专利名称：固定化细胞连续生产l－瓜氨酸的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCCNO.1866固定化细胞连续生产L-瓜氨酸的制备方法。
背景技术：
L-瓜氨酸作为一种非蛋白质氨基酸，近年来国外的众多研究表明，L-瓜氨酸具有很多重要的生理功能，如清除自由基，异体排斥效应指示剂，血管舒张作用，稳定血压以及诊断类风湿关节炎，抗氧化等，应用前景十分广阔。
当前生产L-瓜氨酸的方法有化学法、发酵法、酶法。化学法是指在碱性条件下水解L-精氨酸得L-瓜氨酸，水解过程控制比较困难，产品中含有旋光对映体D-瓜氨酸，影响产品质量，而且生产过程中产生大量废水，污染环境；发酵法生产的难点在于单位体积L-瓜氨酸产率低，从发酵液中提取L-瓜氨酸操作工艺复杂，收率低，成本高；酶法生产是指在精氨酸脱亚胺酶的作用下，L-精氨酸被转化为L-瓜氨酸，该法具有专一性强，产品浓度高的优点，但这种方法也存在以下几个问题(1)催化剂寿命短，作为催化剂的菌体细胞只能使用一次，即每一次生产后都得重新发酵，重新收集菌体，这不但需要消耗大量的原料，而且会产生大量的废水，污染环境；(2)产物杂质多，菌体细胞催化合成L-瓜氨酸后，反应液中有大量的菌体、蛋白和发酵液残留的各种金属离子等杂质，所以产物分离纯化要经过一系列的除菌体、除蛋白和离交柱等工艺步骤，过程操作复杂，成本高；(3)生产周期长、效率低，酶法生产是批式生产，工艺步骤多，操作复杂。
固定化微生物细胞(immobilized cells)技术是20世纪60年代发展起来的一门新兴生物技术，在化工、发酵生产、能源、医药等行业，实际应用效果显著。它是利用物理或化学的手段将游离微生物细胞定位于限定的空间区域，并使其保持活性反复利用的方法。固定化微生物细胞技术与传统的悬浮生物处理法相比，固定化细胞有提高单位体积的菌密度，菌体易回收，对环境的耐受力增强(如PH、温度、有机溶剂和有毒物质等)等优点，而且将菌体进行固定化，可增加底物或产品对细胞壁的渗透性和酶的热稳定性。
目前，由于化学法、发酵法或酶法生产L-瓜氨酸均有许多缺点，导致生产成本高居不下，给实际推广应用带来了很大困难。
利用微生物酶转化法生产L-瓜氨酸可以通过菌体细胞固定化来实现。由于利用游离细胞生产L-瓜氨酸存在原料浪费、产物分离困难、生产周期长问题；为了克服这些问题，固定化细胞是最好的解决办法。海藻酸盐凝胶作为一种广泛应用的细胞固定化介质，具有固定化温度低、强度高、化学稳定性好、无毒、包埋效率高且价格低廉等优点。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提高L-瓜氨酸的生产效率，降低L-瓜氨酸的生产成本；利用粪肠球菌固定化细胞填充柱为反应器催化合成L-瓜氨酸，提高了产物的纯度，增加了产率，缩短了生产周期，大大降低了生产成本，使大规模连续生产L-瓜氨酸成为可能。其中固定化细胞即采用海藻酸钠包埋法对粪肠球菌CGMCC NO.1866进行固定化，把固定化好的细胞填充到填充柱中，然后让含有L-精氨酸的磷酸缓冲溶液以一定的流速流经填充柱。该制备方法通过选用合适的固定化条件对粪肠球菌CGMCC NO.1866进行固定化，把固定化细胞填充到一定高径比的填充柱中，再以此填充柱作为催化剂，让含有L-精氨酸的磷酸缓冲液以一定的流速流经此填充柱，在最佳反应条件下催化合成L-瓜氨酸。该方法具有固定化细胞活性高、稳定性好、寿命长，产物杂质少，生产周期短、可连续化，工艺操作简单、生产成本低等优点。
本发明的整体技术构思是1、固定化细胞连续生产L-瓜氨酸的方法，生产过程包括下列工艺步骤(1)种子液培养和发酵罐培养制备粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866细胞；(2)固定化粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866细胞的制备；(3)把固定化细胞填充到填充柱中；(4)把含有L-精氨酸的磷酸缓冲溶液流经填充柱，催化合成L-瓜氨酸；(5)产物的分离纯化。
本发明的具体工艺步骤及工艺条件是步骤(1)中粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866细胞的制备挑取1环斜面保存的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866菌株，加入到体积为50ml培养基中，在25-40℃，170r/min摇床培养24-48h后得一级种子液；再将一级种子液接种到含100ml上述培养基的500ml锥形瓶中，在25-40℃，170r/min摇床培养24-48h得二级种子液；以10-15％二级种子液接种发酵罐，发酵液在6000r/min，4℃离心15min得粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866细胞。种子液及发酵罐培养基由下列重量份组分组成葡萄糖20-60份、蛋白胨50-100份、牛肉膏50-100份、(NH4)2SO42-8份、硫酸镁0.5-2份、氯化钠1-2份、L-精氨酸2-5份、CaCl2·2H2O 0.05份、FeCl2·4H2O 0.1份、维生素B1 0.002份、维生素B12 0.005份、泛酸钙0.004份、烟酸0.001份、对氨基苯甲酸纳0.002份，和水1000份；发酵的工艺条件为发酵液接种量为10-15％，pH值为6.0-8.0，培养温度为25-40℃，通风量为0.6-1.0vvm，搅拌转速为120-160r/min，发酵时间为48-72h。步骤(2)中粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866细胞固定化将质量百分比浓度为3-9％的海藻酸钠加蒸馏水煮沸溶解，冷却后与等体积细胞浓度为50-100g/L的菌悬液混匀，取长度适当的4mm×6mm的乳胶管，在一端采用内径约1.0mm-4.0mm的滴头。将乳胶管装入蠕动泵，调节蠕动泵速度至50-100drop/min。在搅拌条件下，将混合液逐滴滴入0.1-1.0mol/L硼酸和0.5-2.0mol/L CaCl2混合溶液中，形成大小均匀的固定化凝胶珠，直径最大差值≤0.5mm，固化5-15h后取出，制得直径为2-5mm凝胶珠，固定化后的细胞酶活为未固定化菌体的99％。
步骤(3)中把固定化细胞填充到填充柱中填充柱为高径比为15-35的有机玻璃柱，以固定化细胞填充填充柱。步骤(4)把含有L-精氨酸的磷酸缓冲溶液流经填充柱，催化合成L-瓜氨酸L-精氨酸的物质量浓度为0.65-1.0mol/l，磷酸缓冲溶液(pH6.0)的物质量浓度为0.2-0.4mol/l，催化反应温度为30-55℃，缓冲溶液流速为0.3-0.5BV/h。在此反应条件下，L-精氨酸的转化率为95-99％，每升发酵液中含L-瓜氨酸112-165g，固定化细胞转化480-960h后，细胞催化活力仍是稳定的，即固定化细胞的使用寿命为480-960h。步骤(5)L-瓜氨酸的分离纯化包括以下三个步骤a、收集填充柱流出的反应液，加入活性炭进行脱色，脱色温度为60度；b、把经过a步骤后的反应液真空减压浓缩、结晶，即可得到纯度为99％以上的L-瓜氨酸，真空浓缩真空度为0.1Mpa，温度为60度，结晶温度为4度；c、把经过b步骤晶体真空干燥，干燥真空度为0.1Mpa，温度为60度，干燥后的成品为白色粉末状。
本发明所用的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866已经在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为粪肠球菌CGMCC NO.1866，保藏时间为2006年11月22日。
粪肠球菌CGMCC NO.1866的筛选，由下列工艺步骤组成(1)将安培管粪肠球菌菌种接种斜面制得斜面菌种；(2)将复壮后菌种涂布平板；(3)将平板菌落接种摇瓶发酵培养，进行初筛和复筛；(4)将复筛后的菌株进行复合诱变。
步骤(1)中斜面培养基和步骤(2)中的平板培养基由下列重量份组分组成葡萄糖10-40份、蛋白胨50-100份、牛肉膏50-100份、(NH4)2SO42-8份、硫酸镁0.5-2份、氯化钠1-2份、L-精氨酸2-5份、CaCl2·2H2O 0.05份、FeCl2·4H2O 0.1份和水1000份；制备斜面菌种和平板的工艺条件为pH值为6.0-8.0、温度25-45℃、培养时间为24-48小时。
步骤(3)中发酵液由下列重量份组分组成葡萄糖20-60份、蛋白胨50-100份、牛肉膏50-100份、(NH4)2SO42-8份、硫酸镁0.5-2份、氯化钠1-2份、L-精氨酸2-5份、CaCl2·2H2O 0.05份、FeCl2·4H2O 0.1份、维生素B1 0.002份、维生素B12 0.005份、泛酸钙0.004份、烟酸0.001份、对氨基苯甲酸纳0.002份和水1000份；发酵的工艺条件为pH值为6.0-8.0，培养温度为25-35℃，搅拌转速为120-160转/分钟，发酵时间为24-48小时。
步骤(4)中诱变依次包括种子菌悬液的制备，诱变剂的加入量，紫外照射时。
将斜面菌种接种到含5ml生理盐水试管中，往试管中加入体积百分比为0.5％-2.0％的硫酸二乙酯诱变剂，在漩涡振荡器上振荡1-2min，取0.5ml该菌悬液涂布平板，把平板放在紫外灯照射20-60s，然后把平板暗培养。培养条件为培养温度25-35℃，培养时间为48-72小时。
最后，得到粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866。
本发明提供的利用粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866固定化细胞连续生产L-瓜氨酸的方法，适用于以海藻酸钠、海藻酸钙、明胶、聚乙烯醇(PVA)凝胶、琼脂、聚氨酯、光硬化树脂或聚丙烯酸凝胶等为固定化介质固定化粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866细胞催化合成L-瓜氨酸。
本发明提供的利用粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866固定化细胞连续生产L-瓜氨酸的方法，适用于以有机玻璃柱、塑料柱、不锈钢柱或玻璃柱等作为固定化细胞的填充柱。
本发明所取得的技术进步在于第一，本发明所用的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866菌种比现有的能生产L-瓜氨酸的菌种如粪链球菌、臭味假单孢杆菌、铜绿色假单孢杆菌、绿色链球菌、产气荚膜杆菌或酵母菌具有更高的酶活、更长的寿命和更容易固定化。发酵液L-瓜氨酸浓度高达165g/L，是现有酶活最高菌种(粪链球菌发酵液L-瓜氨酸浓度为87.5g/L)的1.89倍；每批菌体使用寿命长达960h，是现有使用寿命最长菌种(臭味假单孢杆菌使用寿命为504h)的1.90倍；菌体细胞固定化后的酶活为未固定化菌体的99％，是臭味假单孢杆菌(菌体细胞固定化后的酶活仅为未固定化菌体的56％)的1.77倍。
第二，本发明是通过对粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866细胞进行固定化，以固定化细胞填充柱作为反应器，催化合成L-瓜氨酸。本发明所取得的进步主要体现在以下几方面(1)固定化细胞使用寿命长，以固定化细胞填充柱为催化剂，可以连续催化合成L-瓜氨酸长达480-960h，是游离细胞(使用寿命为24h)的20-40倍，这不但降低了原料消耗，而且节约了能耗，大大降低了生产成本。
(2)固定化细胞增强了菌体对环境的耐受度，比如游离细胞催化合成L-瓜氨酸的最适温度为37℃，最适pH值为6.0，而固定化细胞在温度为30-55℃，pH值在5.0-7.0时均有最大酶活，所以固定化细胞更容易实现大规模生产。
(3)产物纯度高，利用固定化细胞填充柱催化合成L-瓜氨酸，一方面可以避免游离细胞在催化过程中因破碎、死亡所产生的蛋白和其他氨基酸杂质；另一方面，可以避免细胞与反应液直接混合，给后续产物分离纯化带来困难。
(4)周期短，利用固定化细胞生产L-瓜氨酸的生产周期为3-5h，而游离细胞为24h，生产效率提高了5-8倍。
(5)生产可连续化，本发明所采用的填充柱反应器，反应液从柱的一端流经另一端，出来的反应液即为产物L-瓜氨酸，整个过程可以连续生产，简化了反应步骤，大大提高了生产效率。
综上所述，本发明采用固定化细胞连续生产L-瓜氨酸，每升发酵液中最高含165g L-瓜氨酸，固定化细胞使用寿命为960小时，具有重大工业化意义。
实施例以下结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1(1)菌体细胞的制备挑取1环斜面保存的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866菌株，加入到体积为50ml培养基中，在25℃，170r/min摇床培养48h后得一级种子液；再将一级种子液接种到含100ml上述培养基的500ml锥形瓶中，在25℃，170r/min摇床培养36h得二级种子液；以10％二级种子液接种发酵罐，发酵液在6000r/min，4℃离心15min得粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866细胞。
种子液及发酵罐培养基由下列重量份组分组成葡萄糖20份、蛋白胨100份、牛肉膏50份、(NH4)2SO42份、硫酸镁0.5份、氯化钠2份、L-精氨酸2份、CaCl2·2H2O 0.05份、FeCl2·4H2O 0.1份、维生素B1 0.002份、维生素B12 0.005份、泛酸钙0.004份、烟酸0.001份、对氨基苯甲酸纳0.002份，pH7.0和水1000份；发酵的工艺条件为发酵液接种量为10％，pH值为6.0，培养温度为25℃，通风量为0.6vvm，搅拌转速为120r/min，发酵时间为72h。
(2)菌体细胞的固定化将质量百分比浓度为9％的海藻酸钠加蒸馏水煮沸溶解，冷却后与等体积细胞浓度为100g/L的菌悬液混匀，取长度适当的4mm×6mm的乳胶管，在一端采用内径约4.0mm的滴头。将乳胶管装入蠕动泵，调节蠕动泵速度至100drop/min。在搅拌条件下，将混合液逐滴滴入0.1mol/L硼酸和1.0mol/L CaCl2混合溶液中，形成大小均匀的固定化凝胶珠，直径最大差值≤0.5mm，固化15h后取出，制得直径为5mm凝胶珠，固定化后的细胞酶活为未固定化菌体的99％。
(3)固定化细胞填充到填充柱中取一根高径比为15的有机玻璃柱作为填充柱，把固定化细胞填充入填充柱内。
(4)固定化细胞填充柱催化合成L-瓜氨酸将精氨酸的物质量浓度为0.85mol/l的磷酸缓冲溶液(0.2mol/l，pH6.0)，在温度为30℃条件下，以流速为0.3BV/h流经填充柱。在此反应条件下，L-精氨酸的转化率为97.5％，每升发酵液中含L-瓜氨酸144.4g，固定化细胞转化800h后，细胞催化活力仍是稳定的，即固定化细胞的使用寿命为800h。
(5)L-瓜氨酸的分离纯化，包括以下三个步骤
a、收集填充柱流出的反应液，加入活性炭进行脱色，脱色温度为60度；b、把经过a步骤后的反应液真空减压浓缩、结晶，即可得到纯度为99％以上的L-瓜氨酸，真空浓缩真空度为0.1Mpa，温度为60度，结晶温度为4度；c、把经过b步骤晶体真空干燥，干燥真空度为0.1Mpa，温度为60度，干燥后的成品为白色粉末状。
实施例2(1)菌体细胞的制备挑取1环斜面保存的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866菌株，加入到体积为50ml培养基中，在30℃，170r/min摇床培养36h后得一级种子液；再将一级种子液接种到含100ml上述培养基的500ml锥形瓶中，在30℃，170r/min摇床培养36h得二级种子液；以10％二级种子液接种发酵罐，发酵液在6000r/min，4℃离心15min得粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866细胞。
种子液及发酵罐培养基由下列重量份组分组成葡萄糖40份、蛋白胨75份、牛肉膏75份、(NH4)2SO46份、硫酸镁1份、氯化钠1份、L-精氨酸3份、CaCl2·2H2O 0.05份、FeCl2·4H2O 0.1份、维生素B1 0.002份、维生素B12 0.005份、泛酸钙0.004份、烟酸0.001份、对氨基苯甲酸纳0.002份，pH7.0和水1000份；发酵的工艺条件为发酵液接种量为10％，pH值为7.0，培养温度为30℃，通风量为0.8vvm，搅拌转速为140r/min，发酵时间为56h。
(2)菌体细胞的固定化将质量百分比浓度为5％的海藻酸钠加蒸馏水煮沸溶解，冷却后与等体积细胞浓度为90g/L的菌悬液混匀，取长度适当的4mm×6mm的乳胶管，在一端采用内径约4.0mm的滴头。将乳胶管装入蠕动泵，调节蠕动泵速度至80drop/min。在搅拌条件下，将混合液逐滴滴入0.3mol/L硼酸和1.0mol/L CaCl2混合溶液中，形成大小均匀的固定化凝胶珠，直径最大差值≤0.5mm，固化10h后取出，制得直径为3mm凝胶珠，固定化后的细胞酶活为未固定化菌体的99％。
(3)固定化细胞填充到填充柱中取一根高径比为25的有机玻璃柱作为填充柱，把固定化细胞填充入填充柱内。
(4)固定化细胞填充柱催化合成L-瓜氨酸将精氨酸的物质量浓度为0.8mol/l的磷酸缓冲溶液(0.2mol/l，pH6.0)，在温度为40℃条件下，以流速为0.4 BV/h流经填充柱。在此反应条件下，L-精氨酸的转化率为98.5％，每升发酵液中含L-瓜氨酸137.3g，固定化细胞转化720h后，细胞催化活力仍是稳定的，即固定化细胞的使用寿命为720h。
(5)L-瓜氨酸的分离纯化，包括以下三个步骤b、收集填充柱流出的反应液，加入活性炭进行脱色，脱色温度为60度；b、把经过a步骤后的反应液真空减压浓缩、结晶，即可得到纯度为99％以上的L-瓜氨酸，真空浓缩真空度为0.1Mpa，温度为60度，结晶温度为4度；c、把经过b步骤晶体真空干燥，干燥真空度为0.1Mpa，温度为60度，干燥后的成品为白色粉末状。
实施例3(1)菌体细胞的制备挑取1环斜面保存的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866菌株，加入到体积为50ml培养基中，在30℃，170r/min摇床培养36h后得一级种子液；再将一级种子液接种到含100ml上述培养基的500ml锥形瓶中，在30℃，170r/min摇床培养36h得二级种子液；以12％二级种子液接种发酵罐，发酵液在6000r/min，4℃离心15min得粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866细胞。
种子液及发酵罐培养基由下列重量份组分组成葡萄糖40份、蛋白胨75份、牛肉膏75份、(NH4)2SO46份、硫酸镁1份、氯化钠1.0份、L-精氨酸3份、CaCl2·2H2O 0.05份、FeCl2·4H2O 0.1份、维生素B1 0.002份、维生素B12 0.005份、泛酸钙0.004份、烟酸0.001份、对氨基苯甲酸纳0.002份，pH7.0和水1000份；发酵的工艺条件为发酵液接种量为12％，pH值为7.0，培养温度为30℃，通风量为0.9vvm，搅拌转速为160r/min，发酵时间为48h。
(2)菌体细胞的固定化将质量百分比浓度为6％的海藻酸钠加蒸馏水煮沸溶解，冷却后与等体积细胞浓度为90g/L的菌悬液混匀，取长度适当的4mm×6mm的乳胶管，在一端采用内径约2.0mm的滴头。将乳胶管装入蠕动泵，调节蠕动泵速度至100drop/min。在搅拌条件下，将混合液逐滴滴入0.1mol/L硼酸和2.0mol/L CaCl2混合溶液中，形成大小均匀的固定化凝胶珠，直径最大差值≤0.5mm，固化10h后取出，制得直径为2mm凝胶珠，固定化后的细胞酶活为未固定化菌体的99％。
(3)固定化细胞填充到填充柱中取一根高径比为30的有机玻璃柱作为填充柱，把固定化细胞填充入填充柱内。
(4)固定化细胞填充柱催化合成L-瓜氨酸将精氨酸的物质量浓度为0.65mol/l的磷酸缓冲溶液(0.3mol/l，pH6.0)，在温度为40℃条件下，以流速为0.5BV/h流经填充柱。在此反应条件下，L-精氨酸的转化率为99％，每升发酵液中含L-瓜氨酸112.1g，固定化细胞转化960h后，细胞催化活力仍是稳定的，即固定化细胞的使用寿命为960h。
(5)L-瓜氨酸的分离纯化，包括以下三个步骤c、收集填充柱流出的反应液，加入活性炭进行脱色，脱色温度为60度；b、把经过a步骤后的反应液真空减压浓缩、结晶，即可得到纯度为99％以上的L-瓜氨酸，真空浓缩真空度为0.1Mpa，温度为60度，结晶温度为4度；c、把经过b步骤晶体真空干燥，干燥真空度为0.1Mpa，温度为60度，干燥后的成品为白色粉末状。
实施例4(1)菌体细胞的制备挑取1环斜面保存的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866菌株，加入到体积为50ml培养基中，在30℃，170r/min摇床培养36h后得一级种子液；再将一级种子液接种到含100ml上述培养基的500ml锥形瓶中，在30℃，170r/min摇床培养36h得二级种子液；以15％二级种子液接种发酵罐，发酵液在6000r/min，4℃离心15min得粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866细胞。
种子液及发酵罐培养基由下列重量份组分组成葡萄糖40份、蛋白胨75份、牛肉膏75份、(NH4)2SO46份、硫酸镁1份、氯化钠1份、L-精氨酸3份、CaCl2·2H2O 0.05份、FeCl2·4H2O 0.1份、维生素B1 0.002份、维生素B12 0.005份、泛酸钙0.004份、烟酸0.001份、对氨基苯甲酸纳0.002份，pH7.0和水1000份；发酵的工艺条件为发酵液接种量为15％，pH值为7.0，培养温度为30℃，通风量为1.0vvm，搅拌转速为160r/min，发酵时间为48h。
(2)菌体细胞的固定化将质量百分比浓度为8％的海藻酸钠加蒸馏水煮沸溶解，冷却后与等体积细胞浓度为75g/L的菌悬液混匀，取长度适当的4mm×6mm的乳胶管，在一端采用内径约4.0mm的滴头。将乳胶管装入蠕动泵，调节蠕动泵速度至75drop/min。在搅拌条件下，将混合液逐滴滴入1.0mol/L硼酸和0.5mol/L CaCl2混合溶液中，形成大小均匀的固定化凝胶珠，直径最大差值≤0.5mm，固化12h后取出，制得直径为5mm凝胶珠，固定化后的细胞酶活为未固定化菌体的99％。
(3)固定化细胞填充到填充柱中取一根高径比为30的有机玻璃柱作为填充柱，把固定化细胞填充入填充柱内。
(4)固定化细胞填充柱催化合成L-瓜氨酸将精氨酸的物质量浓度为1.0mol/l的磷酸缓冲溶液(0.4mol/l，pH6.0)，在温度为55℃条件下，以流速为0.3BV/h流经填充柱。在此反应条件下，L-精氨酸的转化率为95％，每升发酵液中含L-瓜氨酸165.5g，固定化细胞转化480h后，细胞催化活力仍是稳定的，即固定化细胞的使用寿命为480h。
(5)L-瓜氨酸的分离纯化，包括以下三个步骤d、收集填充柱流出的反应液，加入活性炭进行脱色，脱色温度为60度；b、把经过a步骤后的反应液真空减压浓缩、结晶，即可得到纯度为99％以上的L-瓜氨酸，真空浓缩真空度为0.1Mpa，温度为60度，结晶温度为4度；c、把经过b步骤晶体真空干燥，干燥真空度为0.1Mpa，温度为60度，干燥后的成品为白色粉末状。
实施例5(1)菌体细胞的制备挑取1环斜面保存的粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866菌株，加入到体积为50ml培养基中，在40℃，170r/min摇床培养24h后得一级种子液；再将一级种子液接种到含100ml上述培养基的500ml锥形瓶中，在40℃，170r/min摇床培养24h得二级种子液；以10％二级种子液接种发酵罐，发酵液在6000r/min，4℃离心15min得粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866细胞。
种子液及发酵罐培养基由下列重量份组分组成葡萄糖60份、蛋白胨50份、牛肉膏100份、(NH4)2SO48份、硫酸镁2份、氯化钠1.5份、L-精氨酸5份、CaCl2·2H2O 0.05份、FeCl2·4H2O 0.1份、维生素B1 0.002份、维生素B12 0.005份、泛酸钙0.004份、烟酸0.001份、对氨基苯甲酸纳0.002份，pH7.0和水1000份；
发酵的工艺条件为发酵液接种量为10％，pH值为8.0，培养温度为40℃，通风量为0.8vvm，搅拌转速为140r/min，发酵时间为56h。
(2)菌体细胞的固定化将质量百分比浓度为3％的海藻酸钠加蒸馏水煮沸溶解，冷却后与等体积细胞浓度为50g/L的菌悬液混匀，取长度适当的4mm×6mm的乳胶管，在一端采用内径约1.0mm的滴头。将乳胶管装入蠕动泵，调节蠕动泵速度至50drop/min。在搅拌条件下，将混合液逐滴滴入0.5mol/L硼酸和1.0mol/L CaCl2混合溶液中，形成大小均匀的固定化凝胶珠，直径最大差值≤0.5mm，固化5h后取出，制得直径为3.5mm凝胶珠，固定化后的细胞酶活为未固定化菌体的99％。
(3)固定化细胞填充到填充柱中取一根高径比为35的有机玻璃柱作为填充柱，把固定化细胞填充入填充柱内。
(4)固定化细胞填充柱催化合成L-瓜氨酸将精氨酸的物质量浓度为0.70mol/l的磷酸缓冲溶液(0.2mol/l，pH6.0)，在温度为30℃条件下，以流速为0.3 BV/h流经填充柱。在此反应条件下，L-精氨酸的转化率为98.5％，每升发酵液中含L-瓜氨酸120.1g，固定化细胞转化840h后，细胞催化活力仍是稳定的，即固定化细胞的使用寿命为840h。
(5)L-瓜氨酸的分离纯化，包括以下三个步骤e、收集填充柱流出的反应液，加入活性炭进行脱色，脱色温度为60度；b、把经过a步骤后的反应液真空减压浓缩、结晶，即可得到纯度为99％以上的L-瓜氨酸，真空浓缩真空度为0.1Mpa，温度为60度，结晶温度为4度；c、把经过b步骤晶体真空干燥，干燥真空度为0.1Mpa，温度为60度，干燥后的成品为白色粉末状。
权利要求
1.固定化细胞连续生产L-瓜氨酸的方法，其特征在于用固定化粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)CGMCC NO.1866细胞连续生产L-瓜氨酸，生产过程包括下列工艺步骤(1)种子液培养和发酵罐培养制备粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866细胞；(2)固定化粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866细胞的制备；(3)把固定化细胞填充到填充柱中；(4)把含有L-精氨酸的磷酸缓冲溶液流经填充柱，催化合成L-瓜氨酸；(5)产物的分离纯化。
2.根据权利要求1所述的固定化细胞连续生产L-瓜氨酸的方法，其特征在于所述的(1)步骤中的种子液及发酵罐培养基由下列重量份组分组成葡萄糖20-60份、蛋白胨50-100份、牛肉膏50-100份、(NH4)2SO42-8份、硫酸镁0.5-2份、氯化钠1-2份、L-精氨酸2-5份、CaCl2·2H2O 0.05份、FeCl2·4H2O 0.1份、维生素B1 0.002份、维生素B12 0.005份、泛酸钙0.004份、烟酸0.001份、对氨基苯甲酸纳0.002份，和水1000份。
3.根据权利要求1或2所述的固定化细胞连续生产L-瓜氨酸的方法，其特征在于发酵的工艺条件为发酵液接种量为10-15％，pH值为6.0-8.0，培养温度为25-40℃，通风量为0.6-1.0vvm，搅拌转速为120-160r/min，发酵时间为48-72h。
4.根据权利要求1所述的固定化细胞连续生产L-瓜氨酸的方法，其特征在于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866细胞的固定化介质选自海藻酸钠、海藻酸钙、明胶、聚乙烯醇(PVA)凝胶、琼脂、聚氨酯、光硬化树脂或聚丙烯酸凝胶。
5.根据权利要求1所述的固定化细胞连续生产L-瓜氨酸的方法，其特征在于所述的(2)步骤中固定化粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866的制备是利用海藻酸钠包埋法制备，其步骤是先制得质量百分比浓度为3-9％的海藻酸钠水溶液，冷却后与等体积细胞浓度为50-100g/L的菌悬液混匀，取长度适当的4mm×6mm的乳胶管，在一端采用内径约1.0mm-4.0mm的滴头，将乳胶管装入蠕动泵，调节蠕动泵速度至50-100drop/min，在搅拌条件下，将混合液逐滴滴入0.1-1.0mol/L硼酸和0.5-2.0mol/L CaCl2混合溶液中，形成大小均匀的固定化凝胶珠，直径最大差值≤0.5mm，固化5-15h后取出，制得直径为2-5mm凝胶珠，固定化后的细胞酶活为未固定化菌体的99％。
6.根据权利要求1所述的固定化细胞连续生产L-瓜氨酸的方法，其特征在于粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866细胞的填充柱选自有机玻璃柱、塑料柱、不锈钢柱或玻璃柱。
7.根据权利要求6所述的固定化细胞连续生产L-瓜氨酸的方法，其特征在于填充柱的高径比为15-35。
8.根据权利要求1所述的固定化细胞连续生产L-瓜氨酸的方法，其特征在于所述的(4)步骤中的催化反应条件为L-精氨酸的物质量浓度为0.65-1.0mol/l，磷酸缓冲溶液(pH6.0)的物质量浓度为0.2-0.4mol/l，催化反应温度为30-55℃，缓冲溶液流速为0.3-0.5BV/h。
9.根据权利要求1所述的固定化细胞连续生产L-瓜氨酸的方法，其特征在于所述的固定化细胞的使用寿命为480-960h。
10.根据权利要求1所述的固定化细胞连续生产L-瓜氨酸的方法，其特征在于所述的(5)步骤中的产物的分离纯化包括以下三个步骤a、收集填充柱流出的反应液，加入活性炭进行脱色，脱色温度为60度；b、把经过a步骤后的反应液真空减压浓缩、结晶，即可得到纯度为99％以上的L-瓜氨酸，真空浓缩真空度为0.1Mpa，温度为60度，结晶温度为4度；c、把经过b步骤晶体真空干燥，干燥真空度为0.1Mpa，温度为60度，干燥后的成品为白色粉末状。
11.粪肠球菌(Enterococcus faecalis)CGMCC NO.1866。
全文摘要
本发明涉及利用粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)CGMCC NO.1866固定化细胞连续生产L－瓜氨酸的制备方法，它包括菌体细胞的制备，固定化载体的选择，固定化细胞的制备，固定化细胞填充到填充柱，反应条件的优化和产物的分离纯化等工艺步骤；本发明通过粪肠球菌固定化细胞连续生产L－瓜氨酸，固定化细胞酶活高、使用寿命长和可连续化生产，产物提取工艺简单，生产周期短，生产效率高，大大降低了生产成本。采用本发明生产L－瓜氨酸，每升反应液中含有112－165g L－瓜氨酸，L－精氨酸转化率高达99％，固定化细胞使用寿命为960h。L－瓜氨酸具有很多重要的生理功能，如清除自由基，异体排斥效应指示剂，血管舒张作用，稳定血压以及诊断类风湿关节炎，抗氧化等，应用前景十分广 阔。
文档编号C12N11/00GK1948464SQ20061014565
公开日2007年4月18日 申请日期2006年11月24日 优先权日2006年11月24日
发明者张鹏, 张淑荣, 刘春巧, 杨育红 申请人:张鹏, 张淑荣, 刘春巧