只针对酵母菌，而且处理时间较长，数小时至数百小时。
等离子体是由大量相互作用的但仍处于非束缚状态下的带电粒子组成的宏观体系，是和固态、液态、气态处于同一层次的物质第四态，自然界的物质主要以这些状态出现。这里的等离子体主要是指大气压冷等离子体，它是一种低温非平衡等离子体，由于它可以在大气压或高于大气压的条件下产生，不需要真空设备就能在较低的温度下获得化学反应所需的活性粒子，具有特殊的光、热、声、电等物理过程及化学过程，已经在臭氧合成、紫外光源、高功率CO2激光器等领域获得了广泛的应用。目前国内外的很多研究表明，等离子体灭菌技术是很好的物理灭菌方法，它具有快速、低温、操作简便、无毒性以及杀灭效果好等优点。而把大气压冷等离子体应用于菌种的选育方面，则未见专利和文献报道。据文献报道，大气压介质阻挡放电过程是一种物理和化学相结合的过程，物理过程主要可产生紫外射线，化学过程可产生新物质，如O3，N2O4，H2O2，HNO3，HNO2和HO2NO2，属于一种复合型的诱变剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种有效的微生物诱变育种技术。解决了传统的物理诱变和化学诱变过程中，设备造价高、污染环境、损害人体健康，诱变效率低、诱变周期长、成本高等问题，可望为工业微生物育种提供一种可行高效的微生物诱变新技术。
本发明提供了一种有效的微生物诱变育种的新技术，首先采用大气压冷等离子体诱变微生物，可诱变菌悬液也可诱变固体平板上的菌细胞，然后将诱变过的菌悬液摇瓶培养后接到筛选培养基上培养，最后挑取单一菌落摇瓶培养，或直接将诱变平板上的菌细胞培养后，挑取单一菌落摇瓶培养，检测代谢产物的浓度。
实现本发明方法的步骤如下1、细胞培养1)培养基的制备培养基中必须具备微生物生长所需的营养成分，如葡萄糖或甘油等碳源，尿素、蛋白胨、铵盐、酵母浸膏或酵母粉等氮源以及磷酸盐(磷源)和硫酸盐(硫源)等。另外还需要钠、钾、镁、钙等阳离子以及锌、铁、锰、铜、钴、硼和钼等微量元素，每种微量元素的含量大约在0.01mg/L～50mg/L的范围内。培养基须在115～121℃下灭菌15～20分钟方能使用。
2)培养条件在摇瓶中进行，接种量为0.5～2％，摇床转速为100～300r/min，温度为27～40℃，培养时间为9～30h。
2、菌种预处理菌种以0.5～2％接种量接入种子培养液中，在27～40℃，100～300r/min条件下摇床培养至对数期，一是将菌液在无菌条件下8000～10000r/min，0～4℃，离心20～30min，沉淀用0.05M、pH 7.0的磷酸钾缓冲液洗涤两次后，再离心，将沉淀制成菌悬液，菌悬液中菌体干重为0.1～2g/L；二是将培养至对数期的菌液稀释至10-4～10-6倍，取50～100μL均匀涂布于固体平板上。
3、菌种诱变用于诱变的等离子体是大气压介质阻挡放电冷等离子体，电极介质是石英玻璃，放电气体采用空气、氮气或氦气，外加电压1～100kV，频率0～15MHz，诱变时间从10s～10min，诱变对象是菌悬液或平板上的菌细胞。
4、菌种分离和筛选将诱变过的菌悬液摇瓶培养后，分别涂布于梯度筛选平板上避光培养；或直接将平板诱变菌避光培养，如克雷伯氏菌的筛选培养基分为甘油梯度(含甘油质量比2％～10％)培养基，1，3-丙二醇梯度(含1，3-PD质量比4％～9％)培养基，以及显色培养基(含刚果红质量比1％～3％)；酿酒酵母的筛选培养基分为葡萄糖梯度(含葡萄糖质量比3％～30％)培养基和乙醇梯度(乙醇体积比10％～18％)培养基。
5、摇瓶培养和产物测定挑选耐受高浓度底物和产物的单菌落进行摇瓶培养，气相色谱或液相色谱检测产物浓度。
本发明方法的优点和益处在于充分发挥了大气压冷等离子体在放电过程中的物理及化学效应，通过复合诱变菌种，提高了诱变效率，缩短了诱变时间，并且实验操作简单、安全、无污染，实验成本低，为工业微生物的诱变育种奠定了基础。
具体实施例方式
以下结合技术方案详细叙述本发明的具体实施例。
原核微生物以克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)为实验材料，真核微生物以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为实验材料。
实施例一菌悬液诱变克雷伯氏菌1)实验菌种为克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，是一种兼性厌氧菌。购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，菌种保藏号是1.1736。
培养基成分如下(1L)甘油20g K2HPO4·3H2O4.454gKH2PO41.3g (NH4)2SO42.0gMgSO4·7H2O0.2g酵母粉1.0g
CaCO32.0g 微量元素2mL2％CaCl2溶液1mL 0.5％FeSO4溶液1mL微量元素组成(1L)饱和盐酸0.9mL ZnCl270mgMnCl2·4H2O100mgH3BO360mgCoCl2·6H2O200mgNiCl2·6H2O25mgNaMoO4·2H2O35mgCuCl2·2H2O20mg2)菌种预处理菌种以1％接种量接入种子培养液中，在37℃，150r/min条件下摇床培养至对数期，将菌液在无菌条件下8000r/min，0℃，离心30min，沉淀用0.05M、pH 7.0的磷酸钾缓冲液洗涤两次后，再离心，将沉淀制成菌悬液，菌悬液OD值为2.7。
3)菌种诱变大气压介质阻挡放电冷等离子体两个平板电极的距离为3mm，放电气体采用空气，外加电压13kV，频率7kHz，诱变时间30s～5min，每次处理的菌液量为3mL。
4)发酵过程将诱变的菌液分别接250mL的三角瓶中，装液量为100mL，培养液含甘油2％，摇床转速为150r/min，培养温度为37℃，避光培养时间为12h。
经梯度筛选培养基分离和筛选，摇瓶培养，气相色谱检测结果如下等离子体处2min时，诱变菌株1，3-丙二醇产量为7.241g/L，比对照菌株(5.426g/L)提高33.45％；诱变菌株1，3-丙二醇的摩尔转化率较对照菌株提高31.83％。
实施例二平板诱变克雷伯氏菌
1)实验菌种、发酵过程及培养基同实施例一。
2)菌种预处理将实施例一的高产菌株经等离子体二次诱变4min后，以1％接种量接入种子培养液中，在37℃，150r/min条件下摇床培养至对数期，测其OD值为2.79，用0.05M、pH 7.0的磷酸钾缓冲液稀释菌液10-5倍后，取50μL菌悬液均匀涂布于含有8％甘油的固体培养基上，平板直径为6cm。
3)菌种诱变大气压介质阻挡放电冷等离子体两个平板电极的距离为3mm，放电气体采用空气，外加电压8kV，频率6kHz，诱变时间30s～150s。
4)诱变菌的培养将经第三次诱变的克雷伯氏菌避光培养，培养温度为37℃，培养时间为24h。
5)发酵过程将平板中的单一菌落分别接入250mL的三角瓶中，装液量为100mL，种子培养液含甘油8％，摇床转速为150r/min，培养温度为37℃，培养时间为24h。
经筛选和摇瓶培养，气相色谱检测结果如下等离子体处理时间在90s时，筛得一高产菌株，其1，3-丙二醇产量为26.36g/L，比未经诱变的菌株(7.24g/L)高出2.6倍；诱变菌株1，3-丙二醇的摩尔转化率较二次诱变菌株摩尔转化率提高17.22％，较未经诱变的菌株摩尔转化率提高39.96％。
实施例三菌悬液诱变酿酒酵母1)实验菌种为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，属真菌类，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，菌种保藏号为CICC 1001。
培养基成分如下(1L)葡萄糖30g；蛋白胨3g；酵母粉3.85g2)菌种预处理菌种首先进行一次活化即在无菌操作下，将酵母菌接种于葡萄糖-蛋白胨-酵母粉斜面固体培养基，于培养箱中28℃，培养24h；再进行二次活化即取活化一次的酵母菌一环接入250mL的三角烧瓶中，内装葡萄糖-蛋白胨-酵母粉液体培养基100mL，于28℃，150r/min培养24h；将菌液在无菌条件下8000r/min，0℃，离心30min，沉淀用0.05M、pH 7.0的磷酸钾缓冲液洗涤两次后，再离心，将沉淀制成菌悬液，其OD值为3.2。
3)菌种诱变将装有菌液的容器放入等离子体发生装置的腔室里，两个平板电极的距离为3mm，放电介质为空气，放电电压为1.3kV，频率7000Hz，放电时间1～5min，处理样品量为3mL。
4)发酵过程将诱变的菌液分别接入500mL的三角瓶中，装液量为200mL，培养液含葡萄糖3％，摇床转速为150r/min，温度28℃，摇床培养24h。
经梯度筛选培养基分离和筛选，摇瓶培养，气相色谱检测结果如下等离子体处理时间在3min时，诱变菌株乙醇含量为5.59g/L，比对照菌株(4.02g/L)提高39.05％；诱变菌株的乙醇摩尔转化率较对照菌株提高16.63％。
权利要求
1.一种大气压冷等离子体诱变微生物的方法，包括细胞培养、菌种预处理和菌种诱变，其特征是用于菌种诱变的是冷等离子体。
2.根据权利要求书1所述的一种大气压冷等离子体诱变微生物的方法，其特征是菌种分离和筛选采用如下步聚(1)菌种分离和筛选将诱变过的菌悬液摇瓶培养后，分别涂布于梯度筛选平板上避光培养；或直接将平板诱变菌避光培养，如克雷伯氏菌的筛选培养基分为甘油梯度(含甘油质量比2％～10％)培养基，1，3-丙二醇梯度(含1，3-PD质量比4％～9％)培养基，以及显色培养基(含刚果红质量比1％～3％)；酿酒酵母的筛选培养基分为葡萄糖梯度(含葡萄糖质量比3％～30％)培养基和乙醇梯度(乙醇体积比10％～18％)培养基；(2)摇瓶培养和产物测定挑选耐受高浓度底物和产物的单菌落进行摇瓶培养，气相色谱或液相色谱检测产物浓度。
3.根据权利要求书1所述的一种大气压冷等离子体诱变微生物的方法，其特征是诱变时间从10s～10min。
4.根据权利要求书1所述的一种大气压冷等离子体诱变微生物的方法，其特征是诱变对象是菌悬液或平板上的菌细胞。
5.根据权利要求1所述的一种大气压冷等离子体诱变微生物的方法，其特征是所述微生物是原核微生物或真核微生物。
6.根据权利要求1所述的一种大气压冷等离子体诱变微生物的方法，其特征是大气压冷等离子体处理微生物菌悬液的浓度范围是菌体干重0.1～2g/L.。
7.根据权利要求书1所述的一种大气压冷等离子体诱变微生物的方法，其特征是用于菌种诱变的是大气压冷等离子体。
8.根据权利要求书7所述的大气压冷等离子体，其特征是大气压冷等离子体产生条件为放电气体采用空气、氮气或氦气，外加电压1～100kV，频率0～15MHz。
全文摘要
本发明大气压冷等离子体诱变微生物的方法属于微生物诱变技术领域。本发明的特征在于将微生物菌种经冷等离子体诱变，以改变菌种的性质。所述微生物菌种是原核微生物或真核微生物，所述的大气压冷等离子体的放电介质可以是空气、氮气、氦气，放电时间10s～10min，外加电压1～100kV，频率0～15MHz，诱变的微生物可以是菌悬液，也可是固体平板上的菌细胞。本发明与其它的物理和化学诱变方法相比，大气压冷等离子体放电设备结构简单、系统造价低，操作安全，诱变效果远较传统的理化因子诱变效果好，在工业微生物育种中有较大的推广价值。
文档编号C12N13/00GK1888063SQ20061004721
公开日2007年1月3日 申请日期2006年7月14日 优先权日2006年7月14日
发明者修志龙, 董晓宇, 李爽, 侯英敏, 于红, 张代佳, 任春生 申请人:大连理工大学