编码二氢青蒿酸生物合成中的酶的核苷酸序列的制作方法

专利名称：编码二氢青蒿酸生物合成中的酶的核苷酸序列的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有健康和商业益处的来源于植物的化合物的制备。 更特别地，本发明涉及编码酶的核苷酸序列，由该核苷酸序列编码的 酶和用该酶制备(7AS)-二氢青蒿醛、UM)-二氢青蒿酸和/或青蒿酸的 方法。
背景技术：
通常植物含有无数次级代谢产物，这些产物常常以仅在外来种中 起作用的独特的生物化学过程合成。对于来源于植物的产品，如药物， 1997全世界的销售额是US$ 100亿(Rotheim 2002)。在4艮多情况下， 与这些药物相关的植物材料的供应是有限的或易变的。开发制备这些 药物的方法的一个途径是应用生物化学、分子生物学和基因组方法阐
基因。、》 、 、 '一 、、
由于认识到参与天然产物生物合成的很多酶在已知类别的酶中表
们的相应基因的有效方法(Cahoon等人1999， Gang等人2001， Lange等人2000和Van de Loo等人1995)。
一个令人感兴趣的领域是菊科(Asteraceae， Compositae)亚科中 的Anthemideae族的生物活性化合物(Torrel 1等人1999和Watson 等人2000)。 Anthemideae (菊科，Asteroideae亚科)是包括109 个属的族,包括雏菊(daisies)、 菊花(chrysanthemums)、 龙蒿
5(tarragon)、 甘菊(chamomile)、 蓍草(yarrow)和蒿(sagebrushes ) (Watson等人2000)。这些植物在自然界中气味芳香，这是由高浓度 单萜烯和倍半薛烯产生的。这个族中的许多种的价值在于对健康有益 或具有杀虫性能。
特別令人感兴趣的是来自黄花蒿或青蒿的青蒿素。1972年，中国 科学家从艾属(Artemisia)中分离了含内过氧化物基团的倍半萜烯内 酯(见

图1)，并把它称作青蒿素 (van Agtmael等人1999b)。在此 之前，青蒿在中药中已经应用了几个世纪。青蒿素对于东南亚和其他 地方疟疾，尤其是对于多抗药性恶性痗原虫形式的疾病的治疗已经变 得非常重要(O'Neill 2005， Rathore等人2005， Robert等人2002， Wilairatana等人2002和Wu 2002)。自从发现青蒿素以来，已经开 发了很多半合成衍生物专门应用于疟疾治疗。
疟疾仍然是严重的健康问题，其波及4亿以上的人群，尤其是非 洲和东南亚人，导致每年超过200万人死亡。疟疾寄生虫、恶性痴原 虫对当前抗疟药的抗性不断增加是担心的原因。Bayer AG对青蒿酮 (Artemisone)的开发说明了基于青蒿素结构的抗痗药的未来价值， 青蒿酮是一种青蒿素衍生物，据报道比目前正在进行临床试验的青蒿 琥酉旨活性高10-30倍。而且，Walter Reed Army Institute of Research (USA)的研究人员目前正在开发用于静脉内治疗严重疾疾的的对羧基 苯曱醚。
青蒿素以0.01至1. 0%干重的相对较小的量制备，使得它及其衍 生物相对昂贵(Gupta等人2002)。几个研究描述了倍半碎烯的化学 合成，但是无一是从植物分离青蒿素的经济的替换方案(Yadav等人 2003)。因此为了使青蒿素可尽可能经济地获得，尤其是用于第三世界 国家，在植物中浓度更高或在备选宿主中制备是令人期望的。对生物 合成途径和参与的基因的了解应该使改善的青蒿素的制备技术可行。 或者，也存在制备具有商业价值的生成青蒿素途径中的中间体的可能 性。例如，已经由青蒿醇合成了一种在体外比青蒿素抗恶性痴原虫效 力高15倍的化合物(Jung等人2001)。的腺毛状体上(Duke等 人1994和Duke等人1993)。这些毛状体的数量且甚至这些毛状体
的存在和青蒿素的量在不同的生物型中变化很大。
典型地，在植物中发现并被认为有效的化合物在商业上通过以下 方法来制备i)在可能和经济的情况下，通过化学合成，ii)从培养的 或野生的植物中提取，或iii)细胞或组织培养(这很少是经济的)。在 那些化学合成不是经济的情况下，它使尽可能多地得知天然产物的生 物合成，以致可以在植物或细胞/组织培养中最有效地制备它。就青蒿 素而言，化学合成在商业上是不可行的。由于该化合物是在艾属中小 量制备的，所以来源于青蒿素的药物相对昂贵，尤其是对于使用它们 的第三世界国家。而抗疟药，氯喹和磺胺多辛-乙胺嘧啶，对于成年人 治疗，费用少至20分，相反来源于青蒿素的化合物可昂贵IOO倍。氯 壹抗性很普遍且磺胺多辛-乙胺嘧啶抗性不断增加。世界卫生组织最近
将来源于青蒿素的药物蒿曱醚增加至它们的基本医药的模型列表 (Model List of Essential Medicines)，推荐始终以足够的量和 适当的剂型可利用，且价格是个人和团体有能力负担的。因此，能够 更经济地提供来源于青蒿素的药物将是有用的。
有很多涉及青蒿素和来源于青蒿素的药物的专利。这些专利涵盖 药物合成和配制，艾属培养(Kumar 2002)和组织培养及青蒿素提取 (Elferaly 1990)。 2005年10月24日提交的共同拥有的美国专利申 请60/729， 210,其公开内容引入这里作为参考，且现在作为PCT专利 申请提交的，公开了编码紫穗槐-4，11-二烯羟化酶的基因，该酶催化 青蒿素生物合成中的第一个关键步骤(图1)。
过去五年中，青蒿素生物合成的相当清晰的图片如图1所示 (Bertea等人2005)。根据艾属提取物中存在微量紫穗槐-4， 11-二烯 和代表紫穗槐-4， ll-二烯合酶-碎烯环化酶的cDNA的克隆和表达，确 立了紫穗槐-4， 11-二烯作为生物合成中间体的身份 (Bouwmeester 等人1999和Wallaart等人2001)。最近克隆和表征了命名为 c"77肝7的细胞色素P450基因(Teoh等人2006)。 c/; 7hW基因编
7码催化紫穗槐-4， 11-二烯转变为青蒿醇的羟化酶。酵母中表达的 CYP71AV1也能够将青蒿醇氧化为青蒿醛和将青蒿醛氧化为青蒿酸。
发明概述
这里描述的发明涉及药物和商业利益的青蒿素和青蒿素相关化合 物包括前体的制备。
提供了分离的核酸分子，包含与SEQ ID No : 3具有至少70%核 苷酸序列同 一性的核苷酸序列并且编码青蒿醛双键还原酶。
提供了分离的核酸分子，包含与SEQ ID No : 7具有至少70%核 苷酸序列同一性的核苷酸序列并且编码青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶。
提供了分离的核酸分子，包含编码青蒿醛双键还原酶的核苷酸序 列，该还原酶具有与SEQ ID No : 2具有至少70°/。氨基酸序列同 一性 的氨基酸序列。
提供了分离的核酸分子，包含编码青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶的核苷 酸序列，该醛脱氢酶具有与SEQ ID No : 6具有至少70%氨基酸序列 同一性的氨基酸序列。
提供了纯化的青蒿醛双键还原酶，该还原酶具有与SEQ ID No : 2 具有至少70%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
提供了纯化的青蒿醛双键还原酶，该还原酶具有与SEQ ID No: 6 具有至少70%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
提供了本发明一种或多种分离的核酸分子制备(^》-二氢青蒿
醛、a^ )-二氢青蒿酸和/或青蒿酸的用途。
提供了本发明一种或多种分离的核酸分子编码的一种或多种纯化 的青蒿醛双键还原酶或青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶制备(77》-二氢青蒿
醛、(7L )-二氢青蒿酸和/或青蒿酸的用途。
提供了制备UAS)-二氢青蒿酪、(77"-二氢青蒿酸和/或青萬^f的 方法，包括在宿主细胞中表达或过表达本发明的一种或多种分离的核 酸分子。
提供了制备(W5)-二氢青蒿醛、UM)-二氢青蒿酸和/或青蒿酸的方法，包括在宿主细胞中制备或超量制备本发明的青蒿醛双键还原酶 和/或青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶。
分离的核酸分子优选来源于黄花蒿。
一种或多种核酸分子的过表达或青蒿醛双键还原酶和/或青蒿/二 氢青蒿醛脱氢酶的超量制备可以在黄花蒿中进行。 一种或多种核酸分 子的表达或青蒿醛双键还原酶和/或青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶的表达可 以在其他宿主中进行，例如植物、酵母或细茵。本发明一种或多种分 离的核酸分子的过表达或表达可以与参与青蒿素生物合成的一种或多
种其他核酸分子的过表达或表达联合进行，后者例如紫穗槐-4， ll-二 烯合酶和/或紫穗槐-4， 11-二烯羟化酶。
以经济和及时方式制备青蒿素的问题的部分解决方案是分离和开 发参与青蒿素生物合成的基因。如在其他代谢工程实例中，这种基因 可通过在天然植物(黄花蒿)、不同植物或微生物例如细菌或酵母中过 表达而用于增加产量。这个实例是紫穗槐二烯合酶基因在大肠杆菌中 表达来制备青蒿素前体紫穗槐二烯(Martin等人2003)和在酵母中 制备青蒿醛(Ro等人2006)。制备青蒿素本身的途径的两个重要步骤 是将青蒿醛还原为(7M) -二氢青蒿醛和将-二氢青蒿醛氧化为 ("W)-二氢青蒿酸。因此，参与这些步骤的基因可以单独或与一种或 多种紫穗槐二烯合酶和紫穗槐二烯羟化酶彼此组合用来在宿主中制备 (〃T )-二氢青蒿酸。
接着所产生的(7L ) -二氢青蒿酸通过化学方法可以转变为有商业 价值的青蒿素或相关化合物。推测二氢青蒿酸是青蒿素的中间体，并 且已经表明自发存在通过光氧化，无需酶介入的它转变为青蒿素(Sy 等人2002和Wallaart等人1999)。因此，使用(""-二氩青蒿酸 而不是青蒿素半合成的起始原料青蒿醛，减少了青蒿素制备所需的步 骤数量，因此简化了制备方法。这可以引起青蒿素制备时间缩短和制 备成本降低。最终结果将是更廉价的青蒿素和青蒿素相关药物。可供 选择地，ULS)-二氢青蒿酸可以通过化学方法转变为预计具有抗痴活 性的("i)-青蒿素。本发明的基因(核酸分子)可以从黄花蒿得到，例如从黄花蒿克隆。 克隆的核酸分子被测序并通过在大肠杆菌中表达被表征。 一个克隆的
核酸分子编码双键还原酶，其将青蒿醛的C11-C13双键还原形成作为 主要产物的二氢青蒿醛。另一个克隆的核酸分子编码将二氢青蒿醛转 变为二氢青蒿酸的醛脱氢酶。醛脱氢酶进一步能够将青蒿醛脱氢为青蒿酸。
本发明的核酸分子也可以用于DNA标记的开发和耙向诱变技术 (例如TILLING (Targeting Induced Local Lesions IN Genomes))。
遗传标记(DNA标记)是染色体上具有可鉴定的物理位置和与特定 基因或性状相关的DNA区段且其遗传可被继承。标记可以是基因，或 它可以是功能未知的DM的某一些区段。因为染色体上位置彼此接近 的DNA区段倾向于一起遗传，所以标记常常被用作追踪尚未鉴定但其 大概位置已知的基因的遗传模式的间接方法。因此，标记可以帮助育 种家开发具有特定的感兴趣性状的生物群体。基因特异性标记可用于 检测个体间的遗传变异，其更可能影响与特定基因功能相关的表型。 例如，基于的基因特异性标记的变异，而不是无名DNA标记 的变异，由于其与相关生物合成途径相关，将更可能与青蒿素或相关 化合物的含量变化相关联。在一个实施方案中，对从很多黄花蒿单抹 植物通过聚合酶链式反应扩增的h"Z Z^基因进行测序可以开发 h"/^i的DM标记。这种序列将提供关于该基因内序列多态性的信
切割扩增多态性序列(CAP) (Konieczy等人1993)。
这种基因特异性多态性的存在可能与青蒿素或相关化合物的水平 相关并用于育种计划以选择和/或培育青蒿素或相关化合物水平提高 的黄花蒿林系。也就是说，可能在其他植物中检测遗传结构的变异，
物群体相比二氢青蒿酪、二氢青蒿酸、青蒿酸和,或青蒿素水平增加的 植物群体。Bagge等人2007， Pfaff等人2003， Sandal等人2002 和Stone等人2002中更详细地讨论了遗传标记。TILLING (Bagge等人2007， Comai等人2006， Henikoff，等 人2004和Slade等人2005)涉及用诱变剂处理种子或各个细胞以 引起点突变，然后使用对单核苷酸突变检测灵敏的方法找到感兴趣基 因中的这个点突变。期望的突变(例如引起感兴趣基因产物表达改变的 突变)的检测可以通过例如PCR方法完成。例如，可制备来源于感兴 趣基因(核酸分子)(例如本发明的核酸分子)的寡核苷酸引物并可使用 PCR由诱变的群体中的植物扩增感兴趣基因的区域。扩增的突变基因
测到的差异可以追溯到具有突变基因的植物，由此揭示诱变的植物将 具有期望的表达。然后这些植物可以选择性繁育以产生具有期望的表 达的群体。
在下列详细说明过程中将描述本发明的另外的特征或该特征将变
得很明显。
附图简述
为了更清楚理解本发明，现在将参照附图，通过举例详细描述其 实施方案，其中
图1描述了提出的青蒿素生物合成的生物合成途径。
图2描述了 pKT104的cDNA插入物的核苷酸序列(SEQ ID No : 1), 其编码黄花蒿AaDBRl。
图3描述了黄花蒿基因^"A^编码的蛋白的预测氨基酸序列(二EQ ID No : 2)。
图4描述了 pKT032中DNA插入物的可读框的核苷酸序列(SEQ ID No : 3)。
图5描述了 pKT032中h"^ 7插入物的产物的预测氨基酸序列 (SEQ ID No : 4)，读框带有N末端His标记序列。
图6描述了 pKT15 0的cDNA插入物的核苷酸序列(SEQ ID No : 5)， 其编码黄花蒿AaALDHl。
图7描述了黄花蒿基因h^"W编码的蛋白的预测氨基酸序列
ii(SEQ ID No : 6)。
图8描述了 pKT041中DNA插入物的可读框的核苷酸序列(SEQ ID No : 7)。
图9描述了 pKT041中^E/ )W插入物的产物的预测氨基酸序列 (SEQ ID No : 8),读框带有N末端His标记序列。
图10描述了用青蒿醛与(a)和不与(b)添加的NADPH检测的表达 AaDBRl的大肠杆菌无细胞提取物的GC/MS。在14. 94和15. 03分钟的 保留时间和质谱峰分别相当于标准青蒿醛(1C 218)和(775)-二氢青 蒿醛(Mr+ 220)。
图11描述了用UM)-二氢青蒿醛与(a)和不与(b)添加的NADPH 检测的表达h^:/^7的大肠杆菌无细胞提取物的GC/MS。 二乙醚提取 物分析为重氮曱烷衍生物。在15.8分钟峰的保留时间和质谱相当于 (2L )-二氢青蒿酸的标准重氮甲烷衍生物(M+ 250)。
优选实施方案的描述
#辨和才法
#毐逖
根据Chang等人2000描述的方法，从黄花蒿花芽和叶子的一氛 曱烷提取物中分离青蒿醛并用于合成青蒿醛，其公开内容引入这里作 为参考。
二產#毐虔
使用Teoh等人2006对于青蒿醛描述的方法，从得自含有相对高 水平二氢青蒿酸的"2/39系"的黄花蒿叶材料中分离和纯化二氬青蒿 酸，其公开内容引入这里作为参考。
从分离的二氢青蒿酸合成二氢青蒿酪。该酸在二乙醚中，于0。C， 历时5分钟转变为含过量重氮甲烷的二氢青蒿酸甲酯。在氮气流下除 去该醚和重氮曱烷，并在甲苯中，室温下，氮中，历时10分钟，用过 量1.5 M二异丁基氢化铝将该甲酯还原成(7L )-二氢青蒿醇。随后提
12取，用氯铬酸吡啶氧化为醛(Corey & Suggs 1975)并通过HPLC纯 化产生了 UM)-二氢青蒿醛，根据GC分析，总产率48%，纯度>99%。
黄花蒿种子(2/39系)从美国密苏里州Brixey， Elixir Farm Botanicals和巴西Campinas州立大学的Pedro Mel i 1 lo de Magalhaes 获得。使该种子在人工气候室的土壤中发芽和生长，16小时白天/25 。C和8小时黑夜/20。C。将高度达'到大约1.2 m (约3个月)的植物转 移到开花室，12小时白天/25。C和12小时黑夜/20'C。收集在开花室 19-21天后发育的花蕾进行总RNA分离。
义岸^#建和43淨^标记^ST 为、浙
使用Logeman等1987描述的改进方法从腺毛状体和花蕾提取和分 离总RNA cDNA。由1. 5微克总RNA的cDNA合成和毛状体和花蕾cDNA 文库的构建用Creator SMART cDNA文库构建试剂盒(Clontech)来进 行。分别随机挑选毛状体和花蕾文库的共6， 239个克隆和2, 208克隆 并对它们的DNA序列进行测序。测序在AB1 3700 DNA测序仪上，^吏用 BigDye终止剂循环测序试剂盒(Appl ied Biosys tems)和Ml 3 f、向引物 进行。解释DNA序列迹线并使用PHRED(Ewing等人1998)和LUCY (Chou&Holmes 2001)消除载体和低质量序列。使用STACKPACK ::": — 等人1 999)和对所产生的EST数据集进行聚类和用BLAST(Altschul 等人1990)鉴定序列相似性。
全长h/^y 7 ^为、庠
^f吏用基因特异性引物5 '-CACCATGGAACAGCAACAAGAAG-3 ' (SEQ ID No : 9)和5 '-TCATTCATGCGCAACCACCACCA-3 ' (SEQ ID No : IO)和 Vent聚合酶(New England BioLabs，剑桥，MA，美国)通过PCR获得EST 克隆pktl04编码的命名为AaDBRl的双键还原酶的可读框(0RF)。 产 生的PCR产物通过Gateway进入栽体pENTR/D/T0P0 (Invi trogen)克 隆入Gateway目的载体pDEST17 (Invitrogen)，产生细菌表达克隆 pKT032。在h"^ J的N末端上带有6X His标记的框内克隆Ja"A^ 的0RF (SEQ ID No : 13)。使用基因特异性引物5 '-CACCATGAGCTCAGGAGCTAAT-3 ' (SEQ ID No : ll)和5 TTAAAGCCACGGGGAATCATAT-3 ' (SEQ ID No : 12)和 Vent聚合酶(New England BioLabs，剑桥，MA，美国)通过PCR获得EST 克隆pKT150编码的命名为AaALDHl的醛脱氢酶的可读框(ORF)。 产 生的PCR产物通过Gateway进入载体pENTR/D/TOPO (Invitrogen)克 隆入Gateway目的载体pDEST17 (Invitrogen)，产生细菌表达克隆 pKT041。克隆hM";W的0RF，在/^^/%7的N末端读框带有6X His 标记序列(SEQ ID No : 13)。
^义應々霧哞^这
使用热休克在42。C将质粒pKT032或pKT041导入大肠杆菌菌抹 BL21 (DE3) (Novagen)。 GUS基因(Invi trogen)克隆入pDEST17以替 换ccdB基因，和导入大肠杆菌菌抹BL21 (DE3)的构建体pDEST-GUS 用作对照。转化体在Luria肉汤培养基(LB)中生长并在氨千青霉素 (10(Vg/mL)上37。C选择24小时。含有pKT032或pKT041的单个菌落 接种于5 mL含氨千青霉素的LB液体培养基(LBA)并在37。C摇动生长 过夜。过夜培养物接种于250 mL LBA液体培养基中并在37。C摇动生 长至OD刚为每毫升0. 6，随后用1 mM IPTG诱导并在3(TC摇动生长过 夜。细胞在2，000g， 4。C沉淀10分钟。沉淀细胞重悬于由50 mM磷酸 钠，pH 8.0, 0.1 M NaCl, 20 mM咪唑和1 mM苯甲基磺酰氟(PMSF) 组成的6 mL裂解緩冲液中。在冰上用溶菌酶(O. 2 mg/mL的细胞)裂解 细胞30分钟，所后在水上以30s脉沖(5X)超声处理。用Bradford试 验(Bio-Rad)测定蛋白浓度。在SDS凝胶上银染检测AaDBRl蛋白并用 抗His抗体(Invitrogen)通过Western印迹证实。用Rapid染料 (Bioscience, St. Louis, MO)在SDS凝胶上检测AaALDHl蛋白。
重逸^Ji:/W7的^/七
如上所述制备重组AaALDHl的无细胞提取物。无细胞提取物在 20,000 g， 4°C离心15分钟以除去任何残存不可溶物质，之后装填到 用结合緩沖液(含500 mM NaCl和20 mM咪唑的20 mM磷酸钠緩冲液，pH 7. 5)平衡过的His-Trap FF片主(Amersham Bioscience, NJ)上。用 5柱体积的结合緩沖液洗涤柱子，并用含浓度以递增方式不断增加的 咪唑的洗脱緩沖液(20 mM磷酸钠，500 mM NaCl, pH 7. 5)洗脱重组 AaALDHl。洗脱馏分在离心过滤装置(Amicon Ultra-15) (Millipore， MA)中根据制造商的方案浓缩并脱盐。用Rapid染料(Biosciences， St. Louis, M0)染色的SDS凝胶检测重组AaALDHl的纯度。 #斧无勿應试發
用青蒿醛检测重组His标记AaDBRl蛋白的无细胞提取物，随后用 气相色谱法/质谱法分析。向含有10°/。山梨醇，1 mM NADPH， 2 mM DTT 和0. 8 y g酶的500 jaL磷酸钠緩沖液(50 mM， pH 7. 5)中添加底物(5 Mg)启动酶反应。用沸腾蛋白，不含NADPH和含有已导入构建体 pDEST17-GUS的大肠杆菌提取物，来进行阴性对照。允许反应在30°C 摇动进行30分钟并用700 pL二乙醚提取两次立即终止。混合醚提取 物、蒸发和吸收入20 iaL乙酸乙酯(Sigma)，随后进行GC-MS分析。
用二氢青蒿醛和其他底物检测重组His标记AaALDHl蛋白的无细 胞提取物，随后用气相色语法/质谱法分析。向含有1 mM MDP和1. 0 ju g酶的500 m LTris-HCl緩沖液(50 mM， pH 8. 5)中添加底物(5 ju g) 启动酶反应。用沸腾蛋白，不含NADPH和含有已经导入构建体 pDEST17-GUS的大肠杆菌提取物，来进行阴性对照。允许反应在30°C 摇动进行30分钟，和用700pL 二乙醚提取两次立即终止。混合醚提 取物，用重氮曱烷衍生、蒸发和吸收入2(VL二氯甲烷(Sigma)，随后 进行GC-MS分析。
^化Wf逸^》在
辅因子的操作饱和度。用标准试验测定含有1 mM NADP和1.5微克纯 化重组AaALDHl的50 mM緩沖液(磷酸钠，Tris-HC1和CHES)从pH 6. 0 至10.0，以0.5单位间隔的最佳pH。通过改变底物浓度测定50 mM Tris-HCl緩沖液，pH 8.5中的动力学参数。使用GraphPad软件 (GraphPad Software Inc. San Diego, CA)通过非线性回归分析测定
15动力学常数，以三个独立试验方式提供结果。用估计的Km值10倍的 底物浓度在最佳反应条件下测定底物特异性。检测的底物包括青蒿 醛、G")-二氢青蒿醛、青蒿醇、二氢青蒿醇、辛醛、壬醛、2-苯基 丙醛、3-环己基丙搽、2-己-l-醛、丁香醛。 潜^:
从发育的黄花蒿毛状体和花蕾得到表达序列标记(随机挑选的 cDNA克隆的序列)并进行分析。
具有与单薛烯双键还原酶类似的序列的cDM克隆再次进行测序 并拼接这些序列。这些被认为源自于称作AaDBRl的单个黄花蒿基因。 图2示出了 h"A^ mRNA的共有核苷酸序列(SEQ ID No : 1)。图3 示出了相应的氨基酸序列(SEQ ID No : 2)。
具有与醛脱氢酶类似的序列的cDNA克隆再次进行测序并拼接这 些序列。这些被认为源自于称作AaALDHl的单个黄花蒿基因。图6示 出了 /^JZ"W mRNA的公认核香酸序列(SEQ ID No : 5)。图7示出了 相应的氨基酸序列(SEQ ID No : 6)。
对于AaDBRl初步的功能研究，制备RT-PCR产物并克隆入大肠杆 菌表达载体pDEST17,得到克隆pKT032。图4给出了 pKT032的DNA 插入物的可读框的核苷酸序列(SEQ ID No : 3)和图5给出了包括N 末端His标记融合的相应蛋白产物(SEQ ID No : 4)。质粒pKT032导 入大肠杆菌(DE3)菌林(Novagen)和用各种类异戊二烯底物测定无细胞 提取物，随后用气相色谱法/质谱法分析。图IO显示了这个分析结果， 表明NADPH依赖性(W5)-二氢青蒿醛形成作为主要产物。在分开的实 验中，未导入PKT032的大肠杆菌提取物不支持在NADPH存在下产生二 氢青蒿醛。可以预料h"AW的野生型产物将具有与pKTO32 His标记 融合蛋白产物类似的青蒿醛双键还原酶活性。
对于AaALDHl初步的功能研究，制备PCR产物并克隆入大肠杆菌 表达载体pDEST17,得到克隆pKT041。图8给出了 pKT041的DNA插入 物的可读框的核普酸序列(SEQ ID No : 7)和图9给出了包括N末端 His标记融合的相应蛋白产物(SEQ ID No : 8)。
质粒pKT041导入大肠杆菌(DE3)菌林(Novagen)和用-二氢青蒿醛测定无细胞提取 物，随后用气相色i普法/质语法分析。从无细胞提取物纯化重组 AaALDHl蛋白并测定其动力学参数。在pH 8.5,纯化的重组AaALDHl 蛋白功能最好。用不同底物(见材料和方法)在最佳试验条件下检测重 组蛋白。发现除UL )-二氢青蒿酪之外的青蒿醛是重组AaALDHl的底 物。测定二氢青蒿酸的IL和V隨值分别是8. 79pM和143.8 pkat/pg 蛋白，和对于青蒿醛，L和V则x分别是2. 62pM和和28. 6 pkat/pg蛋 白。图11显示了对于UM)-二氢青蒿醛的分析结果，表明NADPH依赖 性ULS)-二氢青蒿醛形成。在分开的实验中，未导入pKT041的大肠 杆菌提取物不支持在NADPH存在下产生二氢青蒿酸。可以预料h^:ZW7 的野生型产物将具有与pKT041 His标记融合蛋白产物类似的青蒿/二 氢青蒿醛脱氢酶活性。
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该结构所固有的其他优点对于本领域的技术人员来说是显而易见 的。这里描述的实施方案是说明性的且并不意味着限制所要求保护的 本发明的范围。上述实施方案的变型对于本领域的普通技术人员来说 是显而易见的并且本发明人意欲将其包括在下列权利要求中。
权利要求
1. 分离的核酸分子，包含与SEQ ID No3具有至少70％核苷酸序列同一性的核苷酸序列并且编码青蒿醛双键还原酶。
2. 分离的核酸分子，包含编码青蒿醛双键还原酶的核苷酸序 列，该还原酶具有与SEQ ID No : 2具有至少70%氨基酸序列同一性 的氨基酸序列。
3. 权利要求1或2的分离的核酸分子，具有SEQ ID No : 1的核苷酸序列。
4. 分离的核酸分子，包含与SEQ ID No : 7具有至少70%核苷 酸序列同一性的核苷酸序列并且编码青蒿/二氢青蒿醛脱氬酶。
5. 分离的核酸分子，包含编码青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶的核普 酸序列，该青蒿醛脱氢酶具有与SEQ ID No : 6具有至少70%氨基酸 序列同一性的氨基酸序列。
6. 权利要求4或5的分离的核酸分子，具有SEQ ID N。
5 的核苷酸序列。
7. 权利要求1至6任一项的分离的核酸分子，其来源于黄花簟 同。
8. 纯化的青蒿醛双键还原酶，其具有与SEQ ID No : 2具有 至少70%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
9. 权利要求8的还原酶，其具有SEQ ID No : 2的核苷酸序列。
10. 纯化的青蒿/二氢青蒿酪脱氢酶，其具有与SEQ ID No : 6 具有至少70%氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
11. 权利要求10的脱氢酶，其具有SEQ ID No : 6的核苷酸序列。
12. 权利要求1至7任一项的一种或多种分离的核酸分子在制 备二氢青蒿醛、二氢青蒿酸和/或青蒿酸中的用途。
13. 权利要求1至7任一项的一种或多种分离的核酸分子编码的一种或多种纯化的青蒿醛双键还原酶或青蒿/二氢青蒿醛脱氩酶在 制备二氢青蒿醛、二氢青蒿酸和/或青蒿酸中的用途。
14. 一种制备二氢青蒿醛、二氢青蒿酸和/或青蒿酸的方法，包 括在宿主细胞中表达或过表达权利要求1至7任一项的一种或多种分 离的核酸分子。
15. 权利要求14的方法，进一步包括在宿主细胞中表达或过表 达编码紫穗槐-4， 11-二烯合酶和/或紫穗槐-4， 11-二烯羟化酶的一种 或多种核酸分子。
16. —种制备二氢青蒿醛、二氢青蒿酸和/或青蒿酸的方法，包 括在宿主细胞中制备或超量制备蛋白，该蛋白具有与SEQ ID No : 2 具有至少70%氨基酸序列同一性的氨基酸序列和/或与SEQ ID No : 6 具有至少70°/。氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
17. 权利要求14至16任一项的方法，其中宿主细胞是植物细 胞、酵母细胞或细菌细胞。
18. —种在天然产生二氢青蒿醛、二氢青蒿酸、青蒿酸和/或青蒿 素的植物群体中选择或开发二氢青蒿醛、二氢青蒿酸、青蒿酸和/或青 蒿素水平改变的植物的方法，包括检测与相似条件下对照植物相比二氢青蒿醛、二氩青蒿酸、青蒿酸和/或青蒿素水平改变的靶植物；分离靶植物青蒿醛双键还原酶基因或青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶基因的至少一部分，并将该至少一部分的核苷酸序列与SEQ ID No. 1、 SEQ ID No. 3、 SEQ ID No. 5或SEQ ID No. 7进行比较，检测与SEQ ID No. 1、 SEQ ID No. 3、 SEQ ID No. 5或SEQ ID No. 7的差异； 检测其他植物中的该差异；选择性繁育植物，该植物与在相似条件下产生的对照植物群体相 比二氢青蒿醛、二氢青蒿酸、青蒿酸和/或青蒿素水平发生改变。
19. 一种改变天然产生二氢青蒿醛、二氢青蒿酸和/或青蒿酸的植 物群体中二氢青蒿醛、二氢青蒿酸、青蒿酸和/或青蒿素水平的方法，包括提供突变的植物群体；检测突变植物群体内靶突变植物，该耙突变植物与在相似条件下 产生的对照植物相比，其青蒿醛双鍵还原酶基因或青蒿/二氢青蒿醛脱 氩酶基因的表达改变或青蒿醛双键还原酶或青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶的活性改变，所述检测包括使用从权利要求1至7任一项限定的核酸分子开发 的引物，通过PCR从突变植物群体中的突变植物扩增青蒿醛双键还原 酶基因或青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶基因的区域，鉴定扩增区域和野生型 基因相应区域之间的引起表达改变或活性改变的错配，并鉴定含有错配的突变#>物；和选择性繁育靶突变植物以产生植物群体，该植物群体与在相似条件下产生的对照植物群体相比，其青蒿醛双键还原酶基因或青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶基因的表达改变或青蒿醛双键还原酶或青蒿/二氢青蒿醛脱氪酶的活性改变。
全文摘要
从黄花蒿克隆的分离的核酸分子编码青蒿醛双键还原酶和青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶。青蒿醛双键还原酶将青蒿醛酶促还原为二氢青蒿醛。青蒿/二氢青蒿醛脱氢酶将二氢青蒿醛酶促氧化为二氢青蒿酸和将青蒿醛氧化为青蒿酸。因此，这些核酸分子及其所编码的酶可以用于在宿主细胞中制备二氢青蒿醛、二氢青蒿酸或青蒿酸的方法中。二氢青蒿酸是抗疟化合物青蒿素的晚期前体。
文档编号C12N15/53GK101454453SQ200780019611
公开日2009年6月10日 申请日期2007年4月4日 优先权日2006年4月5日
发明者D·R·波利恰克, D·W·里德, K·H·泰赫, P·S·科韦洛 申请人:加拿大国家研究委员会