一种检测巯基嘌呤甲基转移酶基因型的试剂盒及方法

专利名称：：一种检测巯基嘌呤甲基转移酶基因型的试剂盒及方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，涉及一种巯基嘌昤甲基转移酶基因型检测试剂盒和方法。更具体的，本发明涉及通过聚合酶链式反应一限制性酶切片段长度多态性方法，提供一种分析编码巯基嘌呤甲基转移酶(TPMT)的基因位点多态性的试剂盒和方法。
背景技术：
：嘌呤类药物，包括6-巯基嘌呤(6-MP)，6-巯代鸟嘌呤(6-TG)和巯唑嘌呤(AZA)是临床常用的肿瘤化疗药物，并且广泛用于治疗各种类型的白血病。除白血病以外，嘌呤类药物还被广泛用于治疗肠炎，风湿性关节炎，器官移植和系统性红斑狼疮等。它们通过干扰体内的核酸代谢，包括核酸的从头合成和补救合成途径发挥作用。嘌呤类药物是无内在生物活性的药物，必须通过体内一系列代谢后才能发挥抗白血病效应。部分使用嘌呤类药物的患者出现严重的毒副作用，主要表现是骨髓抑制和白细胞减少。研究表明，嘌呤类药物的疗效和TPMT活性密切相关，临床研究表明，6-MP，6-TG以及AZA的临床疗效及不良反应和TPMT活性相关。TPMT活性高的个体，用药后生成活性代谢产物一巯基鸟嘌呤磷酸盐(TGNs)的浓度低，因此疾病的复发率高；而对于TPMT缺陷的个体，医用常规剂量的嘌呤类药物也会导致体内巯基鸟嘌呤磷酸盐的积累，产生严重的毒副作用如严重骨髓抑制和肝损害等，最终导致治疗的被迫中断，造成治疗的失败(CoulthardSA,HowellC，RobsonJ，etal.Blood,1998,92:2856-2862;RellingMV,HancockML,BoyettJM，etal.Blood，1999，93:2817-2823)。人类TPMT基因总长为3.4kb，编码序列总长2.7kb，开放阅读框架含735个碱基。编码的TPMT的分子量大约为30000。由245个氨基酸残基组成。经研究发现，TPMT基因有3个重要的位点,分别是核苷酸序列中第238位点、第460位点和第719位点。当三个位点发生突变，即第238位的鸟嘌呤(G)—胞嘧啶(C),结果使得氨基酸序列第80位的Ala(丙氨酸)—Pro(脯氨酸),第460位的鸟嘌昤(G)—腺嘌呤(A),使得氨基酸序列第154位的Ala(丙氨酸)—Thr(苏氨酸),第719位的腺嘌呤(A)—鸟嘌吟(G),使第240位的Tyr(酪氨酸)—Cys(半胱氨酸)。突变诱导的TPMT酶活性的减低或丧失，导致在使用嘌呤类药物时形成高浓度的TGNs,引起明显的造血组织细胞毒性，产生严重后果，甚至引起死亡(TaiHL,KrynetskiEY,YatesCR,etal.AmJHumGenet,l996,58:694-702;KrynetskiEY,SchuetzJD,GalpinAJ,etal.ProcNatlAcadSciUSA，1995，92:949)。研究发现，TPMT的基因型和其酶活性之间有很强的相关性，根据TPMT基因多态性和酶活性的关系，可以通过检测患者TPMT的基因型，推测患者体内TPMT酶活性的高低，预测不同患者对于嘌呤类药物的疗效和副作用，为医生提供用药时的参考。根据国内外的文献报道，检测TPMT基因多态性的方法主要有荧光定量PCR方法、等位基因特异性PCR(allelespecificPCR)、PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、变性高效液相色谱分析(DHPLC)、SNaPshot定点序列分析检测以及基因序列测定等分析方法。目前上市的产品主要应用荧光定量PCR的方法检测TPMT的多态性，荧光定量PCR方法具有准确率高，操作简便的优点。但是它致命的缺点是检测所需要的荧光定量PCR仪设备昂贵，国内只有极少数科研院所和大型医院有此设备。此外，检测所用的荧光标记探针和引物造价较高，一般的患者难以承受。Szumlanski等利用等位基因特异性PCR，针对TPMT中单核苷酸多态性位点设计引物，通过控制PCR过程中的退火温度等PCR条件使得野生基因型可以得到PCR产物而突变型不能得到产物(SzumlanskiC，OttemessD，etal.DNACellBiol,1996;15:17-30)。但在后期的验证实验中，马晓莉等发现，由于假阳性的存在，这一方法并不能有效的区分野生型禾口突变型(MAXiaoLi,ZUPing,etal.JournalofExperimentalHematology2003;ll(5):458-463)。变性高效液相色谱法(DHPLC)是一种新型的高通量筛选DNA序列变异的技术。此方法进行基因变异检测是基于异源双链的形成，已知野生型均为单一峰，已知杂合子变异型和纯合子变异型，经过变性复性过程，在部分变性温度的条件下色谱峰的个数和峰的对称性有改变，可与野生型比较就可进行鉴别；检测未知样品时，未知样品与野生型混合，经过变性复性过程，在部分变性温度的条件下，若有突变则色谱峰的个数和峰的对称性有改变，可与野生型比较进行鉴别；若没有突变，则为单一峰。Schaeffeler和Hall等分别用DHPLC的方法检测了TPMT几个位点的多态性，结果发现DHPLC能准确地检测TPMT基因第5和10外显子区的SNP，筛选结果DNA直接测序的符合率为100%。而TPMT第7外显子区SNP检测结果发现，此区杂合性变异率高达34%，经DNA直接序列分析证实杂合峰均为假阳性(ShaeffelerE,LangT，etal.ClinChem,2001;47:548-555;HallAG,HamiltonP，etal.JBiochemBiophysMethods,2001;47:65-718)。虽然DHPLC能准确识别TPMT基因的2个SNP位点,但筛选的基因变异需要DNA序列分析进一步验证。另外，检测其他TPMT的SNP位点的准确性和可靠性将有待进一步研究。应用SNaPshot进行定点的序列分析，其基本原理遵循DNA直接测序中的双脱氧终止法，所不同的是PCR反应中只有不同荧光标记的ddNTP。由于每个SNP位点的引物3'端都紧靠SNP点，因此每一种引物在聚合酶作用下,根据模板的的序列，只延伸一个核苷酸。然后用先进的荧光检测系统,检测延伸的那个核苷酸的种类。实验结果表明,85例DNA标本中，TPMT基因第7和10外显子区的SNP检测结果与DNA直接序列分析的符合率均为100%，而TPMT启动子291和2168处均为G,未发现A和T，这一结果与实际情况差别较大，利用此方法并不能准确的检测TPMT的全部基因多态性位点(SchutzE，vonAhsenN,etal.ClinChem,2000;46:1728-1737)。基因序列测定法是确定基因序列的金标准，用于检测TPMT基因多态性的实际操作中，需要首先利用PCR过程扩增得到目的基因序列，然后利用基因测序仪，通过荧光标记的双脱氧核苷酸进行序列测定。尽管存在一定的误差，基因序列测定仍然是公认的检测基因序列的最准确的方法。利用聚合酶链式反应一限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)的方法检测TPMT的基因多态性，首先通过软件进行基因的酶切位点分析，针对基因多态性位点，选择酶切效率高，识别位点单一，价格低廉的核酸内切酶。设计特异性的引物，将目的基因片段进行扩增，然后利用核酸内切酶进行酶切反应，最后在琼脂糖凝胶电泳或者聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离酶切片段，判定基因型(OtternessD,SzumlanskiC,etal.ClinPharmacolTher，1997;62:60-73;KrynetskiEY，TaiHL,etal.Pharmacogenetics.1996;6:279-290;Spire-Vayron-de-laMoureyreC，DebuysereH，etal.HumMutat,1998;12:177-185)。在马晓莉等做的TPMT基因型多种检测方法对比实验中，结果显示，检测第7，10外显子上的SNP过程中，PCR-RFLP和测序结果符合率达到100%(MAXiaoLi,ZUPing,etal.JournalofExperimentalHematology2003;ll(5):458-463)。这也和我们实验室的实验结果相吻合。总之，从目前的检测产品和文献报道看，大多数的检测方法如荧光定量PCR法、变性高效液相色谱法、SNaPshot定点序列分析法和基因序列测定等方法都需要特殊的、价格昂贵的仪器设备，如荧光定量PCR仪、高效液相色谱HPLC、基因序列测定仪等，国内只有少数的实验室有此类仪器的配备。而相对廉价的等位基因特异性PCR的方法又存在非特异性等问题。因而，PCR-RFLP是普通的检验实验室检测TPMT基因型的最佳选择。然而，目前已报道的PCR-RFLP方法存在扩增效率低、体系不稳定、酶切效率低、费时、费力的缺点，因此，一直没有成熟的采用PCR-RFLP方法鉴定基因型的产品问世。由于缺乏既高效稳定又方便价廉的检测TPMT基因型的方法和产品，使临床医生在用药时不能及时得到患者相应的个体化遗传学信息，因而无法按照药物基因组学研究成果预测不同患者对于嘌呤类药物的疗效和副作用，难以进行个体化治疗
发明内容为解决上述问题，本发明提供一种简便、易于推广实施、稳定可靠的检测巯基嘌呤甲基转移酶基因型的试剂盒及方法，为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种检测巯基嘌呤甲基转移酶基因型的方法，应用巯基嘌呤甲基转移酶基因多态性位点的特异性引物对样本DNA进行聚合酶链式反应，用限制性内切酶酶切扩增产物，根据酶切片段长度多态性判定基因型，其中引物至少包含检测巯基嘌呤甲基转移酶G460A多态性位点的特异性引物和检测A719G多态性位点的特异性引物。其中，聚合酶链式反应程序为94。C预变性3分钟；94。C变性30秒，55。C一65。C退火45秒，72。C延伸30秒，25—35个循环；72。C延伸5—10分钟。退火温度优选63。C。其中，检测G460A多态性位点的正向引物为5，-CAGCGTAGTTGGTGTGGAAA隱3，；反向引物为5'-GCGATCACCTGGATTAATGG-3'。其中，检测G460A多态性位点的限制性内切酶为MwoI。MwoI的酶使用量是0.5一10U，酶切的时间是1一18小时。优选MwoI的酶使用量是1U，优选酶切的时间是2小时。其中，检测A719G多态性位点的正向引物为5，-CACCCAGCCAATTTTGAGTA-3';反向引物为5，-CCTCAAAAACATGTCAGTGTGA-3，。其中，检测A719G多态性位点的限制性内切酶为Accl。Accl的酶使用量是0.5一10U，酶切的时间是1一16小时。优选Accl的酶使用量是1U，酶切的时间是l小时。一种利用上述方法检测巯基嘌呤甲基转移酶基因型的试剂盒，含有检测巯基嘌呤甲基转移酶G460A和A719G多态性位点的特异性引物和限制性内切酶MwoI和Accl。检测G460A多态性位点的正向引物为5，-CAGCGTAGTTGGTGTGGAAA-3，；反向引物为5'-GCGATCACCTGGATTAATGG-3，。检测G460A多态性位点的限制性内切酶为Mwol。Mwo1的酶使用量是0.5—10U，酶切的时间是1一18小时。优选MwoI的酶使用量是1U，优选酶切的时间是2小时。检测A719G多态性位点的正向引物为5，-CACCCAGCCAATTTTGAGTA-3';反向引物为5，-CCTCAAAAACATGTCAGTGTGA-3，。检测A719G多态性位点的限制性内切酶为Accl。Accl的酶使用量是0.5—10U，酶切的时间是1一16小时。优选AccI的酶使用量是1U，酶切的时间是l小时。本发明提供的试剂盒，可以含有巯基嘌呤甲基转移酶G460A多态性位点的野生型质粒DNA和巯基嘌呤甲基转移酶A719G多态性位点的突变型质粒DNA作为阳性对照。其中，还可以含有巯基嘌呤甲基转移酶G460A多态性位点的突变型质粒DNA和巯基嘌呤甲基转移酶A719G多态性位点的野生型质粒DNA作为阳性对照。本发明提供的试剂盒，可以含有DNA抽提试剂、PCR反应混合物、T叫DNA酶、酶切缓冲液和电泳上样缓冲液。在本发明中，进行聚合酶链式反应的样品可以选自血液样品、体液样品、组织样品和培养细胞，优选的，所述样品为血液样品。其中血液样品包括外周血细胞、白细胞、血清等，体液样品包括尿液、唾液、组织液、脑脊液、体腔渗出液等，组织样品包括口腔粘膜试子、毛发、皮肤、活检组织、组织样分泌物、排泄物样本等。这些生物样品可来自正常人群、白血病受损人群、系统性红斑狼疮，和需要器官移植的人群，或其它自身免疫疾病需要人群。本发明提供的试剂盒具有检测巯基嘌呤甲基转移酶基因型的用途。本发明提供的试剂盒具有预测嘌呤类药物不良反应中的用途。其中，嘌呤类药物是6-巯基嘌呤(6-Mercaptopurine6-MP)、6-巯代鸟嘌呤(6-thioguanine6-TG)或巯唑嘌呤(azathioprineAZA)。本发明提供的检测巯基嘌呤甲基转移酶基因型的方法，具体步骤为(1)首先提取样本的DNA。(2)应用检测巯基嘌呤甲基转移酶G460A和A719G多态性位点的引物进行PCR扩增。由于两对引物的特定设计，使其可以共用一个PCR程序94'C预变性3分钟；94°C变性30秒，55。C一65。C退火45秒，72。C延伸30秒，25—35个循环；72。C延伸5—10分钟；退火温度优选为63'C。(3)分析产物。分析产物的方法为用限制性内切酶MwoI和Acc1消化；AccI酶切的量应该是0.5—10U，其中优选1U,酶切的时间应该是1一16小时，其中优选l小时；Mwol酶切的酶使用量应该是0.5—IOU，其中优选1U，酶切的时间应该是1一18小时，其中优选2小时。在本发明中，TPMTG460A引物扩增得到含有G460A多态性位点的长度为240bp的基因片段，此片段经过限制性内切酶Mwol酶切后，如果此位点为含有碱基G的野生型，酶切得到大小为217bp+23bp的两个基因片段。如果此位点为含有A的突变型，则限制性内切酶MwoI不能识别，从而酶切得到一个240bp的基因片段。用TPMTA719G引物扩增后，得到含有A719G多态性位点的长度为242bp的基因片段，此片段经过限制性内切酶AccI酶切，如果此位点为含有碱基A的野生型，则酶切得到大小为242bp的基因片段，如果此位点为含有碱基G的突变型，则酶切得到182bp+60bp两个片段。(4)最后依据表1判定基因型。基因组DNA经过PCR和酶切以后，在3%的琼脂糖凝胶上电泳分离所得到的片段。根据片段长度可以得到两个多态性位点的碱基类型，综合两个位点的碱基类型，根据表1就可以得到基因型。表1TPMT基因型和多态性位点碱基的关系<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>人类细胞中的染色体成对存在，在成对的染色体中，每一条染色体的基因型可能相同或者不同。根据这种情况，每一种基因型又可分为纯合野生型，杂合型和纯合突变型。据文献报导，基因型和TPMT活性之间存在很强的相关关系。见表2。表2TPMT基因型和酶活性的关系<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>野生基因型，酶活性不受影响，因而属于此类基因型的患者可以使用常规剂量的嘌呤类药物；TPMT*3A/*3八纯合突变会引起丁？1^1活性的丧失，如果使用常规剂量的药物会引起严重的副作用，因而建议属于此类基因型的患者不使用嘌呤类药物进行治疗。其余的基因型会引起TPMT活性的降低，建议属于此类基因型的患者降低嘌呤类药物的使用剂量。本发明所述试剂盒除了包含测定上述多态性位点所需要的特定引物之外，还包含运用PCR扩增而进行检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟悉这些常规组件和检测方法。本发明提供的试剂盒可以具体地含有1、DNA抽提试剂，具体包括(1)红细胞裂解液NH4C1，KHC03，EDTA;(2)白细胞裂解液蛋白酶K、RNaseA、NaCl、Tris、EDTA、SDS;(3)蛋白沉淀液7.5M乙酸胺(pH7.4);(4)核酸储存液lM三羟甲基氨基甲垸-盐酸(Tris-HCl，pH8.0);2、PCR反应试剂，具体包括(1)引物，包括针对巯基嘌呤甲基转移酶基因不同多态性位点的正向引物和反向引物，它们能扩增含有巯基嘌呤甲基转移酶基因特定突变位点的基因片断；(2)2xPCR反应混合液l.Oml[lOOmMTris-HCl,100mMKCl，pH8.3(20。C)];5.0uMMgCl2;各0.4mMdATP，dCTP，dGTP，dTTP，无菌双蒸水配制，pH7.0;(3)TaqDNA聚合酶(5U/ul);Taq酶保存缓冲液20mMTris-HCl(pH8.0)，100mMKC1，O.lmMEDTA，lmMDTT,().5%NP40，0.5%(v/v)，Tween20，50%甘油；(3)PCR用水灭菌的双蒸水或者注射用水。3、酶切试剂，包括限制性内切酶、和针对此限制性内切酶的酶切缓冲液，其中内切酶为AccI和MwoI。4、电泳试剂，包括琼脂糖，溴化乙锭，10x电泳上样缓冲液0.25%溴酚兰、40%(w/v)蔗糖水溶液。5、标准品，包括阳性对照，即分别含有TPMT基因G460A和A719G两个多态性位点的野生型质粒DNA和突变型质粒DNA。阴性对照经DNAaseI处理的双蒸水。本发明提供的利用PCR-RFLP技术的基因型检测方法和试剂盒，与专业文献此类方法的报道相比，我们改进了PCR反应的引物、PCR程序和反应混合物的配比，并增加了反应的稳定剂，使PCR反应的扩增效率大幅度提高，2ng的PCR模板在反应结束时能够得到约2ug的PCR产物，完全能够满足检测的需要。在以往的PCR-RFLP检测TPMT基因多态性的研究中，G460A和A719G位点的扩增需要两次单独的PCR过程(YatesCR,KrynetskiEY,LoennechenT.etal.AnnInternMed.1997Apr15,126(8):608-14;VesellES.AnnInternMed.1997Apr15,126(8):653-5.BlankRD.AnnInternMed.1997Decl;127(ll):1041-2.)。我们根据TPMT基因的具体情况，重新设计了引物，并且经过摸索，将TPMT两个多态性位点G460A和A719G的PCR扩增过程调节到一个PCR反应中进行，这样检测每个样本可以节省3个小时的时间。在本发明中，我们构建了含有TPMTG460A多态性位点和TPMTA719G多态性位点各个基因型的阳性对照质粒，对于G460A位点碱基为G(野生型)和A719G位点碱基为A(野生型)的基因片段，我们利用G460A和A719G特异性引物，扩增得到相应的基因片段，经过基因序列测定方法确定扩增片段的基因序列以后，连接入T载体中，经过转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，筛选得到阳性克隆，提取质粒后，通过酶切、PCR以及序列测定的方式验证均提示得到正确的阳性质粒。将此阳性克隆大规模培养，从中提取质粒并进行纯化，测定浓度以及纯度后低温保存，即得到试剂盒使用的阳性对照质粒。对于G460A位点碱基为A(突变型)和A719G位点碱基为G(突变型)的基因片段，因为突变型在人群中占的比例较小，从基因组中克隆基因需要检测很大的样本量，因此采用人工合成基因的方式。根据基因序列，人工合成了含有TPMTG460A和TPMTA719G位点的基因序列，克隆到载体质粒pUC57中，经序列测定验证后得到阳性对质粒。利用本发明提供的试剂盒或方法，鉴定出基因型，根据文献报道，对于TPMT"/"野生型患者，具有正常酶活性，建议使用常规剂量和治疗方案。对于TPMP^3A^3A纯合突变基因型，属于TPMT缺乏型患者，建议不使用嘌呤类药物做为治疗的首选。对于TPMT""3A，TPMT*1/*3B，TPMT"/*3C,TPMT*3A/*3C,TPMT*3A/*3B，和TPMP"3B，3C杂合型患者，建议降低用药剂量并縮短用药时间。本发明的有益效果是(l)本发明特别针对巯基嘌呤甲基转移酶TPMT的G460A(Alal54Thr)和A719G(Tyr240Cys)多态性位点基因型设计特定PCR扩增引物，经实验发现，与文献报道的扩增引物相比较，扩增效率高、特异性好、省时，有更好的使用价值。(2)文献报道的TPMT基因多态性的检测方法中，含有G460A和A719G位点的基因片段需要用不同的PCR条件扩增，检测两个位点需要做两次PCR。在本发明中，我们新设计了引物，可以将两个基因片段用同样的PCR条件扩增出来。这样检测每一个样本可以节省3个小时的时间，有利于患者更快的拿到检测结果。(3)在本发明中，我们将检测得到的样本基因型经过序列测定验证以后，将各个类型的基因扩增出来，克隆到载体中，构建了阳性对照质粒。这样的阳性对照品序列明确，可以无限制的扩增，获得大量的阳性对照，并且更容易控制对照品的质量比如浓度和纯度。比起以往的用阳性基因组DNA做为对照来说，既方便获得，易于大批量生产，又便于控制质量。(4)在本发明中，将PCR产物的酶切条件进行了优化，使样本在最短的时间内得到准确的结果，并且大大节省了酶切样本的限制性内切酶使用量，节省了成本。(5)本发明操作方法简单，无需特殊设备，检测所需的PCR仪一般医院都有配备；检测费时短，从提取基因组DNA开始到最后得到患者基因型，整个过程不超过12小时；检测费用较低，熟悉一般分子生物学操作的技术人员不需要特殊的培训即可完成整个过程。相比较来说，现有试剂盒所用的荧光定量PCR技术，需要价格昂贵的荧光定量PCR仪，只有少数的科研机构和大型医院的中心实验室才有配备。并且，荧光定量PCR检测所用的荧光标记试剂费用较高，并且容易失活。技术人员需要经过特殊的培训，并且一次检测的费用要200元左右，不适宜在大多数医院尤其是在中小型医院推广。(6)本发明运用聚合酶链式反应-限制性酶切片段长度多态性方法(PCR-RFLP)，检测外周血液样本中巯基嘌呤甲基转移酶基因多态性。本发明需要采集个体的全血，提取基因组DNA后，通过PCR反应，扩增含有两个基因多态性位点的基因片段，经过位点特异性的核酸内切酶酶切，野生型基因和突变型基因可以被酶切成为不同的片段，电泳后将片段区分，可以确定患者的基因型。采用本试剂盒的实验技术检测基因型具有稳定、可靠、价格便宜、较快速的优点。适于推广到临床使用。(7)本发明根据TPMT的基因多态性结果，结合个体的其他生物学指标对于嘌呤类药物的疗效和副作用进行预测。本发明提供的检测结果使医生减少了临床选择嘌呤类药物的盲目性，在多态性基因型分析的基础上可以预测使用嘌呤类药物的有效性和安全性，指导临床用药，以进行个体化医疗，减少毒副作用，减少医疗成本。下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所作出的本领域等同替换，均属于本发明的保护范围。图1是TPMT460野生型阳性对照质粒构建过程中基因片段PCR结果M:100bpLadder;1:PCR结果图2是TPMT460野生型阳性对照质粒酶切检定结果M:lOObpLadder;1:克隆1;2:克隆2;3克隆3;图3是4个患者G460A片段PCR扩增结果。M:50bpLadder;h1号患者；2:2号患者；3:3号患者图4是4个患者A719G片段PCR扩增结果。M:50bpLadder;1:1号患者；2:2号患者；3:3号患者图5是4个患者G460A片段PCR产物酶切结果。M:50bpLadder;1:1号患者；2:2号患者；3:3号患者图6是4个患者A719G片段PCR产物酶切结果。M:50bpLadder;1:1号患者；2:2号患者；3:3号患者具体实施方式实施例1下面以TPMT460野生型阳性对照质粒为实施例对本发明做进一步的详细阐述。1.引物和模板基因片段扩增使用下列引物TPMT460For:5'-CAGCGTAGTTGGTGTGGAAA-3，；TPMT460Back:5'-GCGATCACCTGGATTAATGG國3，。模板采用人类基因组DNA(编号AI0116U，浓度15ng4d)2.基因片段扩增按照表3配置PCR扩增混合物表3PCR反应成分配制名称用量(pi)模板(1515ng4d)310XPCRbuffer(-MgCl2)150mMMgCl20.3lOmMdNTP0.220pM引物混合物0.25U/nlTaq酶0.05无菌双蒸水5.25Total10PCR扩增条件为94°C3min;94。C30sec，63°C45sec，72。C30sec，35个循环；72°C7minPCR扩增后得到大小为240bp的条带，结果见附图13.PCR产物纯化1).PCR产物行1.5X琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察条带位置，切胶称重。2).采用德国MN公司NucleospinExtractII胶纯化试剂盒纯化PCR产物，最终用40^113;4:4号患者;4:4号患者;4:4号患者;4:4号患者。洗提液洗脱。4.AT克隆采用Promega公司的pGEM—Teasykit试剂盒进行AT克隆，按照说明书操作。按照表4配置连接体系表4连接反应成分配制名称用量(pi)Teasyvector12X连接缓冲液T4DNA连接酶1纯化后的PCR产物1无菌双蒸水24'C连接过夜。5.连接产物的转化1).取5pl连接产物，加入10(HdDH5a感受态细菌，轻轻混匀冰上静置20分钟。2).将混合物在42。C循环水浴热休克90秒，置于冰上2分钟。3).混合物中加入lml37。C预温的LB培养液，37°C振荡(180rpm)培养1小时。4).将200nl转化产物涂于含有100mg/ml氨苄青霉素的LB培养板(含lmol/IIPTG4^1，20mg/mlX-gal40pl)上，37。C倒置培养10h。5).从LB培养板上随机挑取3个白色菌落，接种于2ml含100mg/ml氨苄青霉素的LB培养液中，37。C振荡(250rpm)培养过夜。6.阳性质粒的鉴定1).阳性质粒的酶切鉴定各取lml菌液，碱裂解法小提质粒，加20W无菌双蒸水溶解。用EcoRI进行酶切鉴定，酶切体系按照表5配制表5酶切反应成分配制名称用量(W)10xbufferH1五coRI(12,1)0.3质粒1无菌双蒸水7.737"水浴酶切2小时，结果如附图2:从结果可以看出，酶切可以得到200bp大小的酶切片段，证明序列正确。2).阳性质粒序列测定由步骤1筛选得到的阳性克隆3送交北京诺赛基因组研究中心进行基因序列测定，测序结果显示，阳性克隆序列和已知TPMT460野生型序列完全一致，证明阳性质粒序列正确。7.阳性质粒大规模培养和纯化将筛选得到的阳性克隆接种1LLB培养基中，37'C摇床振荡培养过夜后，采用碱裂解法纯化质粒。低温(-20°C)冻存。实施例2下面以白血病患者基因的TPMT基因型检测过程为实施例对本发明作进一步的详细描述。白血病是造血系统的恶性疾病，俗称"血癌"，是国内十大高发恶性肿瘤之一，其特点为造血组织中某一类型的白血病细胞在骨髓或其他造血组织中的发生恶性增生，并浸润体内各脏器、组织，导致正常造血细胞受抑制，产生各种症状，临床表现以发热、出血、贫血、肝脾、淋巴结肿大为特点。白血病一般按自然病程和细胞幼稚程度分为急性和慢性，按细胞类型分为粒细胞、淋巴细胞、单核细胞等类型，临床表现各有异同之处。我国白血病约为34人/10万人口，小儿的恶性肿瘤中以白血病的发病率最高。据调査，我国10岁以下小儿白血病的发病率为2.28/10万，任何年龄均可发病，男性的发病率高于女性。嘌呤类药物，包括6-巯基嘌呤(6-MP)/6-巯代鸟嘌呤(6-TG)和巯唑嘌呤(AZA)是临床常用的肿瘤化疗药物，并且广泛用于治疗各种类型的白血病。他们通过干扰体内的核酸代谢，包括核酸的从头合成和补救合成途径发挥作用，它们均是无内在生物活性的药物，必须通过体内一系列代谢后才能发挥抗白血病效应。巯基嘌呤甲基转移酶基因型检测试剂盒的用途通过体外检测巯基嘌呤甲基转移酶的基因多态性，将区分为不同的基因型，根据基因型指导用药，以提高疗效和减少副作用。我们应用本试剂盒检测4个患者的巯基嘌呤甲基转移酶基因型，流程如下1.标本采集和处理1)釆集静脉血lml:EDTA抗凝(7.2mg/5ml全血)2.人全血中基因组DNA的提取1)取30(Hil红细胞裂解液加入100nl抗凝全血，37'C水浴5分钟，裂解红细胞。12000xg离心90秒，去上清；2)高速振荡10秒至离心管底部的白色沉淀消失；加入100nl白细胞裂解液，振荡30秒至液体均一，37'C水浴5分钟；3)加入35pl蛋白沉淀液，振荡20秒后，12000xg离心90秒，离心管底可见褐色沉淀。将上清液全部移入装有100nl异丙醇的1.5ml离心管中，混匀至有白色絮状物出现；12000xg离心90秒，离心管底部可见白色沉淀；4)弃上清液，加入100^175%乙醇，12000xg离心90秒；5)弃上清液，保留白色沉淀，于空气中干燥3分钟；6)加入提前预热至65。C的TE60pl，振荡混匀，65。C水浴5分钟；所得溶液即为的全血基因组DNA;7)用紫外分光光度计测定所得基因组DNA的浓度。浓度约为40ng/ml。3.聚合酶链式反应(PCR):1)按照表6配制PCR反应体系，分装于不同的0.2111101反应薄壁管中。每个薄壁管中加入矿物油5nl，进行PCR反应。表6PCR反应成分配制名称浓度用量0d)基因组DNA20ng/|al510xPCR缓冲液(含MgC12)10x2.5dNTP2.5mM2TPMT引物(F+R)20岸1Taq聚合酶0.2灭菌双蒸水14.3总计252)盖紧管盖，短暂离心使配制好的PCR混合物混匀，置于PCR扩增仪中按照如下程序进行扩增94。C预变性3分钟；94。C30秒，63°C45秒，72°C30秒，35个循环；72。C延伸7分钟。其中，每个DNA样本分别用460引物和719引物扩增两个基因片段，两个片段在统一PCR条件下扩增。针对460和719两个位点，PCR扩增分别得到大小为240bp(G460A)和242bp(A719G)的条带。结果见附图3、4。4.酶切反应参照表7和表8配成酶切反应体系，盖紧管盖，轻弹管壁混匀，置于各自适合的温度酶切。具体为对于G460A位点，60'C酶切2小时；A719G位点37'C酶切2小时。表7G460A酶切反应成分配制<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>5.琼脂糖凝胶电泳鉴定基因型用lxTBE电泳缓冲液配制3X琼脂糖凝胶，取酶切产物l(Hil，加入上样缓冲液，混匀后加样在3%琼脂糖凝胶上，于100V电压下电泳30分钟后，在凝胶成像系统中观察结果，并进行基因型分析。将两个突变位点综合，依据表9判定基因型。结果见附图5、6。TPMTG460A引物扩增得到含有G460A多态性位点的长度为240bp的基因片段，次片段经过限制性内切酶MwoI酶切后，如果此位点为含有碱基G的野生型，酶切得到大小为217bp+23bp的两个基因片段。如果为含有碱基A的突变型，则得到大小为240bp的基因片段。由于电泳本身的局限性，23bp大小的条带，有时候不很清晰。但是，在电泳中，酶切以后得到的217bp的片段和PCR产物240bp相比位置差异很大，并不影响基因型的判定。用TPMTA719G引物扩增后，得到含有A719G多态性位点的长度为242bp的基因片段，此片段经过限制性内切酶AccI酶切，如果此位点为含有碱基A的野生型，则酶切得到大小为242bp的基因片段，如果此位点为含有碱基G的突变型，则酶切得到180bp+62bp两个片段。基因组DNA经过PCR和酶切以后，在3%的琼脂糖凝胶上电泳分离所得到的片段。根据片段长度可以得到两个多态性位点的碱基类型，综合两个位点的碱基类型，根据表1就可以得到基因型。在实际的应用中，患者的基因型存在杂合型的情况，因此将电泳结果和基因型的对应情况做了详细的对应，具体结果参见表2。根据电泳结果可以看出，1号患者G460A片段酶切为217bp条带(见附图5)，A719G片段为1条带242bp(见附图6)，因此1号患者基因型为TPMT*1/*1野生型。2号患者G460A片段酶切240bp条带(见附图5)，A719G片段酶切2条带(见附图6)，由此判断2号患者为TPMT*3A/*3A纯合突变型。3号患者G460A片段酶切240bp和217bp两个条带(见附图5)，A719G片段2条带(见附图6)，判断3号患者为TPMT*3A/3C杂合型。4号患者基因型G460A片段酶切为217bp条带(见附图5)，A719G片段酶切2条带(见附图6)，为TPMT*3C/*3C纯合突变型。根据4个患者的基因型，推荐1号患者可以使用正常剂量的6巯基嘌呤，3号和4号患者要使用降低剂量的6巯基嘌呤；2号患者考虑换用别的药物治疗。表9:患者基因型判定标准<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><110>北京华安佛医药研究中心有限公司安徽省生物医学研究所<120>—种检测巯基嘌呤甲基转移酶基因型的试剂盒及方法<160〉4<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>1cagcgtagttggtgtggaaa20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>2gcgatcacctggattaatgg20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>3cacccagccaa加gagta20<210>4<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>4cctcaaaaacatgtcagtgtga2权利要求1.一种检测巯基嘌呤甲基转移酶基因型的方法，应用巯基嘌呤甲基转移酶基因多态性位点的特异性引物对样本DNA进行聚合酶链式反应，用限制性内切酶酶切扩增产物，根据酶切片段长度多态性判定基因型，其中引物至少包含检测巯基嘌呤甲基转移酶G460A多态性位点的特异性引物和检测A719G多态性位点的特异性引物。2.如权利要求l所述的方法，其特征在于聚合酶链式反应程序为94X:预变性3分钟；94。C变性30秒，55。C一65t:退火45秒，优选退火温度为63°C，72。C延伸30秒，25一35个循环；72"C延伸5—10分钟。3.如权利要求l所述的方法，其特征在于G460A多态性位点的正向引物为5，-CAGCGTAGTTGGTGTGGAAA-3';反向引物为5'-GCGATCACCTGGATTAATGG-3'。4.如权利要求l所述的方法，其特征在于所述的限制性内切酶为Mwol。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述的MwoI的酶使用量是0.5—10U，优选1U，酶切的时间是1一18小时，优选2小时。6.如权利要求l所述的方法，其特征在于A719G多态性位点的正向引物为5，-CACCCAGCCAATTTTGAGTA-3，；反向引物为5'-CCTCAAAAACATGTCAGTGTGA-3'。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的限制性内切酶为Accl。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述的Accl的酶使用量是O.5—10U,优选1U，酶切的时间是l-16小时，优选1小时。9.一种利用权利要求l所述的方法检测巯基嘌呤甲基转移酶基因型的试剂盒，含有检测巯基嘌呤甲基转移酶G460A和A719G多态性位点的特异性引物和限制性内切酶Mwol和Accl。10.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于G460A多态性位点的正向引物为5，-CAGCGTAGTTGGTGTGGAAA-3，；反向引物为5，-GCGATCACCTGGATTAATGG-3'。11.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于A719G多态性位点的正向引物为5，-CACCCAGCCAATTTTGAGTA-3，；反向引物为5，-CCTCAAAAACATGTCAGTGTGA-3，。12.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于所述的AccI的酶使用量是0.5—10U，优选1U;Mwol的酶使用量是O.5—10U，优选1U。13.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于至少含有巯基嘌呤甲基转移酶G460A多态性位点的野生型质粒DNA和巯基嘌呤甲基转移酶A719G多态性位点的突变型质粒DNA。14.如权利要求9所述的试剂盒，其特征在于含有DNA抽提试剂、PCR反应混合物、TaqDNA酶、酶切缓冲液和电泳上样缓冲液。15.如权利要求9-14中任一项所述的试剂盒在检测巯基嘌呤甲基转移酶基因型的用途。16.如权利要求9-14中任一项所述的试剂盒在预测嘌呤类药物不良反应的用途。17.如权利要求16所述的用途，其特征在于所述的嘌呤类药物是6-巯基嘌呤、6-巯代鸟嘌吟或巯唑嘌呤。全文摘要本发明属于基因
技术领域：
，涉及一种检测巯基嘌呤甲基转移酶基因型的方法及试剂盒。该方法应用巯基嘌呤甲基转移酶基因多态性位点的特异性引物对样本DNA进行聚合酶链式反应，用限制性内切酶酶切扩增产物，根据酶切片段长度多态性判定基因型，其中引物至少包含检测巯基嘌呤甲基转移酶G460A多态性位点的特异性引物和检测A719G多态性位点的特异性引物。采用本发明提供的方法和试剂盒进行基因型的检测，可以提供嘌呤类药物个体化用药指导意见；具有稳定、可靠、价格便宜、快速的优点，适于推广到临床使用。文档编号C12Q1/68GK101210268SQ20061016984公开日2008年7月2日申请日期2006年12月29日优先权日2006年12月29日发明者多于,暇吴,张彦明,徐希平,燕王,玉王申请人:北京华安佛医药研究中心有限公司;安徽省生物医学研究所