专利名称：一种生产大片吸虫组织蛋白酶l1的方法
技术领域：
本发明属于生物化学领域，尤其涉及酶的生产方法，特别是一种生产
大片吸虫组织蛋白酶L1的方法。
背景技术：
片吸虫病是由片形科片形属的大片吸虫和肝片吸虫寄生于牛羊等哺乳 动物的肝脏和胆管内而引起的一种片形吸虫病。能引起宿主急性或慢性肝 炎和胆管炎，并伴有全身性的中毒现象和营养障碍，危害相当严重，特别 对幼崽和绵羊，可以引起大批死亡。在慢性病程中，使牛羊消瘦、发育障 碍，生产力下降，并成为废物。该病在我国分布极其广泛，给畜牧业带来 极大绿济损失。该病也可感染人，严重影响人类的身体健康，是一种重要 的人畜共患病。
现有技术中，片形吸虫病的诊断分为临床诊断和实验室诊断。实验室
诊断又可分病原检查和免疫学检测。病原检査包括反复沉淀法，硝酸铅 漂浮法和尼龙筛集卵法，以上方法的检出率较低，而且易造成漏检，只有 当虫体在体内发育成熟时才能从粪便中检出虫卵，这时虫体在移行时对器 官己造成损伤，这样就延误了有效治疗时间而影响了对该病的控制。免疫
检测方法包括血凝试验(Indirect Haemagglutination, IHA)，酶联免 疫吸附试验(ELISA)，酶联免疫印渍技术(ELIB)和斑点免疫金渗漏法 (DIGFA)等，与病原检查相比，免疫检测方法具有检出率高，特异性强， 敏感性高等优点，但诊断用抗原基本上都是虫源的，其获取方法繁琐且无 法标准化。这又给片形吸虫病的确诊带来一定困难。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生产大片吸虫组织蛋白酶L1的方法，所述 的这种方法生产大片吸虫组织蛋白酶L1的方法要解决现有技术中用于诊 断片形吸虫病的抗原获取困难的技术问题。
本发明一种生产大片吸虫组织蛋白酶L1的方法，包括如下步骤
步骤l，根据大片吸虫组织蛋白酶Ll基因全长mRNA序列去除信号肽序 列，设计含BamH I和Sal I酶切位点的特异性引物，用PCR从大片吸虫 成虫c函A文库中扩增出如SEQ ID NO: 1所示的大片吸虫组织蛋白酶L1基 因；
步骤2，将组织蛋白酶Ll全长基因连接到一个载体上，形成重组载 体，用BamH I和Sal I分别酶切重组载体和表达载体，对酶切产物进行 纯化，然后用连接酶进行连接，形成重组质粒，将重组质粒转化入大肠杆 菌中进行增殖，PCR鉴定正确后，测序确认；
步骤3，取鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌，于含氨节的培养基培 养，一30^44'C摇菌至OD600值0.4 0.6时，加入IPTG使其终浓度为0. 8 一1.2mM，诱导表达，收集菌液，离心弃上清，备用；
步骤4，收集沉淀用尿素溶解，透析复性20—30h，滤膜过滤；
步骤5,把样品加入预先用水洗缓冲液处理好的蛋白纯化柱中，反复过 柱2—5.次，然后继续用水洗缓冲液冲洗，最后用洗脱缓冲液洗脱蛋白，得 到大片吸虫组织蛋白酶L1蛋白。
进一步的，所述的含BamH I I酶切位点的特异性引物为
5' -CGG GAT CCA ATG ATG ATT TGT GGC ATC A-3'，
所述的含Sal I酶切位点的特异性引物为
5' -ACG TCG ACT CAC GGA AAT CGT GCC AC-3'。进一步的，用PCR从大片吸虫成虫cDNA文库中扩增出大片吸虫组织蛋 白酶L1基因时的PCR参数为94°C、 5 min; 94°C、 30 s， 55°C、 30 s， 72°C、 2 min， 30个循环;72°C、 10 min。
进一步的，所述的重组载体为pMD18-T/FgCLl，所述的表达载体为 pGEX-4T-2。
进一步的，在所述的步骤2中，所述的大肠杆菌为DH5a 。 进一步的，在所述的步骤3中，所述的大肠杆菌为BL21。 进一步的，所述的培养基为2XYT培养基。 哮一步的，所述的大肠杆菌细胞的诱导温度为30。C。 进一步的，本发明还提供了大肠杆菌作为表达系统用来生产大片吸虫 组织蛋白酶L1的用途。
本发明的原理是半胱氨酸蛋白酶是一类蛋白水解酶，广泛地存在于寄生 虫体内，该酶涉及虫体的毒力、对组织和细胞的侵袭力和免疫逃避等多个方面。 组织蛋白酶L1在片形吸虫的童虫和成虫生长发育阶段都有表达，可作为片形吸 虫病早期诊断抗原。为了获得高表达的组织蛋白酶L1 (FgCLl)，本发明利 用大肠杆菌表达系统生产FgCLl蛋白，为片形吸虫病的早期诊断和防治奠 定了基础。由于目前组织蛋白酶L1已被视为重要的诊断抗原候选抗原之 一。本发明人在研究过程中，发现选择适当的表达载体，并利用大肠杆菌 表达系统进行表达，可以显著提高组织蛋白酶的表达水平，利用IPTG进行 诱导蛋白表达，可进一步诱导组织蛋白酶的高表达。
本发明采用的大肠杆菌表达系统由于E.coli易于培养、成本低，表达 蛋白可大量生产，又易于纯化，人们对其基因结构及表达调控原理有了较 多的了解，所以广泛的被人们采用，通常将外源基因导入到大肠杆菌中主要用于蛋白质的大量表达，在蛋白质的纯化、定位及功能分析方面有一定 的价值。
本发明和已有技术相比，其效果是积极和明显的。本发明利用大肠杆菌
表达系统表达了大片吸虫组织蛋白酶L1，并利用GST亲和层析的方法分离纯 化FgCLl，表达产量可达700mg/1，从而为片形吸虫病免疫诊断方法提供了便 利，是一种低廉且产量高的表达FgCLl的方法，其原核表达系统快速、简 单、低廉，有利于纯化，所得产物可以应用于片形吸虫病的免疫诊断。
图1为大片吸虫组织蛋白酶L1全长基因的电泳图，其中l， 2为 FgCLl扩增产物，3位空白对照，M为DNAMarker。
图2为pGEX/FgCLl重组质粒的双酶切图，其中M为DL2000, 1为PCR 产物，2为pMD18-T/FgCLl BamH I和Sal I双酶切产物，3为pGEX/FgCLl BamH I和Sal I双酶切的产物。
图3为pGEX/FgCLl重组质粒构建示意图。
图4为F,CL1的SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白Marker, 1为BL21 对照，2为未诱导的空载体，3为空载体诱导，4、 5、 6、 7、 8为FgCLl诱 导0.5、 1、 2、 3、 4h收集菌液。
图5为纯化后的FgCLl的SDS-PAGE电泳图，其中，1为空载体诱导， 2为纯化后的FgCLl融合蛋白，3为IPTG诱导pGEX-FgCLl/BL21， M为蛋白 Marker'。
图6为纯化蛋白Western blot图，其中1， 2为纯化蛋白，3为阴性 对照，M为蛋白Marker。
具体率施方式下面通过具体的实施例进一步说明本发明是如何实现的，以下说明不用于限 制本发明的保护范围。
实施例1重组质粒的构建
1.1组织蛋白酶L1全长基因的克隆
根据Gram等在GeneBank发表的大片吸虫组织蛋白酶Ll基因全长mRNA序 列，序列号是AF125566，设计一对含BamH I和Sal I酶切位点的特异性引物，
CAT1为5' -CGG GAT CCA ATG ATG ATT TGT GGC ATC A-3'
CAT2为5' -ACG TCG ACT CAC GGA AAT CGT GCC AC-3'
通过CAT1和CAT2从大片吸虫cDNA文库中扩增FgCLl基因序列。PCR参数 为94°C 5 min; 94°C 30 s， 55°C 30 s, 72°C 2 min， 30个循环；72°C. 10 min。袖PCR产物利用通过TA克隆连接到pMD18-T Vector上，PCR鉴定正确后 测序(如图l所示)。
1. 2 pGEX-FgCLl的构建
如图2、图3所示，用BamH I和Sal I分别酶切重组载体pMD18-T/FgCLl 和表达载体pGEX - 4T-2， 37。C水浴过夜后终止反应，用DNA胶回收试剂盒(购 自TaKaRa公司)回收FgCLl相应条带和pGEX-4T-2，纯化后的酶切产物用T4连 接酶进行连接，16。C连接过夜，形成重组质粒pGEX-FgCLl。
1. 3重组质粒的鉴定
将重组产物转化入感受态大肠杆菌DH5 a中，挑取氨苄抗性克隆 (100ug/ml)，接种于LB培养基，37'C振荡培养过夜，提取重组质粒，经PCR 鉴定正确后测序。
结果，测序证明并未发生移码突变。 1.4重组质粒的转化
取鉴定正确的重组质粒lul转化《coh' BL21 (DE3)中表达。实施例2细胞培养与蛋白诱导表达
挑取单克隆于含氨苄的2XYT培养基培养，37。C摇菌至0D值约0. 4、. 6 时，加入IPTG使其终浓度为lmM，继续摇菌4h，每小时收集lmL菌液，12000 r/min离心2 min。
诱导表达后蛋白电泳表明，在61KD位置有表达，见图4。
实施例3分离纯化
按上述方法对阳性克隆进行大量诱导表达后用溶菌酶加超声裂解菌体，经 8M尿素溶解，离心后将上清转移至透析袋，复性液中4。C透析24 h， 0.22um滤 膜过滤。然后参照High-Affinity GST Resin说明书进行融合蛋白的纯化。把样 品加入预先用Washing buffer处理好的蛋白纯化柱中，反复过柱3次，然后继 续用Washing buffer冲洗，后用Elution buffer洗脱蛋白，见图5。
实施例4;表达产物的生物特性鉴定
4. 1分子量测定
将收集的细胞沉淀加入1XSDS-PAGE电泳上样缓冲液振荡至细菌沉淀物完全 溶解，100 。C水浴5 min， 12000 r/min离心2 min，取上清进行SDS-PAGE电 泳。分离胶和积层胶的浓度分别为12%和5%，加样20uL、电压条件分别为 130V和80V，以低分子量标准蛋白作对照。考马斯亮兰染色lh，脱色液脱色数 次拍照。
4. 2抗原性检测
将收集的蛋白进行SDS-PAGE电泳后，100Vlh转移至硝酸纤维素膜(NC) 上，5。/。脱脂奶粉封闭液中孵育2h，与l: 200自然感染大片吸虫牛血清(畜禽寄 生虫病防治技术研究室采集)反应lh， PBST洗脱三次，每次10min，再与羊抗牛 IgG-服P 1:5000室温作用lh。 PBST洗漆三次后，置于底物溶液中显色。
Western blot显示61KD的蛋白能与自然感染大片吸虫牛血清结合，证明 61KD蛋白的确是组织蛋白酶L1，结果见图6。本发明组织蛋白酶Ll在大肠杆菌中的表达产量可达700mg/ral，并且有融合 标签，这就大大简化了纯化过程，给实践应用带来很大便利。
本发明利用大肠杆菌表达大片吸虫组织蛋白酶L1，包涵体经尿素变性，复 性后经GST亲和层析分离纯化。这是一种低廉且高产的表达FgCLl的方法，为产 业化生产奠定了基础。且大肠杆菌表达系统使用最早也研究最多，并且其遗传背 景相对比较清楚，大肠杆菌表达系统操作简便、廉价、使用安全、周期短等优 点。由于Acoh'易于培养、成本低，表达蛋白可大量生产，又易于纯化，人们 对其基因结构及表达调控原理有了较多的了解。
应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本 发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的 范围。序列表
〈110〉中国农业科学院上海兽医研究所
<120〉 一种生产大片吸虫组织蛋白酶L1的方法 <160> 1
<170〉 Patentln version 3. 1
〈210〉 1
<211> 933
<212> DNA
〈213〉 FgCLl
<400> 1
aatgatgatt tgtggcatca atggaagcga atgtacaata aagaatacaa tggggctgac 60 gatgaacaca gacgaaatat ttgggaagag aatgtgaaac atatccaaga acataaccta 120 cgtcactatc tcggcttcgc cacctacaca ttgggattga accaattcac tgatatgaca 180 ttcgaggaat tcaaggccaa atatctaaca gaaatgccac gcgcgtccga tatactctca 240 cacggtatcc cgtatgaggc gaacaatcgt gccgtacccg acaaaattga ctggcgtgaa 300 tctggttatg tgacggaggt gaaagatcag ggaaattgtg gttcatgttg ggcattctca 360 acaaccggta ctatggaagg acagtatatg aaaaacgaaa gaactagtat ttcattctct 420 gagcaacaac tggtcgattg tagcggtcct tgggg猫ta tgggttgcat gggcggattg 480atggaaaatg cttacgaata tttgaaacaa tttggattgg aaaccgaatc ctcttatccg 540
tacacggctg tggaaggtca gtgtcgatac aataggcagt tgggagttgc caaagtgacg 600
gactactata ctgtgcattc tggtagtgag gtagaattga aaaatctagt cggtgccgaa 660
ggacctgctg cggtcgctgt ggatgtggaa tctgacttca tgatgtacag tggtggtatt 720
tatcagagcc gaacttgttc atcgcttcgt gtgaatcatg cagtcttggc tgtcggttat 780
ggaacacaga gtggtactga ctattggatt gtgaaaaata gttggggatc gtcctggggt 840
gagcgtggtt acattcgaat ggttaggaac cgaggtaaca tgtgtggaat tgcttcgctg 900
gccagtctcc cgatggtggc acgatttccg tga 93权利要求
1.一种生产大片吸虫组织蛋白酶L1的方法，其特征在于所述的方法包括如下步骤步骤1，根据大片吸虫组织蛋白酶L1基因全长mRNA序列去除信号肽序列，设计含BamH I和Sal I酶切位点的特异性引物，用PCR从大片吸虫成虫cDNA文库中扩增出如SEQ ID NO1所示的大片吸虫组织蛋白酶L1基因；步骤2，将组织蛋白酶L1全长基因连接到一个载体上，形成重组载体，用BamH I和Sal I分别酶切重组载体和表达载体，对酶切产物进行纯化，然后用连接酶进行连接，形成重组质粒，将重组质粒转化入大肠杆菌中进行增殖，PCR鉴定正确后，测序确认；步骤3，取鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌，于含氨苄的培养基培养，30～44℃摇菌至OD600值0.4~0.6时，加入IPTG使其终浓度为0.8-1.2mM，诱导表达，收集菌液，离心弃上清，备用；步骤4，收集沉淀用尿素溶解，透析复性20-30h，滤膜过滤；步骤5，把样品加入预先用水洗缓冲液处理好的蛋白纯化柱中，反复过柱2-5次，然后继续用水洗缓冲液冲洗，最后用洗脱缓冲液洗脱蛋白，得到大片吸虫组织蛋白酶L1蛋白。
2. 如权利要求1所述的生产大片吸虫组织蛋白酶L1的方法，其特征在 于所述的含BamH I I酶切位点的特异性引物为5"-CGG GAT CCA ATG ATG ATT TGT GGC ATC A-3'，所述的含Sal I酶切位点的特异性引物为5' -ACG TCG ACT CAC GGA AAT CGT GCC AC-3'。
3. 如权利要求1所述的生产大片吸虫组织蛋白酶Ll的方法，其特征在于PCR参数为94°C、 5 min; 94°C、 30 s， 55°C、 30 s， 72°C、 2 min， 30个循环;72°C、 10 min。
4. 如权利要求1所述的生产大片吸虫组织蛋白酶L1的方法，其特征在 于所述的重组载体为pMD18-T/FgCLl，所述的表达载体为pGEX-4T-2。
5. 如权利要求1所述的生产大片吸虫组织蛋白酶U的方法，其特征在 于在步骤2中，所述的大肠杆菌为DH5a 。
6. 如权利要求1所述的生产大片吸虫组织蛋白酶L1的方法，其特征在 于在步骤3中，所述的大肠杆菌为BL21。
7. 如权利要求1所述的生产大片吸虫组织蛋白酶L1的方法，其特征在 于所述的培养基为2XYT培养基。
8. 如权利要求1所述的生产大片吸虫组织蛋白酶L1的方法，其特征在 于所述的大肠杆菌细胞的诱导温度为3(TC。
9. 大肠杆菌作为表达系统用来生产大片吸虫组织蛋白酶Ll的用途。
全文摘要
本发明公开了一种生产大片吸虫组织蛋白酶L1的方法，包括一个用PCR从大片吸虫成虫cDNA文库中扩增出大片吸虫组织蛋白酶L1基因的过程，一个构建含有组织蛋白酶L1全长基因的重组质粒的过程，一个将重组质粒转化入大肠杆菌中进行增殖的过程，一个诱导表达含有正确的重组质粒转化的大肠杆菌的过程，然后收集菌液，透析、过滤，最后将样品加入预先用水洗缓冲液处理好的蛋白纯化柱中，用水洗缓冲液冲洗，用洗脱缓冲液洗脱蛋白，得到大片吸虫组织蛋白酶L1蛋白。本发明的方法是一种低廉且产量高的表达组织蛋白酶L1的方法。本发明中组织蛋白酶L1在大肠杆菌中的表达量可达700mg/L，且易于纯化，便于投入实践应用中。
文档编号C12N15/57GK101294154SQ20071003998
公开日2008年10月29日 申请日期2007年4月25日 优先权日2007年4月25日
发明者何国声, 程 庞, 徐梅倩, 杰 曹, 朱顺海, 李家诚, 米荣升, 赵其平, 敏 郭, 高兴春, 燕 黄 申请人:中国农业科学院上海兽医研究所