用于治疗肿瘤的组合物和方法

专利名称：用于治疗肿瘤的组合物和方法
技术领域：
肿瘤是组织的异常增生，其可以是恶性的或是良性的。良性肿瘤^J 部地生长，而恶性肿瘤则会扩散至其他组织。
癌症是遗传病。抗凋亡的能力是癌细胞的特征。已知许多遗传性病变 使得癌细胞对程序性细胞死亡(凋亡)产生抗性。在细胞凋亡期间，称为 胱天蛋白酶的一些酶执行分解细胞的过程。起始子胱天蛋白酶剪切无活性 的效应子胱天蛋白酶的前体，从而将其活化。然后，激活的效应子胱天蛋 白酶对细胞内的蛋白质进行分裂。在正常组织中，细胞凋亡的速率与细胞 增长的速率平衡，从而调控组织的生长。如果细胞的凋亡过程受到干扰， 则细胞可以继续分裂，从而导致组织生长的失控。
肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)是治疗肿瘤纟艮有希望的治 疗剂。TRAIL是肿瘤坏死因子(TNF)超家族的成员，该家族包括有效的凋 亡诱导物TNF和Fas配体(FasL)。 TRAIL之所以受到特别关注，不仅是 因为其诱导多种人类肿瘤和癌细胞系的快速凋亡，还因为其对正常细胞和 组织具有很小的毒性。
通常TRAIL由身体中许多组织表达，但也可在肿瘤治疗期间外源性 施用。将可溶性的活性形式TRAIL注射入携带实体瘤的小鼠诱导了凋亡、 抑制了肿瘤的a并改善了存活。还有证据显示，使用TRAIL和各种化 疗药物的组合治疗能进一 步促进肿瘤退化。
TRAIL与肿瘤和癌细胞系上的死亡受体DR4和DR5结合，并迅速地、 特异性地诱导凋亡。取决于细胞的类型，TRAIL与死亡受体的结合可同时 诱导外源性和内源性凋亡途径，或只诱导两者之一。在这两种途径中， TRAIL与其受体的结合产生了衔接蛋白FADD (具有死亡结构域的Fas相关蛋白)的结合位点，该衔接蛋白募集并激活起始子胱天蛋白酶8。在 某些细胞内，胱天蛋白酶8激活外源性凋亡途径，从而直接导致足以诱导 凋亡的效应子胱天蛋白酶3、 6和7的激活。TRAIL也可通过内源性途径 诱导凋亡，在此途径中胱天蛋白酶8的激活引发了涉及线粒体及凋亡体形 成的凋亡。胱天蛋白酶8剪切Bcl-2抑制性含BH3结构域蛋白(Bid)，从而 导致了截短的Bid蛋白从细胞质转移至线粒体外膜并诱导Bax和Bak的寡 聚反应。由Bax (Bcl-2-相关X蛋白)和Bak ( Bcl-2-拮抗剂/杀伤因子1) 所形成的孔道，引起线粒体膜极化状态的消失和细胞色素C的释放，导致 该细胞线粒体的代谢故障。然后，细胞质内的细胞色素C与胱天蛋白酶9 相互作用，以激活下游的效应子胱天蛋白酶3、 6和7。
然而，利用TNF超家族成员实施的治疗具有某些局P艮性多种肿瘤细 胞对TNF超家族成员(包括TRAIL )诱导的凋亡具有抗性。本发明则旨 在消除这些局限性。
已报导的g
已知存在于体内的某些分子以抑制TNF超家族成员的活性的方式起 作用(在本文中这样的化合物称为"TNF抑制因子，，)。例如据报导，细 胞FLICE抑制蛋白(c-FLIPs)、 Bax抑制因子1以及Bcl-XL能抑制TRAIL 的凋亡活性。Burns, T.F.和W.S. El-Deiry， J. Biol. Chem.， 276: 37879-37886 (2001)。又据报导，JAT和ikf/7W^基因也能抑制TRAIL的凋亡活性。参 阅Aza-Blanc等人，Molecular Cell, 12: 627-637(2003)。
此外还已知，抑制TNF抑制因子活性的生物分子以改善TRAIL的凋 亡活性的方式敏化细胞。例如，施用靼向细胞中/Orr和Af/及&4基因的 siRNA已显示出使细胞对TRAIL的凋亡活性敏化。参阅Aza-Blanc等人， Molecular Cell, 12: 627-637(2003)。
本发明涉及提供也改善TRAIL的凋亡活性的方法。

发明内容
7本发明涉及组合物，其包括(A)抑制复合体III蛋白(如核心蛋白1) 活性的抑制剂；以及(B)载体。
此外，本发明涉及制备组合物的方法，该组合物含有抑制复合体III 蛋白(如核心蛋白l)活性的抑制剂和载体，该方法包括将所述抑制剂与 所述载体混合。
在另一方面，本发明涉及制备组合物的方法，该组合物含有抑制复合 体III蛋白(如核心蛋白1)活性的抑制剂、载体以及肿瘤坏死因子超家族 的成员，该方法包括将所述抑制剂、所述载体及所述超家族成员混合。
本发明的另一方面涉及进行检测以确定化合物是否是复合体III蛋白 (如核心蛋白1)的TNF抑制活性的抑制剂的方法，其包括将在TNF超 家族成员存在条件下生长并已与所述化合物接触的表达复合体III蛋白的 细胞的生存力与在TNF超家族成员不存在的条件下生长并已与所述化合 物接触的属于同一细胞系且也表达所述复合体III蛋白的细胞的生存力作 比较。
本发明的另一方面涉及进行检测以确定化合物是否是复合体III蛋白 (如核心蛋白1)的TNF抑制活性的抑制剂的方法，其包括使化合物与 表达所述蛋白质并在TNF超家族成员存在条件下生长的细胞接触一段预 定的时间；使该化合物与跟如上所述的属于同 一细胞系且表达所述蛋白质 但在TNF超家族成员不存在条件下生长的细胞接触相同的预定时间；并比 较这些细胞的生存力。
本发明的又一方面涉及进行检测以确定化合物是否是复合体III蛋白 (如核心蛋白1)的活性的抑制剂的方法，其包括在TNF超家族成员存 在条件下培养表达该蛋白质的属于某细胞系的细胞；在TNF超家族成员不 存在的条件下培养表达该蛋白质的属于同一细胞系的细胞；使所述化合物 与这些细胞接触；以及在一段预定的时间之后比较这些细胞的生存力。
本发明的又一方面涉及进行检测以确定化合物是否是复合体III蛋白 (如核心蛋白1)的TNF抑制活性的抑制剂的方法，其包括将已与TNF 超家《物接触但未与TNF超家族成员接触的属于同一细胞系且表达所述蛋白质 的细胞的生存力作比较。
本发明的另一方面涉及进行检测以确定化合物是否是复合体III蛋白 (如核心蛋白1)的TNF抑制活性的抑制剂的方法，其包括使表达该蛋 白质的属于某细胞系的细胞与TNF超家族成员及所述化合物接触；使表达 该蛋白质的属于同一细胞系的细胞与该化合物接触但不与TNF超家族成 员接触；以及比较这些细胞的生存力。


图1A是流程图，其描述了篩选cDNA文库以获得对TRAIL所诱导凋 亡具有抗性的基因的方法。示意图显示了为获得抗TRAIL所诱导凋亡的 基因而进行的小鼠E14 cDNA文库的遗传筛选过程。分离、测序及^iit取 自TRAIL抗性细胞的cDNA。
图1B显示了与人的全长UQCRC1 cDNA比较的小鼠UQCRC1 (核 心蛋白1 )cDNA的一部分M酸序列。两者均含有线粒体定位序列(MLS)。
图1C是显示多种肺瘤组织中核心蛋白1过表达水平的表格(资料引 自Ascenta数据库)。
图2A是显示表达显性阴性的FADD (dnFADD)、绿色荧光蛋白(GFP), 或部分核心蛋白1的HCT116细胞的生存力(以膜联蛋白V阴性的细胞百 分比计)的柱形图。这些细胞分别经TRAIL处理(IO ng/ml或50 ng/ml)或 未经TRAIL处理(O ng/ml)。
图2B是显示表达显性阴性的FADD (dnFADD)、绿色焚光蛋白(GFP)， 或部分核心蛋白1的HCT116细胞的生存力(以细胞中极化线粒体的百分 比计)的柱形图。这些细胞分别经TRAIL处理(IO ng/ml或50 ng/ml)或未 经TRAIL处理(O ng/ml)。
图2C是使用核心蛋白1、 COX1 (线粒体标记)以及SODl (细胞质 标记)的抗体，在细胞质和线粒体成分上进行Western印迹试验的结果。 该细胞质和线粒体成分由表达黄色荧光蛋白(YFP)或人的全长核心蛋白1(FL)的稳定细胞系制备。
图2D是显示表达黄色荧光蛋白(YFP)或人的全长核心蛋白1的HT116 细胞的生存力(以膜联蛋白V阴性的细胞百分比计)的柱形图。这些细胞 分别经TRAIL处理(IO ng/ml或50 ng/ml)或未经TRAIL处理(O ng/ml)。
图3A是使用胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9、胱天蛋白酶3以及^:管蛋 白的抗体(印迹洗脱后使用微管蛋白的抗体再次探测并作为加载量的参 照)，在由表达黄色荧光蛋白(YFP)或人的全长核心蛋白l(FL)的稳定 HCT116细胞系制备的成分上进行的Western印迹试验。该细胞系或者已 用200 ng/ml TRAIL处理24小时，或未经TRAIL处理。
图3B是显示表达黄色荧光蛋白(YFP)或表达核心蛋白1的细胞中细胞 色素C存在量的柱形图。该细胞已用100 ng/ml TRAIL处理或未用TRAIL (0 ng/ml)处理。裂解物中细胞色素C的量用ELISA定量。
图3C是显示表达黄色荧光蛋白(YFP)或表达核心蛋白1的细胞的生存 力的柱形图。该细胞已用100 ng/ml TRAIL或16 ng/ml FasL处理，或未 经TRAIL或FasL处理。细胞的生存力用Cell Titer Blue检测法测定。
图3D是显示表达黄色焚光蛋白(YFP)或表iiA的全长核心蛋白1的细 胞的生存力的柱形图。该细胞已用200nM喜树碱、10 nM多西他赛或 DMSO处理，或未经处理。细胞的生存力用Cell Titer Blue检测法测定。
图4A是使用核心蛋白1和孩史管蛋白的抗体(印迹洗脱后使用微管蛋 白的抗体再次探测并作为加载量的参照)，在从HCT116野生型细胞制备 的成分上进行的Western印迹试验的结果。该细胞已与单独的 lipofectamine (对照细胞)、3.75 nM无效siRNA或核心蛋白1 siRNA — 起孵育了 72小时。
图4B是显示在上文图4A中所述每种细胞中核心蛋白l表达水平的柱 形图。
图4C是显示lipofectamine单独、无效siRNA或核心蛋白1 siRNA处 理，继而再以浓度增加的TRAIL处理之后的细胞的生存力的图。
图5A显示了人类UQCRC1 cDNA的核酸序列(SEQ ID NO: 1)。
10图5B显示了人类核心蛋白1的M紗列(SEQIDNO: 2)。 发明的详细描述
本发明涉及一种抑制剂的用途，该抑制剂抑制线粒体呼吸复合体III 某成员蛋白质的TNF抑制活性。为方便起见，本文将此蛋白质称为"复合 体III"蛋白。本发明既适用于与复合体III相締合的蛋白质形式，也适用 于与复合体m未締合的蛋白质形式(例如分离的蛋白质形式)。在本发 明的一个实施方案中，该复合体III蛋白是核心蛋白1。
本发明的组合物包含药物有效量的抑制剂，其抑制复合体III蛋白(如 核心蛋白1)的TNF抑制活性。实质上，任何能够抑制复合体III蛋白(如 核心蛋白1)的TNF抑制活性的化合物皆可用于本发明的实施。可用于本 发明实施的化合物实例包括抑制编码复合体III蛋白(如核心蛋白1)的 基因表达的反义核酸；编码抑制编码复合体III蛋白(如核心蛋白1)的基 因表达的反义核酸的核酸；抑制编码复合体III蛋白(如核心蛋白1)的基 因表达的siRNA;编码此siRNA的核酸；能够结合复合体III蛋白(如核 心蛋白l)并降低其活性的抗体；编码能够结合复合体III蛋白(如核心蛋 白1)并降低其TNF抑制活性的抗体的核酸；能够降低复合体III蛋白(如 核心蛋白l)表达的核酶；编码能够降低复合体III蛋白(如核心蛋白l) 表达的核酶的核酸；能够降低复合体III蛋白(如核心蛋白1)的TNF抑 制活性的小分子化合物。
抑制剂以有效抑制复合体III蛋白(如核心蛋白1)的TNF抑制活性 的浓度存在于组合物中。考虑到此有效浓度将随所用的具体抑制剂和组合 物其他组分的含量和性质而变化，此有效浓度可由本领域普通技术人员确 定。出于指导的目的，据信大多数应用皆涉及使用含量为组合物重量的约 0.01%至约15%的抑制剂。在某些实施方案中，抑制剂的量按重量计为组 合物的约0.01 %至约10 %，或约0.1 %至约5 %。
在以反义核酸作为抑制剂的一些实施方案中，该反义核酸与编码复合 体III蛋白(如核心蛋白1)的脱氧核糖核酸(DNA)的至少一部分杂交，从
ii而抑制蛋白质的表达。反义核酸也可以是一种通过抑制复合体III蛋白(如 核心蛋白l)原始转录物的剪接过程而降低编码复合体III蛋白(如核心蛋
白1)的基因表达的反义核酸。反义核酸可含有DNA或核糖核酸(RNA)， 或兼含两者。任何长度的反义核酸序列均适合于本发明的实施，前提是其 能抑制复合体III蛋白(如核心蛋白1)的表达。优选的反义核酸序列的长 度为至少20个核苷酸。在优选的实施方案中，反义核酸是寡核苷酸。
反义核酸可以合成方式制备，例如通过以相反的方向表达编码复合体 III蛋白(如核心蛋白l)的核酸的全部或部分的方式制备，如欧洲第140308 号专利所述。核心蛋白1的编码核酸序列见图5A。第WO 92/15680号国 际申请公开文本总体上公开了合成的反义核酸的制备和使用。
反义核酸可以化学方式修饰以改善性能，例如稳定性和/或选择性。例 如， 一种此类的修饰涉及用硫基替代磷酸二酯键上的游离氧，从而产生硫 代磷酸酯键。硫代磷酸酯反义核酸为水溶性、聚阴离子的核酸，并对内源 性核酸酶具有抗性。此外，含有亚磷酰胺和聚酰胺(肽)键的反义核酸也 可以合成。这类核酸通常对核酸酶的降解具有很强的抗性。而且，可以将 化学基团增添至糖部分的第2个碳原子和嘧啶的第5个碳原子(C-5)上，以 增强反义核酸的稳定性并便于反义核酸与其靶位点的结合。修饰可包括2' 脱氧、O-戊氧基，O-丙氧基、O-甲氧基、氟基、甲氧基乙氧基硫代磷酸酯、 经修饰的碱基，以及本领域技术人员已知的其他修饰方式。
反义核酸以有效抑制编码复合体III蛋白(如核心蛋白1)的核酸表达 的浓度存在于组合物中。
在以编码反义核酸的核酸作为抑制剂的实施方案中，该核酸是一种编 码上述类型反义核酸的核酸。该核酸以有效浓度存在于組合物中，该有效 浓度的核酸表达能有效抑制复合体III蛋白(如核心蛋白l)表达的数量的 反义核酸。
在以siRNA (小分子干扰RNA)作为抑制剂的实施方案中，siRNA与 编码复合体III蛋白(如核心蛋白1)的mRNA的一部分杂交，并能整合 入识别和抑制mRNA表达的RNA诱导的沉默复合体(RISC)中。siRNA以有效抑制编码该蛋白质的核酸表达的浓度存在于组合物中。
在本发明另一个实施方案中，编码上述siRNA的核酸可用作抑制剂。
在以抗体用作抑制剂的实施方案中，该抗体是与核心蛋白1结合并抑 制其TNF抑制活性的抗体。例如，抗体可以是单克隆或多克隆的、嵌合的、 Fab片段、Fv片段，或Fab或Fv表达文库的产物。
可以制备抗复合体III蛋白(如核心蛋白1)的抗原片段或全长蛋白质 的多克隆抗体。单克隆抗体例如可以使用Mishell, B. B.等人，Selected Methods in Cellular Imm,logy (细胞免疫学的某些方法),(W.H. Freeman,编著)San Francisco (1980)中描述的方法制备。本发明的单克隆 抗体可以进行"人源化，，，以防宿主对该抗体产生免疫反应。"人源化抗 体"指其互补决定区(CDR)和/或轻链和/或重链可变区构架的其他部分 来源于非人类免疫球蛋白，而分子的其余部分则来源于一种或多种人类免 疫球蛋白的抗体。人源化抗体还包括特征为人源化重链与供体或受体未加 修饰的轻链或嵌合轻链相締合的抗体，反之亦然。抗体的人源化可以采取 本领域已知的方法来实现[参阅例如G.E. Mark和E.A. Padlan， "Chapter 4. Humanization of Monoclonal Antibodies ，， ， The Handbook of Experimental Pharmacology Vol. 113 (实验药理学手册，第113巻，第4 章，单克隆抗体的人源化)Springer-Verlag， New York, 1994。转基因 动物可用于表iiA源化抗体。
抗体可以是单链抗体。本领域已知的用于生产单链抗体的技术可经改 进而用于生产复合体III蛋白(如核心蛋白1)的单链抗体。
抗体以有效抑制复合体III蛋白(如核心蛋白1)活性的浓度存在于组 合物中。
在以编码抗体的核酸用作抑制剂的实施方案中，核酸是编码与复合体
ni蛋白(如核心蛋白i)结合并抑制其活性的抗体的核酸。该核酸以有效
表达能有效抑制蛋白质活性的数量的抗体的浓度存在于组合物中。
在将核酶(核糖核酸酶)用作抑制剂的实施方案中，核酶是含有催化 结构域与底物结合结构域的核酶。底物结合结构域是一种与编码复合体III蛋白(如核心蛋白1)的mRNA的至少一部分杂交的结构域。催化结构域是一种能够剪切mRNA的结构域。
在本发明一些优选实施方案中，核酶以锤头模体形式形成。其他形式包括发夹模体、丁型肝炎病毒模体、I型内含子模体或RnaseP RNA (与RNA引导序列相关)模体，或链孢霉(Neurospora) VSRNA才莫体。锤头模体描述于Rossi等人,Aids Research and Human Retroviruses, 8: 183
(1992) 。发夹才莫体描述于Hampel和Tritz， Biochemistry, 28: 4929(1989)，以及Hampd等人，Nucleic Acids Res. ， 18: 299(1990)。 丁型肝炎病毒才莫体描述于Perrotta和Been, Biochemistry, 31: 16 (1992)， RnaseP才莫体描述于Guerrier-Takada等人，Cell, 35: 849(1983)，链孢霉VS RNA核酶模体描述于Collins的文献[Saville和Collins, Cell, 61: 685-696 (19卯)；Saville和Collins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8826-8830 (1991); Collins和Olive, Biochemistry, 32， 2795-2799 (1993)];关于I型内含子才莫体的叙述可参阅Cech等人美国第4,987,071号专利。
制备核酶的一个代表性方法是以化学方式合成一段具有核酶催化结构域(约20个核苷酸)的寡脱氧核糖核苷酸，该催化结构域两侧的序列可杂交到转录后的靼核心蛋白1的mRNA分子上。寡脱氧核糖核苷酸通过使用作为引物的底物结合序列进行扩增。将扩增产物克隆到真核表达载体上。本发明的核酶可在真核细胞中自适当的DNA载体表达。如果需要，核酶的活性可通过第二种核酶将其从原始转录物释放而得到加强[Ohkawa等人，Nucleic Acids Symp. S". ， 27: 15-6 (1992); Taira等人，Nucleic AcidsRes.， 19: 5125-30 (1991); Ventura等人，Nucleic Acids Res.， 21， 3249-55
(1993) 1。
核酶以有效抑制编码复合体III蛋白(如核心蛋白l)的核酸表达的浓度存在于组合物中。
在将编码核酶的核酸用作抑制剂的实施方案中，该核酸是一种编码能够杂交并剪切编码复合体III蛋白(如核心蛋白1)的mRNA的核酶的核酸。核酸以有效产生能抑制蛋白质表达的量的核酶的浓度存在于组合物中。
14这可由本技术领域的普通技术人员来决定。
在使用抑制复合体III蛋白(如核心蛋白1 )活性的小分子化合物的实施方案中，该化合物是通过抑制线粒体复合体III的功能(例如通过抑制
上述蛋白质的活性)，使细胞对TRAIL诱导的凋亡致敏的化合物。该小分子化合物以有效浓度存在于组合物中，该有效浓度的小分子抑制复合体III蛋白(如核心蛋白1)的活性，或者提高TRAIL对肿瘤细胞的作用，无论这些细胞中复合体III蛋白的活性如何。
在使用编码小分子化合物的核酸的实施方案中，该核酸是编码抑制复合体III蛋白(如核心蛋白1)的TNF抑制活性的小分子化合物的核酸。核酸以有效产生抑制蛋白质活性的量的上述化合物的浓度存在于组合物中。这可以由本^L术领域的普通技术人员来决定。
在上述诸实施方案中，涉及使用编码反义核酸或蛋白质(例如抗体、核酶、或小分子化合物，其用于抑制复合体III蛋白，如核心蛋白1的TNF抑制活性)的核酸；该核酸也可能含有一个或多个调控核酸编码部分表达的调控区。选择一个或多个合适的调控区是一项常规事项，而且属于本领域普通技术水平的范围。调节区包括启动子、增强子、抑制因子等等。
可用于本发明的启动子包括组成型启动子与调节型(可诱导性)启动子。可用于本发明实施的启动子实例包括普遍存在的启动子(如HPRT、波形蛋白、肌动蛋白、孩l管蛋白的启动子)、中间丝启动子(如结蛋白、神经丝、角蛋白、GFAP的启动子)、治疗性基因启动子(如MDR型启动子、CFTR、 VIII因子的启动子)；以及组织特异性启动子(如平滑肌细胞中的肌动蛋白启动子，或者在内皮细胞中有活性的Fit与Flk启动子)。
组织特异性启动子包括表现组织特异性的转录控制区，例如在胰腺腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等人，1984， Cell 38:639-646; Ornitz等人，1986， Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 50:399-409; MacDonald， 1987， Hepatology 7: 425-515);在胰腺(3细胞中有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan， 1985, Nature 315: 115-122);在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等人，1984，
15Cell 38: 647-658; Adames等人，1985, Nature 318: 533-538; Alexander等人，1987， Mol. Cell. Biol.， 7: 1436-1444)，在睾丸、乳房、淋巴细胞与肥大细胞中有活性的小鼠乳癌病毒控制区(Leder等人，1986, Cell 45:485-495)，在肝脏中有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等人，1987，Genes and Devel. 1: 268-276);在肝脏中有活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等人,1985， Mol. Cell. Biol.， 5: 1639-1648; Hammer等人，1987， Science 235: 53-58);在肝脏中有活性的al抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等人，1987， Genes and Devel.， 1: 161-171);在髓样细胞中有活性的p珠蛋白基因控制区(Mogram等人，1985， Nature 315: 338-340;Kollias等人，1986， Cell 46: 89-94);在大脑少突胶质细胞中有活性的髓鞘^5出蛋白基因控制区(Readhead等人，1987， Cell 48: 703-712);在骨骼肌细胞中有活性的肌球蛋白轻链2基因控制区(Sani， 1985， Nature314: 283-286)，以及在下丘脑中有活性的促性腺激素释放激素基因控制区(Mason等人，1986, Science 234: 1372-1378)。
其他可用于本发明实施的启动子包括，例如优先于分裂细胞中有活性的启动子、对刺激产生应答的启动子(如类固醇激素受体、视黄酸受体)、四环素调控的转录调节因子的启动子、巨细胞病毒立即早期的启动子、反转录病毒LTR的启动子、金属硫蛋白启动子、SV-40启动子、Ela启动子以及MLP启动子。关于四环素调控的转录调节因子与CMV启动子的叙述可参阅WO 96/01313号国际专利申请公开文本，以及美国第5,168,062号与第5,385,839号专利。
在本发明的实施方案中，组合物包括载体，其又含有上述核酸。载体是指将核酸转移进细胞的任何手段。术语"载体"包括将核酸导入细胞的病毒性手段与非病毒性手段。非病毒性载体包括，例如质粒、脂质体、带电荷的脂质(细胞转染剂)、DNA-蛋白质复合物以及生物多聚体等。病毒性栽体包括，例如反转录病毒、腺相关病毒、痘病毒、杆状病毒、痘苗病毒、单纯疱渗病毒、EB病毒以及腺病毒载体。除了核酸之外，栽体还可包含一或多个选择性标记，其用于选择、测量与监控核酸转移结果(如转移至何种组织、表达持续时间等)。
关于病毒性载体的使用，其可能是复制缺陷的，也就是说，其不能在靶细胞中进行自主复制。通常，复制缺陷型病毒载体的基因组缺乏至少一个病毒在感染细胞内复制所必需的核酸区域。这些区域可由本领域技术熟练人员通过任何已知的技术加以(完全或部分)剔除，或使其失去功能。这些技术包括对(用于复制的)必需区域进行完全剔除或替代(替代为其他序列，尤其是插入的核酸)、部分缺失，或添加一个或多个碱基等。借助于基因操作技术或通过诱变剂处理，这些技术操作可以在体外(在分离
的DNA上)或在体内实施。优选复制缺陷型病毒保留包被病毒颗粒所必需的基因组序列。
至于使用反转录病毒，其是感染分裂细胞的整合性病毒。反转录病毒基因组包括两个LTR， 一个衣壳包装序列，以及三个编码区(gag、 pol和env)。关于重组反转录病毒载体构建的叙述可参阅，例如第453242号与第178220号欧洲专利以及Bernstein等人，Genet. Eng.，7: 235 (1985)与McCormick， BioTechnology, 3: 689 (1985)两篇文献。在重组反转录病毒载体中，gag、 pol与env基因一般都会(全部或部分)缺失，并且由目的异源核酸序列替代。这些载体可以由不同类型的反转录病毒构建，例如MoMuLV ("鼠莫洛尼白血病病毒，，)、MSV("鼠莫洛尼肉瘤病毒，，)、HaSV ("哈威肉瘤病毒，，)、SNV ("肾脏坏死病毒，，)、RSV ("劳斯肉瘤病毒，，)以及"Friend病毒，，。慢病毒载体系统也可以用于实施本发明。该慢病毒基因组是具有卯OO-IOOOO个碱基对的正链多聚腺苷酸RNA,含有三个从5'至3，端方向排列的所有典型反转录病毒的结构基因(gag、 pol、 env )。欲详细了解'漫病毒系统，请参阅Fields Virology, SecondEdition, Volume 2， Chapter 55, "Lentiviruses"(慢病毒)，第1571-1589页,Raven Press, New York, 1990。
通常，为了构建包含本发明核酸的重组反转录病毒，需构建包含LTR、衣壳包装序列以及编码序列的质粒。此构建体用于转染能够反向提供质粒所缺乏的反转录病毒功能的包装细胞系。通常，该包装细胞系因此可以表达gag、 pol与env基因。这类包装细胞系已经在先前技术中介绍，尤其是PA317细胞系(美国第4,861,719号专利)、PsiCRIP细胞系(WO90/02806号国际专利申请公开文本)以及GP+envAm-12细胞系(WO89/07150号国际专利申请公开文本)。另外，重组反转录病毒载体可以包含在LTR内抑制转录活性的修饰成分，以及包含外延的可能携带部分gag基因序列的衣壳包装序列(Bender等人，J. Virol. 61 (1987) 1639)。重组反转录病毒载体可由本领域普通技术人员已知的标准技术予以纯化。
至于腺相关病毒(AAV)的使用，其是相对较小的DNA病毒，可以稳定地以位点特异的方式整合到受其感染的细胞基因组内。其能够感染广谱的细胞类型，而不会对细胞的生长、形态或分化造成任何影响；其似乎并未涉及人类病理学。AAV基因组已经被克隆、测序以及特征鉴定。其包含大约4700个碱基，并在两端各含有一个长度大约为145个碱基的末端反向重复(ITR)区，可以作为病毒的复制起点。其余的基因组部分可分成两个携带衣壳包装功能的必需区域该基因组的左手边部分含有与病毒复制以及病毒基因表达有关的rep基因；该基因组的右手边部分含有编码病毒衣壳蛋白的cap基因。
已有文献介绍使用来源于AAV的载体进行体外及体内基因转移(参阅WO 91/18088与WO 93/09239号国际专利申请公开文本；美国第4,797,368号与第5，139，941号专利;以及欧洲第488528号专利)。这些文献介绍了 rep和/或cap基因缺失并由目的基因替代的多种不同的AAV衍生构建体，以及这些构建体在体外(进入培养的细胞)或体内(直接it^有机体)目的基因转移方面的应用。本发明中所用的复制缺陷型重组AAV可通过将含有两侧分别带一个AAV末端反向重复(ITR)区域的目的核酸序列的质粒与携带AAV衣壳包装基因(rep与cap基因)的质粒共转染进入以人类辅助病毒(例如腺病毒)感染的细胞系而制备。然后，所得的AAV重组子再以标准技术予以纯化。
在优选实施方案中，本发明所用的栽体是腺病毒载体。腺病毒属于真核DNA病毒，可以加以修饰以便有效地将核酸输送进多种类型的细胞中。腺病毒存在各种各样的血清型。用于实施本发明的优选血清型为2型 或5型人源腺病毒(Ad2或Ad5 )或动物源腺病毒(参阅WO 94/26914号 国际专利申请公开文本)。动物源腺病毒包括，例如犬源腺病毒、牛源腺 病毒、鼠源腺病毒(如Mavl， Beard等人,Virology 75: 81 (1990))、羊 源腺病毒、猪源腺病毒、鸟源腺病毒以及猿源腺病毒(如SAV)。动物源 腺病毒优选犬源腺病毒，更优选CAV2腺病毒(例如Manhattan或A26/61 病毒林(ATCC VR-謂))。
优选复制缺陷型腺病毒载体包含ITR、衣壳包装序列，以及目的核酸。 更优选腺病毒载体至少在El区没有功能活性。El区的缺失优选位于Ad5 腺病毒核酸序列的第455并延伸至第3329位核苷酸。其他区域也可以修饰， 尤其是E3区(参阅WO 95/02697号国际专利申请公开文本)；E2区(参 阅WO 94/28938号国际专利申请公开文本)；E4区(参阅WO 94/28152、 WO 94/12649以及WO 95/02697号国际专利申请公开文本)，或晚期基因 Ll-L5中的任何区域。WO 95/02697号国际专利申请公开文本披露了缺陷 型反转录病毒载体。
在优选的实施方案中，腺病毒载体在E1区和E4区有缺失。在另一项 优选实施方案中，腺病毒载体在E1区有缺失，在该缺失区域插入了 E4区 以及目的核酸的编码序列(参阅第94 13355号法国专利公开文本)。
任何适宜的技术都可以用于制备复制缺陷型重组腺病毒。典型的技术 可参阅Levrero等人，Gene 101: 195(1991);欧洲第185 573号专利；以 及Graham, EMBOJ.， 3: 2917(1984)。尤其是，腺病毒可以通过腺病毒 与除了其它之外还携带目的核酸的质粒之间的同源重组而制备。同源重组 可以在将所述腺病毒与质粒共转染入适当的细胞系后而实现。所用的细胞 系优选是(i)可以由所述元件转化，以及(ii)含有能够与该复制缺陷型 腺病毒基因组的部分(优选完整形式的)核酸序列互补的序列，以免出现 重组的危险。可以使用的细胞系的实例包括人胚肾细胞系293 (参阅 Graham等人，J. Gen. Virol., 36: 59 (1977))，其基因组中整合有Ad5 腺病毒基因组的左手边部分(12% ),以及能够与El和E4功能区互补的
19细胞系(参阅WO 94/26914号与WO 95/02697号国际专利申请公开文本) 重组腺病毒的回收及纯化可采用本领域普通术人员熟知的标准分子生物与 技术进行。
某些非病毒体系也应用于本技术领域，它们亦有助于将核酸导入细胞
例如，可用脂质体借助于脂质转染法将核酸导入细胞。使用阳离子脂 质可以促进带负电荷的核酸的包被，并可促进与带负电荷的细胞膜的融合 (参阅Feigner和Ringold， Nature 337: 387-388(1989))。关于特别有利 于核酸转移的脂质化合物及组合物的叙述参阅WO 95/18863与WO 96/17823号国际专利申请公开文本以及美国第5,459,127号专利。使用脂质 转染法体内将外源基因导入特定器官具有其一定的实用优势。脂质体针对 特定细胞的分子靶向转染代表了一个有利的方面。显然，在具有细胞异质 性的组织(例如胰腺、肝脏、肾脏以及大脑)中，将特定细胞类型的定向 转染将具有特别的优越性。为了实现靶向转染的目的，可将脂质以化学方 法偶联到其他分子上。靶向肽(如激素或神经递质)和蛋白质(如抗体) 或非肽性分子，都可以化学方法偶联到脂质体上。
其他分子也可用于促进体内转染核酸，例如阳离子寡肽分子(参阅例 如WO 95/21931号国际专利申请公开文本)、从DNA结合蛋白质衍生的 肽(参阅例如WO96/25508号国际专利申请公开文本)，以及阳离子多聚 体(参阅例如W095/21931号国际专利申请公开文本)。
也可以将核酸以棵露核酸载体的方式导入细胞(参阅美国第5,693,622 号、第5，589，466号以及第5,580,859号专利)。供基因治疗用的棵露核酸 栽体可通过本领域已知的方法导入预定的宿主细胞，例如转染、电穿孔、 显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钓沉淀、使用基因枪、 或者使用DNA栽体运载工具等(参阅例如Wilson等人，J. Biol. Chem. 267: 963-967 (1992); Wu和Wu， J. Biol. Chem. 263: 14621-14624 (1988); Hartmut等人，Canadian Patent No. 2,012,311; Williams等人，Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88: 2726-2730 (1991))。亦可使用受体介导的DNA转移 方法(Curiel等人，Hum. Gene Ther.3: 147-154 (1992); Wu和Wu， J. Biol.
20Chem. 262: 4429-4432 (1987))。
本发明体提供了组合物，其含有本发明的抑制剂以及载体。载体是使 得存在于其中的抑制剂处于活性形式，例如处于能够发挥生物活性形式的 物质。例如，核酸可以复制、翻译信息，或者可以与互补核酸杂交；栽体 可以转染靼细胞；抗体可以结合核心蛋白1。通常，这种载体是含水緩冲 液，如含有盐离子的Tris緩沖液、磷酸盐緩冲液、或HEPES緩冲液等。 通常，盐离子浓度会与生理水平相似。出于指导的目的，据信大多数应用 皆涉及使用占组合物重量约40%至约98%的载体。在某些实施方案中，栽 体占组合物重量的约50%至约98%。
该组合物还可含有稳定剂、防腐剂以及其他赋形剂。
本发明组合物可以配制成以口服或胃肠外给药(如以局部、经鼻、皮 下以及眼内途径给药)的剂量形式。胃肠外给药包括静脉内注射、肌内注 射、动脉内注射或灌注给药技术。组合物可以剂量单位的形式以胃肠外方 式给药，该剂量单位根据需要含有标准的、众所周知且在生理上可接受的 无毒性载体、佐剂以及媒介物。
优选的无菌可注射性制剂可以是在一种无毒、胃肠外方式给药可接受 的载体中的抑制剂的溶液或悬浮液。药学上可接受的载体的实例为生理盐 水、緩冲型生理盐水、等渗型生理盐水(如磷酸二氢钠或磷酸氢二钠、氯 化钠、氯化钾、氯化钩或氯化镁，或这类盐的混合物)，Ringer氏溶液、 葡萄糖、水、无菌水、甘油、乙醇以及其组合等。1，3-丁二醇以及无菌固定 油(fixed oils)可以很方便地作为溶剂或悬浮介质使用。任何温和的固定 油都可以使用，包括合成的单酰甘油或二酰甘油。脂肪酸(例如油酸)也 可用于可注射制剂。
载体也可以是水凝胶，其由任何生物相容性或非细胞毒性(同相或异 相)聚合物制成，例如作为海绵体其中吸附抑制剂而起作用的亲水性聚丙 烯酸聚合物。关于这些聚合物的叙述，可参阅WO 93/08845号国际专利申 请公开文本。水凝胶可以直接沉积到所治疗组织的表面。
本发明另一个优选实施方案包括含有作载体用的泊洛莎姆的药物组合
21物。该泊洛莎姆经过浸渍载有携带了本发明核酸序列的复制缺陷型重组病
毒。优选的泊洛莎姆为市售的Poloxamer 407 (BASF, Parsippany， NJ)， 其是无毒的生物相容性多元醇。泊洛莎姆实质上具有与水凝胶同样的优点， 但粘度较低。
本发明提供了一种治疗方法，包括向人或其他动物施用有效剂量的本 发明组合物。取决于年龄、所治疗疾病的类型和严重程度、体重、所需的 治疗时间、施用方法以及其他参数的差异，组合物的有效剂量可能会有所 不同。有效的施用剂量由医师或其他有资格医学专业人员确定。
本发明还提供了检测化合物的方法，以确定它们是否能够作为复合体 III蛋白(如核心蛋白1)的TNF抑制活性的抑制剂而起作用。在检测方 法中，比较对于表达复合体III蛋白(如核心蛋白1)、已知对TNF诱导 的凋亡有天然抗性，以及与TNF超家族(以下简称为"TNF")成员和该 化合物两者都已接触的细胞的生存力，与来源于同 一细胞系并同样表达复 合体III蛋白、且接触了该化合物但未接触TNF的对照细胞的生存力。细 胞的生存力可采用Cell Titer Blue检测法测定。该方法通过细胞将刃天青 染料还原成强荧光性形式的试卣灵(可使用分光光度计检测)的能力检测 细胞的代谢能力(从而确定细胞的生存力)。
如果化合物显著地降低了两种细胞(与TNF接触过的细胞以及对照细 胞)的生存力，那么可以认为该化合物的活性与TNF无关，且该化合物并 非是值得关注的化合物。如果化合物显著地降低了与TNF接触过的细胞的 生存力，但没有影响对照细胞的生存力，那么可以认为该化合物使细胞对 TNF的凋亡活性变得敏感，因为已知该细胞系以前对TNF有抗性。由于 细胞表达复合体III蛋白，故可以推论，受试化合物通过抑制复合体III蛋 白的TNF抑制活性而起作用。
当接触过TRAIL和该受试化合物的细胞的生存力比对照细胞的生存 力至少低大约30%时，可以认为该化合物显著地降低了细胞的生存力。
在本发明的实施方案中，将表达复合体III蛋白(如核心蛋白l)并且 来源于已知对TNF诱导的凋亡具有天然抗性的细胞系的细胞在TNF存在
22的条件下培养(例如培养24小时)，然后再与受试化合物接触。将来源于 同一细胞系的对照细胞在没有TNF存在的条件下培养相同的时间，并与同 样的化合物接触。然后检测和比较细胞的生存力。
实质上，任何已知对TRAIL诱导的凋亡具有天然抗性、表达目的复 合体III蛋白或已经修饰(例如通过转染表达该蛋白的转基因)为表达该 蛋白质的细胞系，皆可用于实施此项检测。这种细胞系的一个实例是 HCT116结肠癌细胞系，其经过工程改造以稳定地表达核心蛋白1。核心 蛋白1转基因可通过例如用本领域中使用的标准慢病毒、反转录病毒或腺 病毒表达载体感染HCT116细胞系的方式导入细胞。本发明还包含不必表 达整个蛋白质的细胞，只要其表达能够抑制TNF的凋亡诱导活性的那部分 蛋白质即可。因此，细胞可以只包含或经改造只包含编码复合体III蛋白 这一部分的核酸。
细胞可以于37°C与纳摩尔至微摩尔浓度的受试化合物接触24至96 小时，且细胞的生存力可用市售的试剂(例如WST-1、 MTT以及胱天蛋 白酶-3试剂)检测。化合物对细胞周期进程的影响可以通过FACS分析或 通过本领域内使用的其他标准基于影像技术的分析法进行检测。上述所有 基于该化合物的实验也可在低氧(1-2%氧含量)条件下实施，以确定在 TRAIL存在条件下低氧条件是否增加或诱导细胞死亡。
通过将溶于适当载体溶液(如磷酸盐緩冲溶液)的TRAIL以约50至 约200 ng/ml的浓度直接添加到装有细胞的容器内，并在此条件下培养细 胞至多约96小时而使细胞与TRAIL接触。实施例 实施例1
此实例叙述了一项发现，即核心蛋白1涉及对TRAIL介导的凋亡的 抵抗。
小鼠E14 cDNA文库g HCT116结肠癌细胞系是已知对TRAIL诱导 的凋亡敏感的细胞系，对其进行了功能遗传筛选(图1A)。此筛选发现编 码核心蛋白1的UQCRC1涉及对TRAIL介导的凋亡的4氐抗。
将HCT116细胞(来自位于美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养 物保藏中心)和293 EBNA包装细胞系(Invitrogen)分别在DMEM培养基 (Dulbecco，s modified Eagle's Medium)中于37。C和5% CO;t的条件中培 养。该DMEM培养基含有10。/。热灭活的胎牛血清(FBS)和1%的青霉素-链霉素(Gibco)。
将第14天的小鼠胚胎反转录病毒cDNA文库(马萨诸塞州剑桥麻省 理工学院George Daley赠)克隆进pEYK反转录病毒载体，并使用 Lipofectamine脂质体(Invitrogen)将其转染入上述293 EBNA包装细胞系。 于转染后48至72小时收集上清液。将该上清液与10 mg/mL Polybene混 合并用于感染上述HCT116细胞，该细胞在感染前已培养了 48小时。感 染后48小时，将1.0X 106细胞置于15 cm培养皿中，并用200 ng/mL重 组人TRAIL (BioMol， Plymouth Meeting,宾夕法尼亚州)处理10天。每 隔48小时更换新鲜培养基和TRAIL。分别收获抵抗TRAIL诱导的凋亡的 克隆产物。
将细胞重新悬浮在消化緩冲液(IOO nM NaCl， 10 mM Tris pH 8， 25 mMEDTA， 0.5。/oSDS)中，再以蛋白酶K于最终浓度100 jug/ml于50。C 处理12小时，从而将基因组DNA从该抵抗性克隆产物中分离出。以苯酚 -氯仿萃取样品并以乙醇沉淀。然后使用文库特异性引物扩增候选cDNA， 或直接利用回收的反转录病毒质粒重复进行另一次筛选。发现可能对 TRAIL诱导的凋亡产生抵抗的一个令人感兴趣的候选cDNA，是泛醌醇细胞色素c还原酶核心亚单位l(UQCRCl)的cDNA，其编码核心蛋白1 (图 IB)。
实施例2
为了进一步鉴定核心蛋白l抵御TRAIL诱导的凋亡的能力，将含有 筛选所分离的UQCRC1的部分cDNA的pEYK载体直接用于感染HCT116 细胞。表达显性阴性的FADD (dnFADD)的细胞用作为对照物，该dnFADD 抑制TRAIL受体发信号。以0、 10或50 ng/mL TRAIL处理细胞48小时， 并检测作为凋亡早期标记的膜联蛋白V (图2A) 。 dnFADD的表达抑制了 TRAIL诱导的凋亡，当TRAIL浓度为50 ng/ml时，78%的细胞为膜联蛋 白V阴性或呈非凋亡性。在表达绿色荧光蛋白(GFP)的细胞中，当TRAIL 浓度为50ng/ml时，只有2。/。的细胞为膜联蛋白V阴性，相比之下，在表 达核心蛋白1的细胞中则14.5%的细胞为膜联蛋白V阴性，对TRAIL诱 导的凋亡的保护增加了 7倍。这说明部分核心蛋白1的表达提供了一定程 度的保护作用，但并未完全抑制TRAIL诱导的凋亡。
实施例3
由于核心蛋白1是线粒体呼吸复合体III的一个亚单位，故还进行了 一些工作以确定核心蛋白1的表达是否抗线粒体的去极化，其为线粒体介 导的凋亡中的关键步骤。使用JC-1分析试剂盒(Molecular Probes )研究 了 TRAIL处理过程中线粒体膜电位的变化。JC-1 ( 5， 5，， 6， 6，-四氯-1， 1，， 3， 3，-四乙基苯并咪唑基羰花青)是一种阳离子染料，其在细胞质内产生漫射 绿色荧光。JC-1在线粒体内的积累(取决于完整和极化的线粒体)导致了 红色荧光聚集体的形成。对上述实施例2中描述的细胞，以荧光激活细胞 分选法(FACS)测量了绿色荧光与红色荧光的比率。FACS是以细胞表面特 殊标记(例如红色或绿色荧光)为基础分选细胞的方法。将上述比率作为 极化线粒体的百分比作图。
在所有各种TRAIL浓度处理之下，dnFADD的表达都完全抵御线粒 体的去极化，而当TRAIL的浓度为50 ng/ml时，表达GFP的细胞仅有7%的细胞保留了极化的线粒体。部分核心蛋白1的表达显示出38%的细 胞保留极化的线粒体，对线粒体去极化的保护作用5倍于GFP (图2B)。 因此，核心蛋白1也能抗线粒体去极化。
实施例4
为了确证从部分核心蛋白l观察到的保护作用表明了其功能，将人的 全长核心蛋白1克隆进pLenti载体(含有HA标记)并用于感染HCT116, 以产生表达核心蛋白1的稳定细胞系。以类似方式制备了表达黄色荧光蛋 白(YFP)的对照细胞系。为了确证全长核心蛋白1的蛋白质表达，将细胞 匀质化以制备线粒体和细胞质裂解液，并用核心蛋白1的抗体做Western 印迹试验(图2C)。在表达YFP和核心蛋白1的细胞的线粒体成分上都 检测到了内源性核心蛋白1。外源性表达的核心蛋白1带HA标记，并在 线粒体成分和细胞质成分中都作为一种较高的迁移带而检出。这种表， 式并非是细胞质成分由线粒体蛋白质污染的结果，因为COXl (复合体IV 亚单位I)仅在线粒体成分内检出，而作为细胞质标记的SOD1 (超氧化物 歧化酶1)，不能在线粒体成分内检测出细胞质的蛋白质。因此，核心蛋 白1在这些HCT116稳定细胞系中表达。为了确定全长核心蛋白l是否也 能抵抗TRAIL诱导的凋亡，用TRAIL处理细胞并以FACS分析法分析膜 联蛋白V为阳性或阴性的细胞而检测凋亡情况。当TRAIL浓度为50 ng/ml 时表达核心蛋白1的细胞显示了 2.5倍的抵抗TRAIL诱导的凋亡的能力 (图2D )。这些资料显示，核心蛋白1在HCT116内的表达抵抗了 TRAIL 诱导的凋亡及线粒体去极化。
实施例5
这一实施例显示了核心蛋白1对胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶9及胱天 蛋白酶3的活性的抑制作用。
将稳定表达YFP或人类全长核心蛋白1的细胞用200 ng/ml TRAIL处 理24小时、裂解，并用数种胱天蛋白酶的抗体做Western印迹试验。通过将全长胱天蛋白酶原裂解为较小的活性形式，检测出胱天蛋白酶的激活。
当受到TRAIL刺激时，与表达YFP的细胞相比，表i^A类全长核心蛋白 1的HCT116显示出活性较弱的胱天蛋白酶8 (图3A)。而且，核心蛋白 1的表达类似地导致了胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3的活性降低。因此， 当受到TRAIL刺激时，核心蛋白1的表达抑制了胱天蛋白酶8、胱天蛋白 酶9及胱天蛋白酶3的完整活性。
实施例6
这一实施例显示了核心蛋白1对细胞色素c从线粒体释放的影响。 将稳定表达YFP或人类全长核心蛋白1的HCT116细胞用100 ng/ml TRAIL处理24小时。稳定表达YFP或人类全长核心蛋白1的对照细胞则 未用TRAIL处理。然后收获细胞。先将含有悬浮细胞的培养液移至新的 试管。使用细胞刮将其余的贴壁细胞刮入冰冷的PBS内并加入上述含有悬 浮细胞的培养液中。将细胞于4°C和1000 X g离心10分钟使其沉淀，并 重新悬浮于等渗緩冲液内(0.3M蔗糖、10mM Tris pH7.5、 ImM EDTA 及不含EDTA的蛋白酶片)。在水上培育5分钟之后，使用杜恩斯匀浆器 裂解细胞直至约卯％的细胞膜裂解。这一步骤是为了分离出细胞质成分。 通过将10nl裂解液与锥虫蓝混合并在血细胞计数器上观察的方式监视细胞 裂解的程度。将上清液转移至干净试管并于4°C和8000 X g离心10分钟， 以使线粒体沉淀。使用BioRad DC蛋白质分析法(BioRad)或BCA法 (Pierce, Rockford, Illinois)测定了裂解液的浓度。为了定量检测细胞色素 c的含量，使用功能性ELISA细胞色素c试剂盒(Active Motif, Carlsbad, 加利福尼亚州)，以检测裂解液中的细胞色素c (图3B)。在未经处理的细 胞中，在细胞质中检测出低的细胞色素c基线含量。当用TRAIL处理时， 在表达YFP的细胞中释放至细胞质成分的细胞色素c量增加了 10倍，而 表达核心蛋白1的细胞仅释放了一半的细胞色素c (图3B)。这项工作表 明当用TRAIL处理时，核心蛋白1的表达也降低了从线粒体释放至细胞 质的细胞色素c的量。
27实施例7
为了确定核心蛋白1是抵抗TRAIL i秀导的凋亡还是4氐抗通过其他途 径诱导的凋亡，用数种不同的凋亡诱导剂处理细胞并检测了细胞的生存力。 Fas配体(FasL)也是通过死亡受体发出信号的TNFa家族成员，其利用同样 的衔接蛋白FADD来诱导胱天蛋白酶的激活和凋亡。将稳定表达黄色荧光 蛋白(YFP)或人类全长核心蛋白1的细胞用100 ng/ml TRAIL或16 ng/ml FasL处理24小时。用Cell-Titer Blue检测法检测细胞生存力，利用指示 剂染料刃天青的转化来测量作为细胞生存力指示的细胞代谢能力。核心蛋 白1的表达对类似于TRAIL的FasL所诱导的凋亡产生了大约3倍的抵抗 作用(图3C)。这一结果表明核心蛋白1能够抵抗由死亡受体发信号诱导 的凋亡。
然后，用两种通过非死亡受体途径诱导凋亡的化合物处理细胞。喜树 碱抑制DNA拓朴异构酶I，最终导致DNA损伤和死亡，而多西他赛则是 微管解聚的抑制剂，其阻止细胞分裂并导致有丝分裂死亡。当用200 nM 喜树碱的二曱基亚砜溶液或10 nM多西他赛的二甲基亚砜溶液处理时，在 表达YFP或人类全长核心蛋白1的细胞之间未见到生存力方面的区别(图 3D)。这些结果表明核心蛋白1不能抵御由DNA损伤或微管解聚的抑制 而引起的其他非死亡受体介导的凋亡。这些资料有力地表明核心蛋白l在 TRAIL诱导的凋亡的调控过程中发挥作用，并与核心蛋白l对TRAIL诱 导的凋亡产生了部分抵御作用的观察结果相一致。
实施例8
此实施例说明使用siRNA来抑制核心蛋白1的表达。 将含有内源性核心蛋白1 (且不含外源性核心蛋白1)的HCT116细 胞在转染前按照每孔1X1()5个细胞的方式分配于6孔培养sni中，在不含青 霉素/链霉素的培养基中培养24小时。按照制造商的说明用Lipofectamine 2000脂质体(Invitrogen)转染细胞。将细胞分别与单独含有Lipofectamine(对照细胞)、含有3.75 nM针对UQCRC1的siRNA (SMARTpool)，或 非乾向siRNA (无效)(Dharmacon, Lafayette, CO)的转染混合物培养72 小时。通过制备裂解液和使用核心蛋白1抗体进行Western印迹试验来测 定蛋白质的浓度(图4A)。将印迹再次洗脱并使用微管蛋白的抗体再次探 测以作为加载量的参照。核心蛋白1的转染导致核心蛋白1下降90%，而 单独用Lipofectamine转染或用无效siRNA转染却未影响核心蛋白1的水 平(图4B )。
然后，将以上每组细胞用各种浓度的TRAIL再处理24小时，并用 Cell Titer Blue检测法(Promega, Madison,威斯康辛州)检测细胞的生存 力。此检测法根据其将染料刃天青还原为荧光性强的试卣灵的能力，测量 细胞的代谢能力(从而测量其生存力)。所加入Cell Titer Blue试剂(一 种含有高纯度刃天青的緩沖溶液)的量是培养基体积的20%。将细胞于 37°C温育2至3小时，并使用底部读数的荧光读板器于560nm激发波长 和590nm发射波长检测。将细胞一式三份进行实验。然后用2倍冷PBS (Gibco)洗涤该细胞，并在100 jil冰冷的裂解緩冲液(50 nM HEPES pH 7.4， 250nMNaCl， 2nMEDTA, 1% Triton X-100，不含EDTA的蛋白酶抑制 剂(Roche))中裂解。将裂解液于4°C以3500转/分钟离心10分钟。将上 清液与4倍LDS样本緩冲液(Invitrogen)混合并于90°C加热10分钟，然 后于-20。C储存。检测结果如图4C所示。所显示的结果是4次单独实验的 平均值。核心蛋白1敲除的细胞于25 ng/mL TRAIL浓度下仅显示出60% 的生存力，而在同样浓度下的对照或无效转染的细胞的生存力则为90至 95% (图4C)。核心蛋白1敲除的细胞于50 ng/ml时显示出低于50%的 生存力，而在无效转染的细胞中则需要两倍量的TRAIL才能诱导50%的 生存力。虽然单独用无效siRNA的转染似乎比单独用Lipofectamine转染 产生对TRAIL的敏感性的影响，但这一资料明确地显示，核心蛋白1的 降低使细胞对TRAIL诱导的凋亡敏感化，尤其是在较低的浓度时。这些 资料有力地证明，核心蛋白1在调节TRAIL诱导的凋亡过程中发挥作用。实施例9
此实施例叙述了确定化合物是否抑制核心蛋白1活性的检测方法。 待分析的化合物以在适宜载体(如二曱基亚砜、乙醇、緩冲盐水)中 的10 jiM浓度加入预先用核心蛋白1 DNA感染的HCT116细胞(来自位 于美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心)中。然后将该细 胞置于含10% FBS的DMEM培养基中，在适宜浓度(最高为200 ng/ml) 的TRAIL存在条件下培养24小时。也以10 nM浓度将该化合物加入到预 先用核心蛋白1 DNA感染的HCT116细胞中。再将该细胞置于含10% FBS 的DMEM培养基中，在无TRAIL存在条件下培养(对照细胞)，并保持 24小时。
然后在PBS中洗涤该细胞，并以WST-1分析法测定这些细胞的生存 力。WST-1分析法通过测量化学底物WST还原为可溶性甲月曾盐的程度来 测量细胞生存力；该甲膽盐则以分光光度计检测。Cell-Titer Blue检测法 可作为WST-1分析法的一种替代方法。
如果该化合物既能显著地降低在TRAIL存在条件下培养的细胞的生 存力，也能降低在无TRAIL存在条件下培养的对照细胞的生存力，则认 为该化合物的活性与TRAIL无关，而且将不认为该化合物是所感兴趣的 化合物。如果该化合物能显著地降低在TRAIL存在条件下培养的细胞的 生存力，但不能降低上述对照细胞的生存力，那么认为其能使该细胞对 TRAIL的凋亡活性敏化，因为先前已知表达核心蛋白1的HCT116细胞系 抗TRAIL。由于先前还已知细胞对TRAIL诱导的凋亡的抗性是由核心蛋 白1引起的，因此可以推论，受试化合物通过抑制核心蛋白1的TRAIL 抑制活性而起作用。
30
权利要求
1.一种组合物，其含有(A)抑制复合体III蛋白活性的抑制剂；以及(B)载体。
2. 如权利要求i所述的组合物，其中所述复合体in蛋白是核心蛋白i。
3. 如权利要求1所述的组合物，其中所述抑制剂是抑制复合体III蛋白表达的反义核酸。
4. 如权利要求1所述的组合物，其中所述抑制剂是编码反义核酸的核酸；该反义核酸抑制编码复合体III蛋白的基因的表达。
5. 如权利要求4所述的组合物，其中所述核酸包括启动子区域。
6. 如权利要求4所述的组合物，其中所述核酸包含于载体中。
7. 如权利要求1所述的组合物，其中所述抑制剂是抑制编码复合体III蛋白的基因表达的siRNA。
8. 如权利要求1所述的组合物，其中所述抑制剂是能与复合体III蛋白结合并降低其活性的抗体。
9. 如权利要求1所述的组合物，其中所述抑制剂是核酸，其编码能与复合体III蛋白结合并降低其活性的抗体。
10. 如权利要求9所述的组合物，其中所述核酸包括启动子。
11. 如权利要求9所述的组合物，其中所述核酸包含于载体中。
12. 如权利要求1所述的组合物，其中所述抑制剂是能降低复合体III蛋白表达的核酶。
13 如权利要求l所述的组合物，其中所述抑制剂是核酸，其编码能降低复合体III蛋白表达的核酶。
14. 如权利要求13所述的组合物，其中所述核酸包括启动子。
15. 如权利要求13所述的组合物，其中所述核酸包含于载体中。
16. 如权利要求1所述的組合物，其还含有肿瘤坏死因子超家族的成员。
17. 如4又利要求16所述的组合物，其中所述成员是TRAIL。
18. 如权利要求16所述的组合物，其中所述成员是Fas配体。
19. 一种治疗患者肿瘤的方法，包括向该患者施用组合物的步骤，该组合物含有抑制复合体III蛋白活性的抑制剂和栽体。
20. 如权利要求19所述的方法，其中所述复合体III蛋白是核心蛋白1。
21. 如权利要求19所述的方法，其中所述组合物含有抑制肺瘤坏死因子超家族成员活性的抑制剂。
22. 如权利要求21所述的方法，其中所述成员是TRAIL。
23. 如权利要求21所述的方法，其中所述成员是Fas配体。
24. 如权利要求19所述的方法，其还包括施用肿瘤坏死因子超家族的成员。
25. 如权利要求21所述的方法，其中所述成员是TRAIL。
26. 如权利要求21所述的方法，其中所述成员是Fas配体。
27. —种制备含有抑制复合体III蛋白活性的抑制剂和栽体的组合物的方法，其包括将所述抑制剂与所述载体混合。
28. 如权利要求27所述的方法，其中所述复合体III蛋白是核心蛋白1。
29. —种制M有抑制复合体III蛋白活性的抑制剂、载体以及肿瘤坏死因子超家族成员的组合物的方法，其包括将所述抑制剂、所述载体及所述超家族成员混合。
30. 如权利要求29所述的方法，其中所述复合体III蛋白是核心蛋白1。
31. —种进行检测以确定化合物是否是复合体III蛋白的TNF抑制活性的抑制剂的方法，包括将在TNF超家族成员存在条件下生长并已与所述化合物接触的表达所述复合体III蛋白的(A)细胞的生存力与在TNF超家族成员不存在的条件下生长并已与所述化合物接触的属于同一细胞系且表达所述复合体III蛋白的(B)细胞的生存力作比较。
32. 如权利要求31所述的方法，其中所述复合体III蛋白是核心蛋白1。
33. 如权利要求32所述的方法，其中所述细胞来自HCT116细胞系并已由编码核心蛋白1的外源性转基因所转染。
34. 如权利要求33所述的方法，其中所述转基因是人类转基因。
35. 如权利要求32所述的方法，其中所述细胞来自HCT116细胞系并已由编码核心蛋白l一部分的外源性转基因所转染。
36. 如权利要求31所述的方法，其中所述TNF超家族成员是TRAIL 。
37. —种进行检测以确定化合物是否是复合体III蛋白的TNF抑制活性的抑制剂的方法，其包括(A) 使所述化合物与在TNF超家族成员存在条件下生长的表达所述蛋白质的细胞接触一段预定的时间；(B) 使该化合物与在TNF超家族成员不存在条件下生长的且属于如上所述同一细胞系并表达所述蛋白质的细胞接触一段相同的预定时间；以及(C) 将上面(B)中所述细胞的生存力与上面(A)中所述细胞的生存力作比较。
38. 如权利要求37所述的方法，其中所述复合体III蛋白是核心蛋白1。
39. —种进行检测以确定化合物是否是复合体III蛋白的活性的抑制剂的方法，其包括(A) 在TNF超家族成员存在条件下培养表达所述蛋白质的来自某细胞系的细胞；(B) 在TNF超家族成员不存在的条件下培养表达所述蛋白质的属于同一细胞系的细胞；(C) 使所述化合物与上面(A)中所述的细胞接触；(D) 使所述化合物与上面(B)中所述的细胞接触；以及(E) 在一段预定的时间之后，将上面(B)中所述细胞的生存力与上面(A)中所述细胞的生存力作比较。
40. 如权利要求39所述的方法，其中所述复合体III蛋白是核心蛋白1。
41. 一种进行检测以确定化合物是否是复合体III蛋白的TNF抑制活性的抑制剂的方法，其包括将已与TNF超家族成员及所述化合物接触的表达所述蛋白质的细胞的生存力与已与所述化合物接触但未与TNF超家族成员接触的且属于同一细胞系的表达所述蛋白质的细胞的生存力作比较。
42. 如权利要求41所述的方法，其中所述复合体III蛋白是核心蛋白1。
43. —种进行检测以确定化合物是否是复合体III蛋白的TNF抑制活性的抑制剂的方法，其包括(A) 使来自某细胞系的表达所述蛋白质的细胞与TNF超家族成员及所述化合物接触。(B) 使属于同 一 细胞系的表达所述蛋白质的细胞与所述化合物接触但不与TNF超家族成员接触；以及(C) 将上面(B)中所述细胞的生存力与上面(A)中所述细胞的生存力作比较。
44. 如权利要求36所述的方法，其中所述复合体III蛋白是核心蛋白1。
全文摘要
本发明涉及用于治疗肿瘤的组合物，制备这种组合物的方法，以及使用这种组合物的方法。本发明还涉及一种用于检测核心蛋白1和/或线粒体呼吸复合体III的其他蛋白质活性的抑制剂的检测方法。
文档编号C12N15/113GK101495633SQ200780027843
公开日2009年7月29日 申请日期2007年7月25日 优先权日2006年7月28日
发明者P·奥古斯特, S·利伯曼, S·纳特森, W·J·黄 申请人:塞诺菲-安万特股份有限公司