专利名称：生产紫穗槐-4,11-二烯和青蒿酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产紫穗槐-4,ll-二烯的方法，具体涉及一种通过代谢工程技术 生产紫穗槐-4,ll-二烯的方法，以及进一步生产青蒿酸的方法。
背景技术：
青蒿素(artemisinin)是中国科学家自主开发的创新抗疟药，是中国唯一被世界卫 生组织(WHO)认可的按西药研究标准研究开发的中药，是中国仅有的两个收入世界药 典的中药之一 (另一为麻黄素)。近来还发现青蒿素具有抗癌、抗孕、抗血吸虫、抗 弓形虫和抗卡氏肺孢子虫肺炎等作用。不断扩展的适应证意味着需要一个稳定而充足 的青蒿素供应。
现在青蒿素的来源主要有如下四种方式。
第一种方式是直接从青蒿中提取，这种方式如今仍然是青蒿素的主要来源，但天 然青蒿中青蒿素含量很低(0.01% 0.6%，少数能达到1%)。此外，不同基因型青蒿 以及青蒿不同组织之间的青蒿素含量差异很大，青蒿虽为雌雄同株，但存在自交不亲 和性，因此这种遗传不稳定性是常规栽培中很难克服的难题。人工栽培青蒿还存在受 季节和气候条件限制等问题。所以，通过栽培扩大青蒿素的提取量，这种方式不能满 足人们对青蒿素日益高涨的需求。
第二种方式是通过化学全合成来生产青蒿素，但这种方式成本高，难度大，目前 还不能投入生产，基本上处于试验阶段。
第三种方式是通过细胞或愈伤组织来生产青蒿素。中国科学院植物研究所叶和春 领导的研究组曾通过培养青蒿发状根获取青蒿素，其青蒿素的含量可达550mg/L(Liu CZ, Wang YC, Ouyang F , Ye HC W Production of artemisinin by hairy root cultures of Artemisia annua L .Biotechnology Letters, 1997， 19(9) : 927-929)，但要进行商业化生 产还需要做很多工作。
第四种方式是通过代谢工程来生产青蒿素，这种方法主要是将青蒿素生物合成基 因在微生物中组合表达，在微生物中重新组建青蒿素生物合成途径，利用"微生物工 厂"来生产青蒿素。目前多在微生物中重新构建青蒿酸(artemisinic acid)生物合成途径， 利用重组菌生产青蒿酸，再以此为起始原料化学半合成青蒿素。
青蒿素的生物合成途径主要包括三大步骤由乙酰辅酶A形成法尼基焦磷酸 (farnesyl pyrophosphate,FPP)，再由FPP合成紫穗槐-4，ll-二烯(amorpha-4,ll-diene)， 由紫穗槐-4,ll-二烯形成青蒿酸，进而形成青蒿素。目前基本上认可的青蒿素生物合 成途径如下FPP在紫穗槐-4，ll-二烯合酶(amorpha-4，ll-diene synthase, ADS)的催化 下合成紫穗槐-4,ll-二烯；紫穗槐-4,ll-二烯通过羟基化形成青蒿醇(artemisinic alcohol),进而被氧化形成青蒿醛(artemisinic aldehyde);紧接着，青蒿醛Cn-Cu位
被还原形成二氢青蒿醛，后者再氧化形成二氢青蒿酸。其中紫穗槐-4，ll-二烯氧化形 成青蒿醇、进而形成青蒿酸的反应由紫穗槐-4,ll-二烯P450羟基化酶(CYP71AV1) (Teoh KH, Polichuk DR, Reed DW， / ， Artemisia annua L. (Asteraceae) trichome-specific cDNAs reveal CYP71AV1, a cytochrome P450 with a key role in the biosynthesis of the antimalarial sesquiterpene lactone artemisinin FE1551 Ze".2006， 580(5):1411-1416)催化。
申请日为1999年8月27日、授权给吉诺克里普生物技术有限公司的中国专利 CN1253573C(专利号ZL 99811714.5)中公开了一种编码紫穗槐-4,ll-二烯合酶的DNA 序列，并提到可以用该DNA序列转化宿主细胞、组织或生物体，利用其表达的紫穗 槐-4,ll-二烯合酶催化形成紫穗槐-4,ll-二烯，分离所形成的紫穗槐-4，ll-二烯并将其 转化为青蒿酸。但是在其实施例6中只是公开了在体外将大肠杆菌表达的紫穗槐-4，11-二烯合酶与a-环糊精、(3-环糊精、Y-环糊精一起温育来产生青蒿酸的实验步骤，并没 有给出具体的实验数据，更没有数据显示在大肠杆菌中实现了青蒿酸的生成。
申请日为2003年4月9日的Keasling， J等人的美国专利申请No.20040005678公开了 一种在宿主微生物中合成紫穗槐-4,ll-二烯的方法，其中使用合成的优化紫穗槐-4，11-二烯合酶基因，并在说明书中给出了具体在大肠杆菌中进行优化的紫穗槐-4，ll-二烯 合酶基因的序列。
2003年，Martin V J等人(Martin V J， Pitera D J， Withers ST" a/, Engineering a mevalonate pathway in EscAer/c/z co// for production of terpenoids, iVaft#*e 2003, 21:796-803)报道了在大肠杆菌中合成甲羟戊酸的编码基因以及紫穗槐-4,ll-二 烯合酶基因等9个基因，在大肠杆菌中重建甲羟戊酸途径和紫穗槐-4,ll-二烯的合成途 径，并获得了青蒿素中间产物紫穗槐-4,ll-二烯。
2006年，Lindahl A L等人在酿酒酵母中导入含紫穗槐-4,11 -二烯合酶基因的质粒， 或将紫穗槐-4,ll-二烯合酶基因同源整合到酿酒酵母的染色体上，这两种方式分别能 获得600和100吗/1的紫穗槐-4，11-二烯(Lindahl Ann-Louise， Olsson M E., Mercke P， W a/, Production of the artemisinin precursor amorpha-4,ll-diene by engineered Sacc/wro附yces cerev/w'ae， 5/otec/ wo/ogy丄e"ens， 2006， 28:571 — 580)。这是第一7火 在真核生物中组合表达出紫穗槐-4,11 -二烯。 ，
2006年，RoDK等人以酿酒酵母(Sacc/ aTO附yc^cwev/w'fle)为宿主，通过三个 步骤构建产青蒿酸酵母工程菌首先，工程化改造FPP生物合成途径以增加FPP的 合成并降低其用于甾醇合成的消耗；其次，导入来自青蒿的紫穗槐-4，ll-二烯合酶基 因(ADS)到上述FPP高产菌株，产生紫穗槐-4,ll-二烯；再其次，向紫穗槐-4，ll-二烯 产生菌中导入来自青蒿的紫穗槐-4,ll-二烯P450羟基化酶(CYP71AV1)基因，以及 该酶的天然氧化还原酶伴侣NADPH :细胞色素P450氧化还原酶(NADPH : cytochrome P450 oxidoreductase， C尸W)基因，CYP71AV1完成由ADS到青蒿酸的三步 催化反应。通过工程化的上述生物合成途径等，合成了青蒿酸(RoDK,ParadiseEM., Ouellet M ef a/， Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast，胸,，2006, 440:940-943)。
发明内容
本发明人发现在Ro， DK等人构建的酵母青蒿酸工程菌中，ADS基因和 CYP71AV1基因的表达采用的是GAL1诱导性启动子，截短的HMG-CoA还原酶(即 羟甲基戊二单酰辅酶A还原酶)tHMGR和FPP合酶(FPPS)基因整合在同一种位 点即S序列上。这种情况下后整合的基因有可能取代已经整合上的基因，导致后者拷 贝数降低。
为了解决上述问题，本发明人进行了大量的研究，提供了通过代谢工程技术途径 在酿酒酵母中合成紫穗槐-4,ll-二烯和青蒿酸的方法。
在本发明的一个方面中，提供了一种在酿酒酵母细胞中生产紫穗槐-4,ll-二烯的 方法，包括下列步骤
i) 将HMG-CoA还原酶基因导入酿酒酵母细胞中的第一位点；
ii) 将FPP合酶基因和紫穗槐-4，ll-二烯合酶基因一起导入酿酒酵母细胞中的第二 位点，即得紫穗槐-4，ll-二烯酵母工程菌；
iii) 培养步骤(ii)中的紫穗槐-4,ll-二烯酵母工程菌，并纯化紫穗槐-4，ll-二烯； 其中所述第一位点和第二位点选自S序列、入DNA序列和HO位点，且彼此不同。
在上述方法中，为了增加外源基因的整合拷贝数，选择酵母S序列和入DNA， S序列在酵母中存在大约425个拷贝，而ADNA在酵母中有大约200个拷贝，将基 因整合到这两个位点，能显著地增加外源基因的拷贝数。此外，酵母HO位点也是常 用的酵母整合位点，试验表明，在HO位点整合外源基因对酵母的生长不会有影响。 将多个外源基因依次整合到同一位点(如5序列或入DNA),会导致原先整合的基因 拷贝数降低，而且外源基因前后排列在同一位点也容易出现剪切重组，导致整个外源 片段从染色体上剪切掉。因此，在同一酵母染色体上将不同的外源基因整合到不同的 位点有助于克服这些缺陷。本发明将青蒿酸生物合成途径的不同酶基因分别整合在S 序列、XDNA和HO位点上，这样减少了基因之间互相替换的风险。
在上述方法中，上调负责FPP合成的基因的表达是为了显著增加FPP的产量。 在酿酒酵母FPP的合成中，HMG-CoA还原酶是一个限速酶，过表达HMG-CoA基因 能显著增加FPP的产量，而增加FPP合酶的拷贝数也能促进紫穗槐-4,ll-二烯的产量。
在一个优选的实施方案中，所述的第一位点是HO位点，第二序列是入DNA序列。
在另一个优选的实施方案中，所述的HMG-CoA还原酶基因、FPP合酶基因和紫 穗槐-4,ll-二烯合酶基因分别与强启动子可操作的连接，所述启动子优选为ADH或 GAPDH启动子。
在本发明的再一优选实施方案中，所述的FPP合酶基因和紫穗槐-4，ll-二烯合酶 基因之间插入有一段连接序列，优选是编码Gly-Ser-Gly的GGATCCGGA。
另外，为了提高CYP71AV1和P450还原酶CPR的电子耦合能力，在这两个酶 之间也加入了一段连接序列。该序列优选是编码Pro-Arg-Ala的CCTAGGGCT。
在又一优选实施方案中，所述的紫穗槐-4,ll-二烯合酶基因含有SEQ ID NO: 1
所示的核苷酸序列。该序列是通过利用 Condon Usage Database (http:〃www.kazusa.or.jp/codon/)等，将青蒿紫穗槐-4，ll-二烯基因(GenBank注册号 AF138959)的一些密码子替换为酿酒酵母细胞所偏好的密码子而产生的。
SEQIDNO: l所示的核苷酸序列编码SEQIDNO: 2所示的氨基酸序列，该序 列与GenBank注册号为AAF61439的序列区别在于SEQ ID NO: 2在第24位由苯 丙氨酸变成了丝氨酸;158位由异亮氨酸变成苏氨酸；379位由赖氨酸变成天冬酰胺； 412位由甘氨酸变成天冬氨酸；443位由天冬酰胺变成天冬氨酸；538位由丝氨酸变 成苏氨酸；541位由缬氨酸变成甘氨酸；546位由异亮氨酸变成亮氨酸。 SEQ ID NO: 1序列的合成可使用SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 44通过PCR来合成，
合成示意图见图3。具体方法如下将整个片段分成前后两个部分分别合成，然后通
过酶切使两个片段连接成一个完整的片段。将SEQ ID NO: 3 SEQIDNO: 24混合，
按如下体系(SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:24各luL， Buffer: 5uL, dNTP:4uL，
pfuTaqE:l"L， 50uL体系)和PCR程序(95°C， 5min; 95°C， 30S， 60°C， 30S，
72°C， 30S， 30 cycles; 72°C， 7min; 4°C， +°°)进行扩增，得到一条长约885bp的
条带，TA克隆，得到载体pMD-FllRll;将SEQ ID NO:25 SEQ ID NO:44混合，
按如下体系(SEQIDNO:25 SEQIDNO:44各luL, Buffer: 5wL, dNTP:4liL，
pfuTaqE:lliL, 50uL体系)和PCR程序(95°C， 5min; 95°C， 30S， 60°C， 30S，
72°C， 30S， 30 cycles; 72°C， 7min; 4°C， +°°)进行扩增，得到一条长约803bp的
条带，TA克隆，得到载体pMD-F21R21;将pMD-FllRll和pMD-F21R21送样测序，
与设计的完全吻合。用SamHI/Sall分别酶切pMDFllRll和pMECA，连接成载体
pMECAFllRll。用SpW/WoI分别酶切pMD18F21R21禾Q pGEM7zf，连接成载体
pGEM-F21R21 。用^6al/Smal分别酶切pMECAFllRll和pGEM-F21R21 ，连接成载
体pMECAADSm，其中包含完整的SEQ ID NO: 1序列。
在本发明的另一个方面中，提供了一种在酿酒酵母细胞中生产青蒿酸的方法，包 括下列步骤
i) 根据上述生产紫穗槐-4,ll-二烯的方法中步骤i)和ii)所述构建紫穗槐-4,11-
二烯酵母工程菌；
ii) 将CYP71AV1 P450基因和P450还原酶CPR基因一起导入酿酒酵母细胞中的 第三位点，即得青蒿酸酵母工程菌；
iii) 培养步骤(ii)中的青蒿酸酵母工程菌，并纯化青蒿酸； 其中所述第三位点选自S序列、入DNA序列和HO位点，与生产紫穗槐-4,ll-二
烯的方法中所述的第一位点或第二位点相同或不同。
8在上述方法的一个优选方案中，所述的第三位点是s序列。
在另一个优选实施方案所述的HMG-CoA还原酶基因、FPP合酶基因和紫穗槐 -4，ll-二烯合酶基因、CYP71AV1 P450基因和P450还原酶CPR基因分别与强启动子 可操作的连接，所述强启动子优选为ADH或GAPDH。
在再一优选实施方案中，所述的FPP合酶基因和紫穗槐-4,ll-二烯合酶基因之间 插入有一段连接序列。该序列优选是编码Gly-Ser-Gly的GGATCCGGA。
另外，为了提高CYP71AV1 P450和P450还原酶CPR的电子耦合能力，在这两 个酶之间也加入了一段连接序列。该序列优选是编码Pro-Arg-Ala的CCTAGGGCT。
在又一优选实施方案中，其中所述的紫穗槐-4，ll-二烯合酶基因含有上述SEQID NO: l所示的核苷酸序列。
在酵母中，酵母鲨烯合酶和紫穗槐-4,ll-二烯合酶竞争性地以FPP为底物，催化 FPP生成鲨烯，进而生成麦角甾醇。因此除了上调能促进FPP合成的基因的表达外， 在本发明的另一个优选实施方案中，本发明还下调了酵母鲨烯合酶基因的表达。在本 发明的最优选实施方案中，通过同源整合技术构建将酵母中控制麦角甾醇合成的一个 关键酶基因鲨烯合酶基因阻断，减少酵母中转向麦角甾醇代谢流FPP的量，从而增 加青蒿酸代谢流中FPP的供应。
在本发明的另一个方面中，提供了一种生产青蒿酸的酿酒酵母(Sflcc/^ramj;c" cewv/w'w)菌株，该菌株通过下列步骤获得
i) 根据上述生产紫穗槐-4,ll-二烯的方法中步骤i)和ii)所述构建紫穗槐-4,11-二烯酵母工程菌；
ii) 将CYP71AV1 P450基因和P450还原酶CPR基因一起导入酿酒酵母细胞中的 第三位点；
其中所述第三位点选自S序列、XDNA序列和HO位点，与生产紫穗槐-4,ll-二 烯的方法中所述的第一位点或第二位点相同或不同。
在一个优选的实施方案中，上述酵母菌株是WHTAsquFPR。该酵母菌株已于 2006年11月10日于地址为北京市海淀区中关村北一条13号(中国科学院微生物研 究所，邮编100080)的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)， 提交保藏，保藏编号为CGMCCNo.1861。
在本方面的另一个方面中，还提供了另一种在酿酒酵母细胞中生产紫穗槐-4，11-二烯的方法，包括下列步骤
i) 将HMG-CoA还原酶基因和FPP合酶基因一起以附加体形式导入酿酒酵母细 胞中；
ii) 将紫穗槐-4,ll-二烯合酶基因以附加体形式导入酿酒酵母细胞中，即得紫穗槐 -4，ll-二烯酵母工程菌；
iii) 培养步骤(ii)中的紫穗槐-4，ll-二烯酵母工程菌，并纯化紫穗槐-4,ll-二烯。
在本发明的另一个方面中，还提供了另一种在酿酒酵母细胞中生产青蒿酸的方 法，包括下列步骤
i)将HMG-CoA还原酶基因和FPP合酶基因一起以附加体形式导入酿酒酵母细
胞中；
ii) 将紫穗槐-4，ll-二烯合酶基因和CYP71AVl P450基因以附加体形式导入酿酒 酵母细胞中，即得青蒿酸酵母工程菌；
iii) 培养步骤(ii)中的青蒿酸酵母工程菌，并纯化青蒿酸。 在本发明的另一个方面中，提供了一种生产青蒿素的酿酒酵母(5^ctoro/K>;cw
cwei^Zae)菌株，该菌株通过下列步骤获得
0根据上述生产紫穗槐-4，ll-二烯的方法中步骤i)和ii)所述构建紫穗槐-4,11-二烯酵母工程菌；
ii)将CYP71AV1 P450基因和P450还原酶基因一起导入酿酒酵母细胞中的第三 位点。
在一个优选的实施方案中，上述酵母菌株是酿酒酵母(&cc/wraw;;cescewv/w'ae) 菌株WHTFPR。该酵母菌株已于2006年11月8日于地址为北京市海淀区中关村北 一条13号(中国科学院微生物研究所，邮编100080)的中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心(CGMCC)提交保藏，保藏编号为CGMCCNo.1857。
另外，本发明还提供了一种优化的DNA序列，其含有SEQIDNO: 1所示的核 苷酸序列。
本发明还涉及一种DNA载体，其包含上述优化的DNA序列。 本发明还涉及一种宿主细胞，其包含上述的DNA载体。在一个优选的实施方案 中，该宿主细胞是酿酒酵母细胞。
在一个更为优选的实施方案中，所述酵母菌株是酿酒酵母(5Wcctora/^c^ cercv/s/oe)菌株WHTAsquFPR，保藏日期2006年11月10日；保藏单位中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市海淀区中关村北 一条13号(中国科学院微生物研究所，邮编100080)，保藏编号为CGMCCNo.1861。 在另一个更为优选的实施方案中，所述酵母菌株是酿酒酵母(Sacc^raw_ycM cerev/w'ae)菌株WHTFPR，保藏日期2006年11月8日；保藏单位中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市海淀区中关村北一条 13号(中国科学院微生物研究所，邮编100080);保藏编号CGMCCNo.1857。
图l:在酵母中重构的青蒿酸合成途径。
图2: PCR扩增的FPP合酶基因，其中l是对照；2是FPP合酶基因PCR结果。 图3: SEQIDNO:l的合成示意图，上图是SEQ ID NO:l 5'端序列合成的示意下图是SEQIDNO:l 3'端序列合成的示意图；其中F表示正向引物;R表示
反向引物。
图4: pYeDP60/G/ADS酶切结果，其中，1禾H 2是pYeDP60/G/ADS的￡coR I单
酶切结果；M是DL15000。 图5: pGBT9/A/HMGOFPP HK^果，其中1是pGBT9/A/HMG/G/FPPfi^R I ZftT I结果；2 是pGBT9/A/HMQ^FPP/^ I ^H切结果；3是pGBT9/A/HMCVG^PPfiwR I ^tBg果。
图6: SQS3/SQS4 PCR的结果，其中1表示引物SQS3/SQS4 PCR的结果；M表 示DL2000。
图7: SQS5/SQS6PCR的结果，其中1表示引物SQS5/SQS6 PCR的结果；M表 示DL2000。
图8: SQS和S序列PCR的结果，其中1表示S 1/5 2扩增的结果；2表示S 3/ S 4扩增的结果；3表示SQS1/SQS2PCR的结果；4表示SQS3/SQS4扩增的结 果。
图9: p4297SQS的JKw I单酶切结果，其中1-3表示三个p4297SQS质粒的JRw
I单酶切结果；M表示DL 15000。 图10: ADS基因菌落PCR结果，其中，l-9表示九个WHT[HMG+FPP+AS]工程
菌克隆中的ADS基因菌落PCR结果；M表示DL2000。 图11: HMGR基因菌落PCR结果，其中，1-9表示九个WHT[HMG+FPP+AS]
工程菌克隆中的HMGR基因菌落PCR结果；M表示DL2000。 图12: FPPS基因菌落PCR结果，其中，1-9表示九个WHT[HMG+FPP+AS]工
程菌克隆中的FPPS基因菌落PCR结果；M表示DL2000。 图13:S.cewv/wfle[pGBT9/A/HMG/G/FPP，pYeDP60/G/ADS/P450]菌落PCR结果，
其中CK是对照；1-12表示12个转化子ADS基因菌落PCR结果。 图14:S.cewv/w'ae[pGBT9/A/HMG/G/FPP， pYeDP60/G/ADS/P450]菌落PCR结果，
其中CK是对照；1-11表示11个转化子CYP71AV1基因菌落PCR结果。 图15: FPPS基因菌落PCR结果，其中，1-9表示九个WHT[HMG+FPP+AS+P450]
工程菌克隆中的FPPS基因菌落PCR结果；M表示DL2000。 图16:HMGR基因菌落PCR结果，其中，l-9表示九个WHT[HMG+FPP+AS+P450]
工程菌克隆中的HMGR基因菌落PCR结果；M表示DL2000。 图17: A-C表示紫穗槐-4，ll-二烯酵母工程菌的GC-MS结果。 图18:青蒿酸酵母工程菌WHTFPR发酵提取物的傅立叶转换回旋共振质谱结果。 图19: p4366-HMG Sfl/I酶切结果，其中，1-3表示三个p4366-HMG质粒；M 表示人////"(1111。
图20: p4366-HMG 5wwH I酶切结果，其中，1-3表示三个p4366-HMG质粒； M表示入/77/wd111。
图21: ADNAPCR结果，其中1表示引物1/2扩增的结果；2表示引物3/4扩增 的结果；M表示DL2000。
图22:酵母FPPS PCR的结果，其中，1表示酵母FPPS PCR的结果；M表示 DL2000。
图23: pAFSm 5flwHl/^7wI双酶切结果，其中，1-6表示6个pAFSm质粒； Ml表示X /州mJIII; M2表示DL2000。
图24: pAFSmWo I单酶切结果，其中，1-6表示6个pAFSm质粒；Ml表示入 /历wdlll; M2表示DL15000。
图25: pAFSm5amH I单酶切结果，其中，1-6表示6个pAFSm质粒；Ml表示
入/W/ndlll; M2表示DL15000 。
图26: pAFSmU/5g/II单酶切结果，其中，1表示pAFSmU/%/11 I单酶切结果；
Ml表示DL15000。
图27: pAFSmU/^h H I单酶切结果，其中，1表示pAFSmU/BawH I单酶切结 果；Ml表示DL15000。
图28: pAFSmU/入1万g/II单酶切结果，其中，1-5表示5个pAFSmU/A 1质粒； Ml表示A /历'"dlll; M2表示DL15000。
图29: pAFSmU/入1MmI单酶切结果，其中，1-5表示5个pAFSmUA 1质粒； Ml表示A ////"dill; M2表示DL2000。
图30: pAFSmU-入1/户rall单酶切结果，其中，1-5表示5个pAFSmU/入1质粒； Ml表示DL15000; M2表示DL2000。
图31: pMECAA2/5WI单酶切结果，其中，l-6表示6个pMECA入2质粒；Ml 表示入/7//^1111; M2表示DL2000。
图32: pAFSmU-入/SacII单酶切结果，其中，1-3表示3个pAFSmU-入质粒Soc II单酶切结果；M表示DL15000。
图33:整合型紫穗槐-4,ll-二烯酵母工程菌的GC-MS结果。
图34: P4501/P4502 PCR结果，其中1表示引物P4501/P4502 PCR结果；M表 示DL 15000。
图35: rel/re2 PCR结果，其中1表示引物rel/re2 PCR结果；M表示DL15000。
图36: pADHP450re/Xho I单酶切结果，其中，1表示pADHP450re/Xho I单酶 切结果；M表示X/预'miin。
图37: pAP450re S URA/ 单酶切结果，其中，1表示pAP450re S URA/万g/ II单酶切结果；M表示X /历wdHI。
图38:整合型青蒿酸酵母工程菌发酵提取物的傅立叶转换回旋共振质谱结果。
具体实施例方式
以下通过合成紫穗槐-4,ll-二烯和青蒿酸的优选实施例并结合附图具体说明本发 明的各个方面和特征。这些实施例的基本方案如图1所示。本领域的技术人员应该理 解，这些实施例只是用于说明目的，而不限制本发明的范围。本发明的保护范围只受 权利要求书的限制。在不背离权利要求书范围的条件下。本领域的技术人员可以对本 发明的各个方面进行各种修改和改进，这些修改和改进也属于本发明的保护范围。例 如，将实施例中所使用的启动子和表达载体替换为本领域中常用的其他启动子和表达 载体，是本领域的普通技术人员所能够理解并实现的。
另外，需要注意的是，除非特别指明，下面实施例中所用的各种材料和试剂都是 本领域中常用的材料和试剂，可以通过常规的商业途径获得；所用方法均为本领域技 术人员公知的常规方法。
实施例l:青蒿酸合成途径相关基因的获得 ,母，絲基,获獰
直接利用酵母WHT (法国DrWerck-Reichhart馈赠)基因组DNA为模板，用引物 YFS1/4 (YFS1: 5' -GGTATTGGACTGACATAGGC-3' ; YFS4; 5'-CATGGTCCTTATCTAGTTTGAAAT陽3')进行第一轮PCR (95°C， 5min; 95°C， 30S， 49°C， 1.5min， 72°C， 1.5min, 30cycles; 72°C， 7min; 4°C， +°°)。利用第一 轮PCR产物为模板，用引物YFS2/3 (YFS2:5' "GGCTAGCGAAAAAGAAATTAGG AGAGA-3' ; YFS3:5'-GGTCGACCTATTTGCTTCrCTTGTAAAC-3')进行NEST-PCR 扩增(95°C， 5min; 95°C， 30S， 54°C， 1.5min， 72°C, 1.5min， 30cycles; 72°C, 7min; 4'C， +~),得到一条长为1059bp的片段(图2)。 TA克隆，得到载体pMD-FPP,经 测序发现，与已经发表的FPP合酶基因(GenBank注册号J05091) —致。
^母/ZMG-Ca4 i 嚴蘑基腐游获淳
根据酵母HMG-CoA还原酶基因(GenBank注册号M22002)设计引物HMGI( 5，-GGATCCAAGAAGTCTTACTG-3，)和腹G2(5，-GGCTAGCAAGAGAATACCAATG ACGT-3')，分别引入5amH I和A^e I位点。以酵母基因组DNA为模板，用引物 HMGI/HMG2通过PCR扩增(95°C， 5min; 95°C, 30S， 48°C， 2min， 72°C， 2min， 30 cycles; 72°C， 7min; 4°C， +°°)得到长度为1583 bp的HMG还原酶催化结构域 基因片段，TA克隆得到含HMG-CoA还原酶基因的载体pMD-HMG，经测序发现， 和已经发表的HMG-CoA还原酶基因(GenBank注册号M22002)—致。
蒙,實蘼膝^U7-二靡会蘼基厉游获淳浙沐众
禾U用Condon Usage Database(http:〃www.kazusa.orjp/codon/)，将青蒿紫穗槐-4，ll画 二烯基因(GenBank注册号AF138959)的一些密码子替换为酿酒酵母细胞所偏好 的密码子，产生优化的序列SEQIDNO: 1。
靜尸柳《1T7L4F"基娜,淳
利用AR12 (AR12: 5'-GACATAACACTTTACACGATATTAT-3')为引导引物，进 行cDNA第一条链的合成(50°C， 60min);利用引物AR11/8 (AR8: 5'-CTAGAAAC TTGGAACGAGTAACAAC-3，； AR11: 5'-GAGTATACTAAAAGCAATGG隱3')配对进行 第一轮PCR (95°C， 5min; 95°C， 30S， 45°C， 2min， 72°C， 2min， 30cycles; 72°C， 7min ; 4°C， +~);以第一轮PCR产物为模板，用AR7/15引物(AR7: 5'-GGGATCCATGGCACTCTCACTGACCAC陽3，； AR15: ( 5'-GGT
CGACCTAGAAACTTGGAACGAGTAA-3')配对进行第二轮PCR扩增(95'C， 5min; 95°C, 30S， 56°C， 2min， 72°C， 2min,30 cycles; 72°C， 7min; 4°C， +°°)，得到一 条长为1467bp的片段，TA克隆，得到载体pMD-P450，测序发现，与已经发表的青蒿 CYP71 P450基因存在4个碱基的差异(SEQ ID NO: 48 )。于是，以AR7 ( 5'-GGGATCCATGG CACTCTCACTGACCAC陽3， ) 和 AR15
(5'-GGTCGACCTAGAAACTTGGAACGAGT AA-3')为引物，青蒿cDNA为模板， 前后扩增三次(95°C， 5min; 95。C， 30S， 56°C， 2min， 72°C， 2min,30 cycles; 72°C， 7min; 4'C， +~)，均发现与已经发表的CYP71AV1 P450有四个碱基的差异，由此 断定我们这些差异是我们所用的青蒿中CYP71AV1 P450基因的真实序列，而并非由于 PCR操作所引入的。
競節0还嚴艨CPi 基,莸淳
根据已经发表的青蒿P450还原酶CPR基因(GenBank注册号DQ318192)，设 计引物reductase 1 (5 ，-ATGCAATCAACAACTTCCG-3，)； reductase2(5 ，- ATGATACATCT GTTGCCACTCC陽3，)； reductase3(5，-ATGGAGGGAAAGGAGGTG陽3'); reductase4(5，-TTACCATACATCCCGGAGATATC-3')。利用reductase 1/reductase3为引 物，青蒿cDNA为模板，PCR扩增(95°C， 5min; 95°C， 30S， 46°C， 2min， 72°C， 2min， 30 cycles; 72°C， 7min; 4°C, + 0，得到一条长U80bp的条带，T-A克隆， 得到载体pMDrel/3，送样测序，与经发表的青蒿P450还原酶基因5'端1180bp完全 一致；利用reductase2/reductase4为引物，青蒿cDNA为模板，PCR扩增(95°C， 5min; 95°C， 30S， 50°C， 2min， 72°C， 2min， 30 cycles; 72°C， 7min; 4°C， +°°)，得到 一条长1334bp的条带，T-A克隆，得到载体pMDre2/4,送样测序，与经发表的青蒿 P450还原酶基因3'端1334bp完全一致。用M/el/尸Wl分别酶切pMDrel/3和 pMDre2/4,连接成载体pMDre，其中包含完整的P450还原酶基因(SEQ ID NO: 49)。
实施例2:载体的构建
#，絲續颠MG-Ca4練基鹏就菱伴游辦 ^a4iW^动请辦; G^PZ)i/股J離逮
用引物GAPDH2/3 ( GAPDH2: 5，-GGGATCCGCTAGCCATTTTGTTTGTTTAT G-3'; GAPDH3:5，-CCTCGAGTTTATCATTATCAA-3，)扩增酵母的GAPDH启动子， "T/A"克隆到pMD-18T (购自大连宝生物公司)中，测序正确；用￡coR I+^Y&a I 酶切平端化处理，然后连接，这样获得的pGAPDH (EX)载体含有酵母GAPDH启 动子，消除了五②R I和力a I中间的其他位点，而又恢复保留了 ￡coR I、 I位 点。
^^P户^朦基厉浙FMG-Q^ #朦基厉游表这载沐/ (^7%4/^^(3;/(3:/ 7^游称遂
用M e I +iV I酶切pMDFPP，然后亚克隆到用Mze I十尸W I酶切的pGAPDH(EX) 中，连接得到载体pG/FPP;再用EcoR I +尸对I酶切pG/FPP，亚克隆到用￡coR I +户对 I酶切的pGBT9/A/HMG中，得到pGBT9/A/HMG/G/FPP，这样得到的载体中含有 HMG-CoA还原酶和FPP合酶两个基因，而且每个基因前面都含有酵母启动子和终止 子。其中，HMG-CoA还原酶基因上游是ADH启动子，FPP合酶基因上游是GAPDH 启动子。
#微膝《"-二靡絲基娜载沐-i)層/G/孺婦遂
先用力fll和五coRI酶切pMD-ADS，平端化处理，连接，得到pMDADS(EX)，
再用J^o I酶切平端化处理，连接。然后含紫穗槐-4,ll-二烯合酶(ADS)基因的 pMD-ADS(EXX)用5a附H I + ￡coR I直接亚克隆到同样用5awH I +五coR I酶切的 pYeDP60/GAPDH中，得到含ADS基因的表达载体pYeDP60/G/ADS。在这个载体中， ADS基因前面是GAPDH启动子。
二靡^蘑基像浙CKVL4W基厉游载银 plfeZ)，/GZ4Z)5ZP柳游称虜
用5fl附H I + I酶切pMD-P450，亚克隆到5amH I + ^Tzo I酶切的质粒 pGEM-ADH1346上，而后用I单位点把整个融合基因亚克隆到用^Tzo I酶切的 pYeDP60/GAPDH/ADS中，得到载体pYeDP60/G/ADS/P450，其中含紫穗槐-4，ll-二 烯合酶基因和青蒿P450 CYP71AV1基因。
教载鄉鉴定
表达载体pYeDP60/G/ADS和pGBT9/A/HMG/FPP构建好后，转化大肠杆菌，氨 苄青霉素抗性筛选，挑取阳性克隆，摇菌，提质粒，分别用进行酶切鉴定。
pYeDP60/G/ADS理论上长约ll.Okb，用￡coR I单酶切，切出来的片段与理论上 大小一样，由此确定pYeDP60/G/ADS构建成功(图4)。
pGBT9/A/HMG/G/FPP理论大小10.7kb，用尸M酶切出来的片段与理论大小一致， 用五coRl/尸对I酶切出两个片段，大小约9kb和1.7kb，从图上来看，与理论值完全 吻合(图5)。由此确定pGBT9/A/HMG/G/FPP构建成功。
实施例3:反义RNA技术弱化酵母鲨烯合酶基因的表达 根据已经发表的酵母鲨烯合酶基因(GenBank注册号X59959),设计两对引物 SQS3 (5，-acgagctctaactccgcaggaactac-3，)； SQS4 (5'-aatatttccttgggccagaaggatc-3'); SQS5 ( 5 ， -cagctggtcacaatacgctcctcag-3 ，) ； SQS6 ( 5' -gcggatccatttacctaatgcactaaac-3 ，) < 以引物SQS3/SQS4配对，酵母DNA为模板，PCR扩增(95°C， 5min; 95°C， 30S， 53°C， 1.5min， 72°C， 1.5min， 30 cycles; 72°C， 7min; 4°C， +°°)，得到一条长是 1078bp的条带(图6)， TA克隆，得到载体pMD-SQSl，送样测序，与已经发表的酵 母鲨烯合酶序列5'端完全一样。引物SQS5/SQS6配对，酵母DNA为模板，PCR扩 增(95。C， 5min; 95°C， 30S， 50°C, 2min， 72。C， 2min， 30 cycles; 72°C， 7min; 4 °C， + >)，得到一条长是1308bp的条带(图7)， TA克隆，得到载体pMD-SQS2， 送样测序，与已经发表的酵母鲨烯合酶序列3'端序列完全一样。用i^wI/TwI酶切 pMD-SQS2，回收长约1308bp的条带，然后用PTOlI/5awH I酶切，克隆到用I /尸rfl酶切的pMD-SQSl上，得到载体pMD-SQS，该载体包括完整的反向鲨烯合酶 序列(SEQ ID NO:47 )。用I /5a附H I酶切pMD-SQS，克隆到同样用&c I /AwmH I酶切的载体pYeDP60 (法国Dr Werck-Reichhart馈赠)中，得到载体pYeDP60-SQS，
醋酸锂法转化酿酒酵母WHT，通过检测鲨烯或麦角甾醇的含量筛选反义RNA株。
实施例4:酵母鲨烯合酶基因缺陷株WHT A SQU的获得
根据已经发表的酵母鲨烯合酶基因(GenBank注册号X59959),设计两对引 物SQS 1 (5 ，-GGATCCgagctctaactccgcaggaac-3 ，)； SQS2(5，-CTCGAGGCGGCCGCtgtgtg tgtgtgatatgtgacgt-3，)； SQS3(5，-TCTAGAGCGGCCGCagtctgcgccaaataacataaac-3，);SQS4
(5'-GAATTCttaacgcaataccataaaaggtcag隱3')。引物SQS1/ SQS2配对，酵母DNA为模 板，PCR扩增(95°C， 5min; 95°C， 30S， 50°C， 30sec， 72°C， 30sec， 30 cycles; 72 。C， 7min; 4'C， +~)，得到一条长是330bp的条带(图8)， TA克隆，得到载体 pMD-SQS3，送样测序，与已经发表的酵母鲨烯合酶序列5'端上游序列完全一样。引 物SQS3/ SQS4配对，酵母DNA为模板，PCR扩增(95°C， 5min; 95°C， 30S， 50 。C， lmin， 72°C， lmin， 30cycles; 72°C， 7min; 4°C， +~)，得到一条长是831bp 的条带(图8)， TA克隆，得到载体pMD-SQS4，送样测序，与已经发表的酵母鲨烯 合酶序列3'端下游序列完全一样。用屈o I /万awH I酶切pMD-SQS3，克隆到用屈o
I ABcwjH I酶切的p4297 (美国David Stillman馈赠)上，得到载体p4297-SQSl ，该 载体包括330bp的酵母鲨烯合酶序列5'端上游序列。用^k/I/五coRl酶切 pMD-SQS4，克隆到同样用Wa I AEcoR I酶切的载体p4297-SQSl中，构建成含酵母 鲨烯合酶基因5'与3'端序列的取代型载体p4297-SQS(图9)，用iVW I将p4297-SQS 线性化，醋酸锂法转化酿酒酵母WHT，通过同源双交换，G418抗性筛选和麦角甾醇 合成缺陷型筛选突变株，得到酵母鲨烯合酶基因缺陷株WHT A squ。
实施例5:阳性酵母转化子WHT [pGBT9/A/HMG/G/FPP+pYeDP60/G/ADS]的获得 采用醋酸锂法将pGBT9/A/HMG/G/FPP和pYeDP60/G/ADS共转4七酿酒酵母WHT (用 WH丌HMG+FPP+AS])表示，转化后培养2-4天，然后挑取克隆在补加了组氨酸和亮氨 酸的SGI培养基(无氨基酵母氮源，6.7g/l;葡萄糖，20g/l;酸水解酪素，5g/1，固体 补加2%的琼脂粉)中胁迫培养2天，提取酵母质粒，以质粒为模板，通过PCR鉴定 阳性克隆。在酵母工程菌WHT[HMG+FPP+AS]中，导入了3个基因，分别是ADS， tHMGR 和FPPS。 ADS的检测采用引物AR2和AR3 (图10)， HMGR基因的检测用引物ADH1和 HMG(图11)， FPPS基因的检测采用引物gapdhpr和FPPC (图12)。如图10-12所示， 在待筛的9个克隆中都检测到了这三个基因，说明这9个克隆都是阳性克隆。
所用引物和参数如下 引物AR2和AR3 (AR2: 5， -GGGATCCCTTACAGAAGAAAAACC-3，；
AR3: 5， -CCTCGAGTCATATACTCATAGGATA-3'); 参数95。C， 5min; 95。C， 30S， 51。C， 1min， 72°C， 2min， 30cycles; 72°C， 7min。
引物
HMG 禾卩 ADH1 (HMG: 5'-TGGGCCTCTTGTCATACCATCCT-3'; ADH1: 5'-GGTCGACGTCGAGATCCGGGATC-3')
参数95°C， 5min; 95°C， 30S， 48°C， 1min， 72°C， 2min， 30cycles; 72。C， 7min。
引 物 Gapdhpr 和
FPPC(Gapdhpr:5'-GGCACAACCTCAATGGAGTGATG-3';FPPC:5'-GGATCCTTTGCT TCTCTTGTAAACTT-3')
参数95°C， 5min; 95°C， 30S， 48°C， 1min， 72°C， 2min， 30cycles; 72°C, 7min。
实施例6: WHT[pGBT9/A/HMG/G/FPP,pYeDP60/G/ADS/P450]阳性转化子的获得 采用醋酸锂法将pGBT9/A/HMG/G/FPP和pYeDP60/G/ADS/P450共转化酿酒酵母 WHT(用股H丌AS+P450+HMG+FPP]表示)，转化后培养2-4天，然后挑取克隆在补加了组 氨酸和亮氨酸的SGI培养基中胁迫培养2天，提取酵母质粒，以质粒为模板，通过 PCR鉴定阳性克隆。在酵母工程菌WH丌AS+P450+HMG+FPP]中，导入了4个基因，分别 是P450， ADS， tHMGR和FPPS。
检测紫穗槐-4,11-二烯合酶基因所用引物和参数如下 引物AR2和AR3 (AR2: 5， -GGGATCCCTTACAGMGAAAAACC-3， AR3: 5， -CCTCGAGTCATATACTCATAGGATA-3');
参数95°C， 5min; 95°C， 30S, 5TC， 2min, 72°C， 2min， 30cycles; 72°C， 7min。
得到了阳性转化子。从菌落PCR可以看出，所有的菌落都是阳性克隆(图13)。 检测CYP71AV1 P450酶基因所用引物和参数如下AR7 (5' -GGGATCCATGGCACTCT
CACTGACCAC-3，) 和AR15 (5'-GGTCGACCTAGAMCTTGGMCGAGTM-3');
参数95°C， 5min; 95°C， 30S， 56°C， 1.5min， 72°C， 1.5min， 30cycles; 72
。C， 7min。
得到了阳性转化子。从菌落PCR可以看出，第2、 3、 5、 7、 8、 11号是阳性克隆 (图14)。
检测FPPS基因所用引物和参数如下
引物Gapdhpr ( 5 ' -GGCACAACCTCAATGGAGTGATG-3 ')禾n FPPC ( 5 ' -GGATCCTTTGCTTCimGTAAACTT-3')
参数95°C， 5min; 95°C， 30S, 48°C， 1min， 72°C， 2min， 30 cycles; 72°C, 7min。
得到了阳性转化子。从菌落PCR可以看出，所有的9个菌落都是阳性克隆(图
15) 。
检测tHMGR基因所用引物和参数如下
引物HMG ( 5 ' -TGGGCCTCTTGTCATACCATCCT-3 ')和 ADH1 ( 5 ' -GGTCGACGTCGAGATCCGGGATC-3')。
参数95°C， 5min; 95°C， 30S， 48°C， 1min, 72°C， 2min， 30 cycles; 72°C， 7min。
得到了阳性转化子。从菌落PCR可以看出，所有的9个菌落都是阳性克隆(图
16) 。
实施例7:酵母阳性转化子的发酵培养
挑取阳性转化子在补加了组氨酸和亮氨酸的SGI培养基中胁迫培养2天，然后按 5-10%的接种量转接到YPGA培养基(酵母提取物，10g/l潘白胨，10g/l;葡萄糖，20g/l; 腺嘌吟，20mg/l)中，继续培养2天。
实施例8:酵母发酵产物的鉴定
收集酵母WHT [pGBT9/A/HMG/G/FPP+pYeDP60/G/ADS]发酵物，将酵母发酵物 冷干，然后在冷干的菌体和发酵物中加入甲醇，震荡培养3-4天，过滤，滤液旋转蒸 干，然后用水溶解，加入正己烷，萃取三遍，萃取液旋转蒸干，用少量的正己烷溶解； 正己烷萃取后剩余的液体用乙酸乙酯萃取，萃取液旋转蒸干，用少量的乙酸乙酯溶解。 分别将发酵产物的正己垸萃取液和乙酸乙酯萃取液进行GC-WIS，结果检测到了紫穗槐 -4,11-二烯的生成(图17-A-C)，根据朱栾倍半萜标准曲线，对上述酵母工程菌中的 紫穗槐-4,"-二烯进行了定量测定。1^丌剛6+「 45]工程菌发酵液中紫穗槐-4,"-二烯的浓度为23.6mg L1。
收集WHT [pGBT9/A/HMG/G/FPP+pYeDP60/G/ADS/P450]阳性转化子酵母发酵 物，将酵母发酵物冷干，然后在冷干的菌体和发酵物中加入含1.2M山梨醇的 Tris'CL(pH9.5)碱化菌体，28。C震荡培养3-4天，然后加入HC1，使 11=2.0,然后用乙 酸乙酯萃取，萃取液旋转蒸干，取少量进行傅立叶转换回旋共振质谱检测，结果检测 到了青蒿酸的生成(图18)，能产生青蒿酸的酵母工程菌命名为WHTFPR。
实施例9: HMG-CoA还原酶基因酵母整合载体的构建
用5awH I /Mze I双酶切pMD18T-HMG，将酶切的HMG-CoA片段克隆到同样用 万awHl/iW el双酶切的载体pGEM-ADH1346中，得到载体pADH1346-HMG，其中， HMG-CoA还原酶基因上游是ADHl启动子，下游是ADH1终止子。用j/w I/S; e I分 别酶切pADH1346-HMG和pMECA，然后连接得至UpMECA-AHMG。用Pme I /￡coR I 分别酶切pMECA-AHMG和p4366 (美国David Stillman馈赠)，将ADH-HMG序列克隆 到p4366上，得到含Padh-HMG-Tadh的酵母整合裁体p4366-HMG (图19-20)。
实施例10: HMG-CoA还原酶基因酵母整合子的筛选
用JVW I将p4366-HMG线性化，转化酿酒酵母WHT A squ，然后在含5-FOA(即 5-氟乳清酸)的培养基上反选择。5-FOA是乳清酸的结构类似物，它生成对细胞具有 毒害作用的5-氟脲嘧啶核苷酸。因此，在补加了 5-FOA的培养基中，原养型菌株不 能生长，而Ura-突变株不生成具有毒性的5-氟脲嘧啶核苷酸。因而，可以用补加Um 的5-FOA的平板筛选脲嘧啶缺陷型突变株。得到整合了 HMG-CoA表达盒的酵母整 合子WHTAsqu-H。
实施例ll:入DNA序列的克隆
根据酵母人DNA序列，设计合成两对引物，l:5，-AGATCTggaacctctaatcattcgcttt-3，
2: 5'-GAGCTCGCGGCCGCaggtataatgcaagtacggtcg陽3' 3:5， -CGGCCGGCGGCCgcacgcagagaaacctctcttt-3' 4: 5 ， -CCGCGGaacgaacgagaccttaacctact-3'
引物l/2配对，酵母DNA为模板，PCR扩增(95°C， 5min; 95°C，. 30S， 50°C， 2min， 72°C， 2min， 30 cycles; 72°C， 7min; 4°C， +°°)，得到一条长是U37bp的条带(图 21)， TA克隆，得到载体pMD-入l，送样测序，与已经发表的人DNA序列完全一样。 引物3/4配对，酵母DNA为模板，PCR扩增(95°C， 5min; 95°C， 30S， 50°C， 2min， 72°C， 2min， 30 cycles; 72°C， 7min; 4°C， +°°)，得到一条长是llllbp的条带(图 21)， TA克隆，得到载体pMD-A2，送样测序，与己经发表的入DNA序列完全一样 (SEQIDNO: 53)。
实施例12: FPP-ASM融合基因酵母整合载体的构建
根据已经发表的酵母FPP合酶基因(GenBank注册号J05091)设计合成两条引 物，FPP-N ( 5，-GTTAACatggcttcagaaaaagaaat-3，)和FPP-C ( 5,-GGATCCtttgc ttctcttgtaaactt-3，)。以FPP-N/FPP-C为引物，质粒pMD-FPP为模板，PCR扩增(95°C， 5min; 95°C， 30S， 50°C， 1.5min， 72°C， L5min， 30 cycles; 72°C， 7min; 4°C， + ~)，得到一条长是1059bp的条带，TA克隆，得到载体pMDFPPNC，送样测序，与已 经发表的FPP合酶基因完全一样，而且在N末端和C末端分别加上了Wpa I和5"wH I 位点(图22)。
用//戸I /5amH I双酶切pMDFPPNC，克隆到同样用7/戸I /^fl附H I双酶切的 pGEMADH1346中，接着用5fl/wH I /A7w I分别酶切pGEMADHFPP和pMECA-ASM， 将ASM基因克隆到pGEMADHFPP中，得到pAFSm (ADH1346-FPP-ASM)载体(图 23-25)。在pAFSm载体中，包含了完整的FPP-ASM融合基因，而且在该融合基因 上游是ADH启动子，其下游是ADH终止子。
用1 /￡coR I酶切p4366和pMECA，连接得到pMECAURA。然后用JiTlIASflc I酶切pMECAURA，用S， I /^c I酶切pAFSm，连接得到载体pAFSmU(图26-27)。 用Bg/ II / Sac I分别酶切pAFSmU和pMD-入1 ，连接形成一个含有一条入DNA臂的 载体pAFSmU-入1 (图28-30);用S附a I /尸对I酶切pMECA和pMD-入2，连接形成 pMECA入2 (图31);用&cII分别酶切pAFSmU-M和pMECAA2，连接形成一个 含有两条人DNA臂的酵母整合载体pAFSmU-A (图32)。
实施例13: HMG-CoA/FPP-ASM融合基因酵母整合子的筛选 用I酶切pAFSmU-入，将其线性化，通过醋酸锂方法导入酿酒酵母WHTA squ-H中，将转化后的酿酒酵母在含5-FOA的培养基上反选择。5-FOA是乳清酸的结 构类似物，它生成对细胞具有毒害作用的5-氟脲嘧啶核苷酸。因此，在补加了 5-FOA 的培养基中，原养型菌株不能生长，而Um-突变株不生成具有毒性的5-氟脲嘧啶核 苷酸。因而，可以用补加Um的5-FOA的平板筛选脲嘧啶缺陷型突变株。挑取转化 子在非选择性的YPD(酵母提取物，10g/l虔白胨，20g/l滞萄糖，20g/l赠养基上培养，
然后铺在含5-FOA的YPD平板上，挑取阳性转化子接种到不含脲嘧啶的SC (无氨 基酵母氮源，6.7g/l;葡萄糖，20g/l; Dropout mix,0.2%;固体补加2%的琼脂粉)平板 上确认。确认不长的整合子命名为WHT A squ-HFA。
实施例14:酵母WHT A squ-HFA阳性整合子的发酵培养
挑取WHT A squ-HFA阳性整合子在不含脲嘧啶的SC培养棊中胁迫培养2天， 然后按5-10%的接种量转接到YPGA培养基中，继续培养2天。
实施例15:酵母WHT △ squ-HFA发酵产物的GC-MS鉴定
收集WHTAsqu-HFA阳性整合子酵母发酵物，将酵母发酵物冷干，然后在冷干的 菌体和发酵物中加入甲醇，震荡培养3-4天，过滤，滤液旋转蒸干，然后用水溶解， 加入正己烷，萃取三遍，萃取液旋转蒸干，用少量的正己烷溶解；正己烷萃取后剩余 的液体用乙酸乙酯萃取，萃取液旋转蒸干，用少量的乙酸乙酯溶解。分别将发酵产物 的正己垸萃取液和乙酸乙酯萃取液进行GC-MS,结果检测到了紫穗槐-4,ll-二烯的生 成(图33)。
实施例16: P450-P450还原酶融合基因的克隆
根据已经发表的青蒿P450 (CYP71AV1)和P450还原酶CPR基因设计两对引物 P4501( 5，- GTTAACATGGCACTCTCACTGACCACT-3， )；P4502 ( 5， -GGATCCCCTAGGTGGAACGAGTAACAAC-3， ) ； rel(5，-
CCTAGGGCTatgcaatcaacaactt-3，) ； re2(5，- CTCGAGttaccatacatcacggagatat-3，)。 以 P4501/P4502为引物，pMD-P450为模板，PCR扩增(95°C， 5min; 95。C， 30S， 48°C， 1.5min， 72°C， 1.5min, 30 cycles; 72°C， 7min; 4'C， +°°),得到一条长是1467bp 的条带，TA克隆，得到载体pMDP450-l，送样测序，与pMDP450的测序结果一致， 而且在N末端加上了/f/7al位点，C末端依次加上别M I和5amH I位点(图34)。以 rel/re2为引物，pMDre为模板，PCR扩增(95°C， 5min; 95°C， 30S， 48°C， 2.1min， 72°C， 2.1min， 30 cycles; 72°C， 7min; 4'C， +°°),得到一条长是2113bp的条带， TA克隆，得到载体pMDre-l，送样测序，与pMDre的测序结果一致，而且在N末端和 C末端分别加上了说w I和屈o I位点(图35 )。分别用I /SamH I酶切 pGEMADH1346和pMDP450-l，连接成载体pADHP450，然后分别用说w I/^ o I酶切 pADHP450和pMDre-l，连接成载体pADHP450re(图36)，其中包含有融合的P450-P450 还原酶基因，而且该融合基因上游有ADH启动子，下游是ADH终止子。
实施例17: SDNA序列的克隆
根据酵母SDNA序列设计引物，Sl (5'-TCTAGAAGATCTGGCGCGCCATTTA AATgtaagagataggttaattt-3 ， ) ； 5 2(5，隱ACGCGTGCGGCCGCtctactttcgcttaagctgctg-3 *); S3 (5，-CGGCCGGCGGCCGCaaatgaggcggatatttgtt-3，)； S4 (5，-CCGCGGtgtaga gaat gtggattttgatg-38)。以S1/S2为引物，酵母基因组DNA为模板，PCR扩增(95°C， 5mi
n; 95°C， 30S， 60°C， 0.5min， 72°C， 0.5min， 30 cycles; 72°C， 7min; 4°C， +~)， 得到一条长是348bp的条带(图8)， TA克隆，得到载体pMDSl，送样测序，与己经 发表的测序结果一致，而且在N末端加上了^&fl I ， 5g/H， ^ cI和Swfll位点，C末 端依次加上M n和AffwI位点。以S3/S4为引物，酵母基因组DNA为模板，PCR扩 增(95°C， 5min; 95°C， 30S， 55°C， 0.5min， 72°C， 0.5min， 30 cycles; 72°C， 7mi n; 4'C， + >)，得到一条长是348bp的条带(图8)， TA克隆，得到载体pMDS2，送 样测序，与已经发表的测序结果一致，而且在N末端加上了^WZI和M^I位点，C末 端依次加上SacII位点(SEQ ID NO: 52 )。
实施例18: CYP71AV1-P450还原酶酵母整合载体的构建
用力a I /Mw I酶切pADHP450re和pMD S 1 ，连接成载体pADHP450re S 1;用万对Z I /Sac II酶切pADHP450re S l和pMD S 2，连接成载体pADHP450re S ;然后用5g/H I分别酶切pADHP450re S和pMECAURA，连接成酵母整合表达载体pAP450re SURA(图37)，其中包含CYP71AV1-P450还原酶融合基因，URA标记和S同源整合 片段。
实施例19: HMG-CoA/FPP-ADS/CYP71AVl-P450还原酶融合基因酵母整合子的
筛选
用iVW I线性化pAP450re S URA，通过醋酸锂法转化酿酒酵母WHT A squ-HFA， 将转化后的酿酒酵母在不含尿嘧啶的SC平板上筛选，挑取转化子在非选择性的YPD 培养基上培养，然后铺在含5-FOA的YPD平板上，挑取阳性转化子接种到不含尿嘧啶 的SC平板上确认。确认不长的整合子命名为WHTAsquFPR。
实施例20:酵母WHT A squFPR阳性整合子的发酵培养
挑取WHT A squFPR阳性整合子在不含尿嘧啶的SC培养基中胁迫培养2天，然 后按5-10%的接种量转接到YPG培养基中，继续培养2天。
实施例21:酵母WHT A squFPR发酵产物的鉴定
收集WHTAsquFPR阳性整合子酵母发酵物，将酵母发酵物冷干，然后在冷干的 菌体和发酵物中加入含1.2]\4山梨醇的1 3 'CL(pH9.5)碱化菌体，28。C震荡培养3-4天， 然后加入HC1，使pH-2.0，然后用乙酸乙酯萃取，萃取液旋转蒸干，取少量进行傅立 叶转换回旋共振质谱检测，结果检测到了青蒿酸的生成(图38)。
<110> <120> <160> <170>
<210> <211> <212> <213>
<400>
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
卯l
961
1021
1081
1141
1201
1261
1321
1381
1441
1501
1561
1621
<210> <211> <212>
序 列 表
中国医学科学院药物研究所 生产紫穗槐-4，11-二烯和青蒿酸的方法
Patentln version 3.2
1
1641 DNA
人工序列
1
GGTTACCCAATGTCTTTGTAA
2
547 PRT <213>人工序列
<400> 2
KDNFTRMGDEYKHLIKTLLGYPMSLZ
<210> <211> <212> <213>
<210> <211> <212> <213>
<210> <211> <212> <213>
<400>
<210> <211> <212> <213>
3
59
正向引物F1 人工序列
<400> 3
4 59
反向引物R1 人工序列
<400> 4
59
正向引物F2 人工序列
6
59
反向引物R2 人工序列
<400> 6
<210> <211> <212> <213>
7
59
正向引物F3 人工序列
<400>
<210> <211> <212> <213>
8
59
反向引物R3 人工序列
<400> 8
<210> <211> <212> <213>
9
59
正向引物F4 人工序列
<400> 9
<210> <211> <212> <213>
10 59
反向引物R4 人工序列
<400> 10
<210> 11
<211> 59 <212>正向引物F5 <213>人工序列
<400> 11
<210> 12
<211> 59 <212>反向引物R5 <213>人工序列
<400> 12
<210> <211> <212> <213>
13 59
正向引物F6 人工序列
<400> 13
<210> <211> <212> <213>
14 59
反向引物R6 人工序列
<400> 14
<210> <211> <212> <213>
15 59
正向引物F7 人工序列
<400> 15
<210> 16 <211> 59<212>反向引物R7 <213>人工序列
<400> 16
<210> 17
<211> 59 <212>正向引物F8 <213>人工序列
<400> 17
<210> 18
<211> 59 <212>反向引物R8 <213>人工序列
<400> 18
<210> 19
<211> 59 <212>正向引物F9 <213>人工序列
<400> 19
<210> 20
<211> 59 <212>反向引物R9 <213>人工序列
<400> 20
<210> 21
<211> 59
<212>正向引物FIO <213>人工序列
<400> 21
<210> <211> <212> <213>
22 59
反向引物RIO 人工序列
<400> 22
<210> <211> <212> <213>
23 59
正向引物Fll 人工序列
<400> 23
<210> <211> <212> <213>
24 59
反向引物Rll 人工序列
<400> 24
<210> <211> <212> <213>
25 59
正向引物F12 人工序列
<400> 25 <210> 26
<211> 59
<212>反向引物R12 <213>人工序列
<400> 26
<210> <211> <212> <213>
27 59
正向引物F13 人工序列
<400> 27
<210> <211> <212> <213>
28 59
反向引物R13 人工序列
<400> 28
<210> <211> <212> <213>
29 59
正向引物F14
人工序列
<400> 29
<210> <211> <212> <213>
30 59
反向引物R14 人工序列<400> 30
<210> <211> <212> <213>
31 59
正向引物F15 人工序列
<400> 31 5'-
<210> <211> <212> <213>
32 59
反向引物R15
人工序列
<400> 32
<210> <211> <212> <213>
33 59
正向引物F16 人工序列
<400> 33
<210> <211> <212> <213>
34 59
反向引物R16 人工序列
<400> 34
<210> <211> <212>
35 59
正向引物F17
<213>人工序列
<400> 35
<210> <211> <212> <213>
36 59
反向引物R17 人工序列
<400> 36
<210> 37
<211> 59
<212> 正向引物F18
<213>人工序列
<400> 37 5'
<210> 38
<211> 59
<212>反向引物R18 <213>人工序列
<400> 38
<210> <211> <212> <213>
39 59
正向引物F19 人工序列
<400> 39
<210> 40
<211> <212> <213>
59
反向引物R19 人工序列
<400> 40
<210> <211> <212> <213>
41 59
正向引物F20 人工序列
<400> 41
<210> <211> <212> <213>
42 59
反向引物R20 人工序列
<400> 42
<210> <211> <212> <213>
43 59
正向引物F21 人工序列
<400> 43
<210> <211> <212> <213>
44 35
反向引物R21 人工序列
<400> 44
5'-ctcgagTTACAAAGACATTGGGTAACCCAACAATG-3'<210> 45
<211> 1064
<212> FPP合酶基因 <213>酿酒酵母
<400> 45
1021TGCGTTCTTG AACAAAGTTT ACAAGAGAAG CAAATAGGTC GACC
<210> 46
<211> 1597
<212> HMG-CoA还原酶基因 <213>酿酒酵母
<400> 46
1561TAAACTTAGT CATACGTCAT TGGTATTCTC TTGCTAG
<210> 47
<211> 2496
<212>酵母鲨烯合酶基因的反向序列 <213>酿酒酵母
<400> 47 2461GGCAATCAAA TCTGACCTTT TATGGTATTG CGTTAA
<210> 48
<211> 1552
<212> CYP71AV1基因
<213> 青蒿(Artemisiaannua"
<400> 48
<formula>formula see original document page 35</formula> 2221 CTCCCG
<210> 50
<211> 2706
<212> FPP-ADS融合基因 <213>人工序列
<400> 50
<210> 51
<211> 3582
<212> CYP71AV1-P450还原酶融合基因
<213> 人工序列
<210> 52
<211> 696 <212>酵母S序列 <213>酿酒酵母
<400> 52
661 ATCCCAACAA TTACATCAAA ATCCACATTC TCTACA
<210> 53
<211> 2248
<212> 酵母ADNA序列
<213>酿酒酵母
<400> 53
2221TATTTAGTAG GTTAAGGTCT CGTTCGTT
权利要求
1.一种在酿酒酵母细胞中生产紫穗槐-4，11-二烯的方法，包括下列步骤i)将HMG-CoA还原酶基因导入酿酒酵母细胞中的第一位点；ii)将FPP合酶基因和紫穗槐-4，11-二烯合酶基因一起导入酿酒酵母细胞中的第二位点，即得紫穗槐-4，11-二烯酵母工程菌；iii)培养步骤(ii)中的紫穗槐-4，11-二烯酵母工程菌，并纯化紫穗槐-4，11-二烯；其中所述第一位点和第二位点选自δ序列、λDNA序列和HO位点，且彼此不同。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中所述的第一位点是HO位点，第二位点是ADNA 序列。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述的HMG-CoA还原酶基因、FPP合酶基因和 紫穗槐-4,11-二烯合酶基因分别与强启动子可操作的连接，所述启动子优选为ADH 或GAPDH启动子。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述的FPP合酶基因和紫穗槐-4,11-二烯合酶 基因之间插入有一段连接序列，优选是编码Gly-Ser-Gly的GGATCCGGA;所述的 CYP71AV1 P450基因和P450还原酶CPR基因之间插入有一段连接序列，该序列优选 是编码Pro-Arg-Ala的CCTAGGGCT。
5. 根据权利要求1一4中任意一项所述的方法，其中所述的紫穗槐-4,11-二烯合酶基 因含有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
6. —种在酿酒酵母细胞中生产青蒿酸的方法，包括下列步骤i)根据权利要求1中步骤i)和ii)所述构建紫穗槐-4,11-二烯酵母工程菌； i i)将CYP71 AV1 P450基因和P450还原酶CPR基因一起导入酿酒酵母细胞中的 第三位点，即得青蒿酸酵母工程菌；iM)培养步骤(ii)中的青蒿酸酵母工程菌，并纯化青蒿酸； 其中所述第三位点选自S序列、入DNA序列和H0位点，与权利要求1中所述的第一位点或第二位点相同或不同。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述的第三位点是S序列。，
8. 根据权利要求6所述的方法，其中所述的HMG-CoA还原酶基因、FPP合酶基因和 紫穗槐-4,11-二烯合酶基因、CYP71AV1 P450基因和P450还原酶CPR基因分别与强 启动子可操作的连接，所述启动子优选为ADH或GAPDH启动子。
9. 根据权利要求6所述的方法，其中所述的FPP合酶基因和紫穗槐-4,"-二烯合酶 基因之间插入有一段连接序列，优选是编码Gly-Ser-Gly的GGATCCGGA;所述的 CYP71AV1 P450基因和P450还原酶CPR基因之间插入有一段连接序列，该序列优选 是编码Pro-Arg-Ala的CCTAGGGCT。
10. 根据权利要求6~9中任意一项所述的方法，其中所述的紫穗槐-4,11-二烯合酶 基因含有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
11. 一种生产青蒿酸的酿酒酵母"acc/^ram;;c^cwewWfle)，其通过下列步骤获得i) 根据权利要求l中步骤i)和ii)所述构建紫穗槐-4,ll-二烯酵母工程菌；ii) 将CYP71 P450基因和P450还原酶基因一起导入酿酒酵母细胞中的第三位点； 其中所述第三位点选自S序列、入DNA序列和HO位点，与权利要求1中所述的第一位点或第二位点相同或不同。
12. 根据权利要求11的酿酒酵母(saccharomyces cerevisae)，其生物保藏编号为 CGMCC No.1861。
13. —种在酿酒酵母细胞中生产紫穗槐-4,11-二烯的方法，包括下列步骤i) 将HMG-CoA还原酶基因和FPP合酶基因一起以附加体形式导入酿酒酵母细胞中；ii) 将紫穗槐-4,11-二烯合酶基因以附加体形式导入酿酒酵母细胞中；iii) 培养步骤(ii)中的紫穗槐-4,"-二烯酵母工程菌，并纯化紫穗槐-4,"-二烯。
14. 一种在酿酒酵母细胞中生产青蒿酸的方法，包括下列步骤 i )将HMG-CoA还原酶基因和FPP合酶基因一起以附加体形式导入酿酒酵母细胞中；ii) 将紫穗槐-4,11-二烯合酶基因和CYP71AV1 P450基因以附加体形式导入酿酒 酵母细胞中；iii) 培养步骤(ii)中的青蒿酸酵母工程菌，并纯化青蒿酸。
15. —种生产青蒿酸的酿酒酵母(&07力anM7/ces cerei^/s/ae)，其通过下列步骤获 得i)将HMG-CoA还原酶基因和FPP合酶基因一起以附加体形式导入酿酒酵母细胞中；M)将紫穗槐-4,11-二烯合酶基因和CYP71AV1 P450基因以附加体形式导入酿酒 酵母细胞中。
16. 根据权利要求15的酿酒酵母(5^cc/73厂o历ycesce厂ei^/5/ae)，其生物保藏编号为 CGMCC No.1857。
17. —种优化的DNA序列，其含有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
18. —种DNA载体，其包含权利要求17所述优化的DNA序列。
19. 一种宿主细胞，其包含权利要求17所述的DNA载体。
20. 权利要求19所述的宿主细胞，其是酿酒酵母细胞。
21. 权利要求20所述的宿主细胞，其生物保藏编号为CGMCC No.1861。
22. 权利要求20所述的宿主细胞，其生物保藏编号为CGWICC No.1857。
全文摘要
本发明提供了一种在酿酒酵母细胞中生产紫穗槐-4，11-二烯的方法，包括i)将HMG-CoA还原酶基因导入酿酒酵母细胞中的第一位点；ii)将紫穗槐-4，11-二烯合酶基因和FPP合酶基因一起导入酿酒酵母细胞中的第二位点，即得紫穗槐-4，11-二烯酵母工程菌；iii)培养步骤ii)中的紫穗槐-4，11-二烯酵母工程菌，并纯化紫穗槐-4，11-二烯；其中所述第一位点和第二位点选自δ序列、λDNA序列和HO位点，且彼此不同。另外，本发明还提供了一种通过进一步将CYP71AV1 P450基因和P450还原酶CPR基因导入酿酒酵母细胞中的第三位点来获得青蒿酸酵母工程菌、从而生产青蒿酸的方法，其中所述第三位点选自δ序列、λDNA序列和HO位点，与上述第一位点和第二位点相同或不同。
文档编号C12N1/19GK101338309SQ20071018792
公开日2009年1月7日 申请日期2007年11月15日 优先权日2006年11月15日
发明者孔建强, 戴均贵, 平 朱, 伟 王, 王丽娜, 程克棣, 郑晓东 申请人:中国医学科学院药物研究所