专利名称：一种有菌肿瘤组织全抗原的灭菌处理方法
技术领域：
本发明属于肿瘤生物治疗技术领域，涉及第三类医疗技术的自体免疫细胞治疗， 具体是涉及一种有菌肿瘤组织全抗原的灭菌处理方法。
背景技术：
肿瘤是严重危害人民生活和健康的重大疾病之一。目前，恶性肿瘤是全球第二大 导致死亡的疾病，也是中国城乡居民第一位死亡原因，中国每年新发病肿瘤患者总数约200 万人，新增肿瘤患者年均增长率在10%左右。手术、化疗、放疗仍是肿瘤的主要治疗方法。但 是，即使根治性手术也只能解决局部问题，不能避免全身转移。化疗、放疗存在的最大问题 是其杀伤作用没有针对性，长期的化疗、放疗会损伤机体的免疫系统及各器官组织的功能， 甚至诱发新的癌变。更为重要的是由于肿瘤细胞缺乏特异性的抗原、肿瘤细胞的抗原调变 及MHC分子表达异常等因素导致肿瘤免疫逃逸，成为肿瘤治疗的一大难题。由于传统的手术、放化疗的发展已进入平台期，人们把越来越多的目光投到肿瘤 的生物治疗上。肿瘤生物治疗(Biotheropy)是应用现代生物技术及其产品进行肿瘤防治 的新疗法，它通过调动宿主的天然防卫机制或给予天然(或基因工程)产生的针对性靶向 性很强的物质来取得抗肿瘤的效应。随着对肿瘤发生发展分子机制的深入研究和生物技术 的发展，生物治疗已经成为肿瘤综合治疗中的第四种模式。生物治疗对放、化疗不敏感及无 法耐受放、化疗的老年患者来说是一大福音，可以明显提高患者的生活质量，延长患者的生 存期，受到越来越多的重视。在37-39届(美国临床肿瘤协会会议)ASC0和第7届中国抗 癌协会临床肿瘤学协作专业委员会(CSC0)年会上成为最令人瞩目、最鼓舞人心的焦点。自体免疫细胞治疗是生物治疗中过继性细胞治疗的一类，是将自体的免疫活性细 胞经过体外扩增后输入患者体内，直接杀伤肿瘤细胞，调节和增强机体的免疫功能。细胞治 疗具有增殖速度快杀瘤活性高的特点，可直接杀伤患者体内残余肿瘤细胞，解除机体免疫 抑制，增强患者的免疫功能，降低复发率和转移率，延长肿瘤患者的生存期并提高其生活质 量。包括自然杀伤细胞(NK)、肿瘤浸润细胞(TIL)、细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、细胞毒 性T淋巴细胞(CTL)、树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)等。其中树突状细胞(Dendritic cells, DC)是机体功能最强的专职抗原递呈细胞 (Antigen presenting cells, APC)，它能高效地摄取、加工处理和递呈抗原，未成熟DC具 有较强的迁移能力，成熟DC能有效激活初始型T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的 中心环节。DC作为目前发现的功能最强的APC，能够诱导特异性的细胞毒性T淋巴细胞 (cytotoxic T lymphocyte, CTL)生成。基于“双信号学说”的理论基础，DC联合CIK是目 前最有效的细胞治疗的方法。即使DC-CIK是最强的细胞治疗的方法，但是由于肿瘤细胞缺乏特异性抗原、免疫 原性差，对肿瘤的杀伤性仍然很弱。目前解决这一问题的最好途径是从患者的手术标本中 提取全抗原，应用肿瘤全抗原或抗原多肽体外冲击致敏DC，回输或免疫接种于载瘤宿主，可 诱发特异性CTL的抗肿瘤免疫反应，是目前最有效的抗肿瘤免疫反应。
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令人遗憾的是肿瘤组织切除后暴露于体外环境后容易被污染，而人体的呼吸系 统、消化系统本身是开放或半开放的系统，其术后的肿瘤标本便极可能是被大肠杆菌、球菌 等污染的标本。肿瘤标本的无菌处理成为全抗原致敏DC细胞治疗肿瘤的桎梏，而现有技术 中尚未见有很好地解决办法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种有菌肿瘤组织全抗原的灭菌处 理方法，以获得既安全又有效的肿瘤抗原致敏的特异性DC细胞，保证患者的安全。本发明的目的通过以下技术方案实现。本发明的技术方案主要基于以下认识肿瘤全抗原的制备是一个复杂的过程，包 括肿瘤组织标本的收集冻存、粉碎冻融、测蛋白浓度、无菌处理及刺激DC细胞等环节，其中 来源于消化道、呼吸道等系统的有菌肿瘤标本的无菌处理是整个过程的关键环节，只有确 保肿瘤抗原的无菌才能完成致敏DC细胞无菌培养，保证患者的安全，否则培养过程中细菌 大量繁殖产生的内、外毒素会导致患者休克甚至死亡。一种有菌肿瘤组织全抗原的灭菌处理方法，包括 以下步骤1、制备肿瘤全抗原①将手术切出的肿瘤标本置于无菌缸中保存；②在无菌环境下，用含庆大霉素100 160IU/ml的无菌生理盐水冲洗肿瘤标本 2 3次；③将肿瘤标本分切成组织块后置于冻存管中，在_86°C _156°C环境下冻存、备 用；④取出肿瘤组织块，在无菌环境下反复冲洗、弃除血液，然后将组织块剪碎；⑤将剪碎的肿瘤组织置于冻存管中，按体积比1 5加生理盐水，在液氮和37°C水 浴锅中反复冻融5 6次；⑥冻融后的肿瘤组织13000g 14000g离心18 22min，取上清液即为肿瘤全抗 原，于-86°C _156°C环境下冻存；2、肿瘤全抗原灭菌处理①检测肿瘤全抗原的蛋白含量；②根据步骤①所测的肿瘤全抗原的蛋白含量，将提取的肿瘤全抗原按lOOng/ml 加入培养好的DC细胞中，同时加入万古霉素25 80ug/ml和亚胺培南西司他丁钠8ug 66ug/ml，再经过2 72小时共培养，即完成肿瘤组织全抗原的灭菌。所述的组织块规格优选0. 5mmXO. 5mm、厚度< 0. 5cm。所述的抗生素添加浓度，其中万古霉素优选25 40ug/ml ；亚胺培南西司他丁钠 优选 8ug 17ug/ml。相对于现有技术，本发明具有以下优点1、亚胺培南具有强大的抑制细胞壁合成的能力，可杀灭绝大部分革兰氏阳性、阴 性的需氧和厌氧菌，尤其是是革兰氏阴性菌。万古霉素对革兰阳性菌有效，如溶血性链球 菌、肺炎球菌、淋球菌及肠球菌等均敏感，对耐药金葡菌尤为敏感；其作用机制是抑制细菌 细胞壁的合成，它主要和细菌细胞壁结合，而使某些氨基酸不能进入细胞壁的糖肽中。本发明选择将两者组合用于肿瘤组织全抗原的灭菌，不仅抗菌杀菌能力强、抗菌谱广、几乎不耐 药外，而且过敏反应发生率极低，安全有效。2、本发明能有效抗复发，由于患者自身肿瘤组织中含有特异性的肿瘤抗原，可以 有效地刺激机体产生抗肿瘤抗体，从而达到特异的杀伤肿瘤细胞的效果。3、目前，国内外最常用的无菌处理方法有过滤法和使用抗生素法。过滤法的不足 之处在于会损失珍贵的肿瘤蛋白，而且如果操作不慎仍然有污染的危险；常规使用的抗生 素为青霉素及链霉素，这两种抗生素的局限性是均容易发生过敏反应、副作用较大，灭菌率 有效率仅为10 20%，不能应用于临床，只能用于科研实验。本发明既考虑了使用的安全 性、有效性，使用的剂量小、成本低，同时尽可能的节约患者的有限的肿瘤标本，充分利用资 源，提高患者的疗效。4、该方法操作简便、成本低廉，灭菌效果显著，具有良好地应用前景。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步地详细说明，但实施例并非是对本发明的限定。实施例1取肺部肿瘤的手术组织置于无菌缸中保存，在超菌工作台中将肿瘤标本取出放于 弯盘中，用含庆大霉素160IU/ml的无菌生理盐水冲洗2遍。将肿瘤标本剪为0. 5mmX0. 5mm、 厚度< 0. 5cm的组织块后置于冻存管中，放_156°C超低温冰箱中冻存、备用。从超低温冰 箱中取出肿瘤标本，在无菌操作下将组织块进行反复冲洗弃除血液，并将组织标本剪碎。将 剪碎的标本放于冻存管中，按体积比1 5加生理盐水，在液氮和37°C水浴锅中反复冻融 5次。将冻融后的标本14000G离心20min，取上清液(上清液即为肿瘤抗原)，于_86°C环 境下冻存。用酶标仪检测肿瘤全抗原的蛋白浓度后，将提取的肿瘤全抗原按lOOng/ml加入 培养好的DC细胞中，同时添加注射用盐酸万古霉素40ug/ml、注射用亚胺培南西司他丁钠 17ug/ml，之后经过72小时共培养，即可实现肿瘤组织全抗原的灭菌。对灭菌处理后的抗原进行细菌、真菌检测。微生物检测在微生物检测实验室和无菌试验室中进行，细菌试验室内的设备和器 具有用于细菌培养的温箱、C02培养箱、厌氧培养设备；用于观察微生物形态及标本直接 镜检的显微镜；用于物品灭菌的高压蒸气灭菌器、干烤箱；用于储存培养基、诊断用血清、 抗生素及菌种等的冰箱和冷藏柜；用于挑起标本、接种等的接种器具，包括接种环和接种 针；制备培养基时用的pint ；微生物检验操作时用于接种器具灭菌的火焰灯或酒精灯；还 有各种比用的平皿、试管、吸管等玻璃器皿，以及离心机、天平等。具体实验步骤1.配置培养基。2.高温灭菌，防止其他细菌侵入影响实验。3.肉汤培养基增菌。4. 48 72小时后转种血平板及TTC平板。5. 48小时观察有无细菌生长并报告结果。检测后发现，实施例1所得肿瘤组织全抗原标本达到无菌水平。检测结果详见表一、表_-o所获得的特异性的DC细胞，回输到患者体内后可以获得有效地肿瘤免疫，提高患 者的生活质量和延长患者的生存期。实施例2重复实施例1，有以下不同点取直肠肿瘤的手术切片组织进行全抗原灭菌处理。 肿瘤标本用含庆大霉素100IU/ml的无菌生理盐水冲洗3次。分切后的组织块后在_86°C环 境下冻存12个月，冻融6次。冻融后的肿瘤组织13000G离心22min，取上清液_86°C环境 冻存。用酶标仪检测肿瘤全抗原的蛋白浓度后，将提取的肿瘤全抗原按lOOng/ml加入培养 好的DC细胞中，，同时添加注射用盐酸万古霉素25ug/ml、注射用亚胺培南西司他丁钠8ug/ ml，之后经过2小时共培养，即可实现肿瘤组织全抗原的灭菌。对灭菌处理后的抗原进行微 生物检测，检测结果为阴性。结果详见表1，表2。实施例3重复实施例1，有以下不同点取胃肿瘤的手术组织进行全抗原灭菌处理。肿瘤标 本用含庆大霉素130IU/ml的无菌生理盐水冲洗3次。分切后的组织块后在-120°C环境下 冻存18个月。冻融5次。冻融后的肿瘤组织14000G离心18min，取上清液_86°C环境冻 存。用酶标仪检测肿瘤全抗原的蛋白浓度后，将提取的肿瘤全抗原按lOOng/ml加入培养好 的DC细胞中，同时添加注射用盐酸万古霉素80ug/ml、注射用亚胺培南西司他丁钠66ug/ ml，之后经过48小时共培养，即可实现肿瘤组织全抗原的灭菌。对灭菌处理后的抗原进行 微生物检测，检测结果为阴性。结果详见表1，表2。表一万古霉素浓度及作用时间关系
权利要求
一种有菌肿瘤组织全抗原的灭菌处理方法，包括以下步骤(1)制备肿瘤全抗原①将手术切出的肿瘤标本置于无菌缸中保存；②在无菌环境下，用含庆大霉素100～160IU/ml的无菌生理盐水冲洗肿瘤标本2～3次；③将肿瘤标本分切成组织块后置于冻存管中，在 86℃～ 156℃环境下冻存、备用；④取出肿瘤组织块，在无菌环境下反复冲洗、弃除血液，然后将组织块剪碎；⑤将剪碎的肿瘤组织置于冻存管中，按体积比1∶5加生理盐水，在液氮和37℃水浴锅中反复冻融5～6次；⑥冻融后的肿瘤组织13000g～14000g离心18～22min，取上清液即为肿瘤全抗原，于 86℃～ 156℃环境下冻存；(2)肿瘤全抗原灭菌处理①检测肿瘤全抗原的蛋白含量；②根据步骤①所测的肿瘤全抗原的蛋白含量，将提取的肿瘤全抗原按100ng/ml加入培养好的DC细胞中，同时加入万古霉素25～80ug/ml和亚胺培南西司他丁钠8ug～66ug/ml，再经过2～72小时共培养，即完成肿瘤组织全抗原的灭菌。
2.根据权利要求1所述的有菌肿瘤组织全抗原的灭菌处理方法，其特征在于所述的 组织块规格为0. 5mm XO. 5mm、厚度< 0. 5cm。
3.根据权利要求1所述的有菌肿瘤组织全抗原的灭菌处理方法，其特征在于所述的 抗生素添加浓度，其中万古霉素为25 40ug/ml ；亚胺培南西司他丁钠为8ug 17ug/ml。
全文摘要
本发明公开了一种有菌肿瘤组织全抗原的灭菌处理方法。肿瘤标本切碎后经反复冻融、离心后得到肿瘤全抗原。用酶标仪检测肿瘤全抗原的蛋白浓度后，将提取的肿瘤全抗原按100ng/ml加入培养好的DC细胞中，同时加入万古霉素25～80μg/ml和亚胺培南西司他丁钠8μg～66μg/ml，再经过2～72小时共培养，即实现肿瘤组织全抗原的灭菌。该方法既考虑了使用的安全性、有效性，使用的剂量小、成本低，同时尽可能的节约患者的有限的肿瘤标本，充分利用资源，提高患者的疗效。其操作简便、成本低廉，灭菌效果显著，具有良好地应用前景。
文档编号C12N5/0784GK101979507SQ20101028268
公开日2011年2月23日 申请日期2010年9月16日 优先权日2010年9月16日
发明者宋鑫, 杨金艳, 隋军 申请人:宋鑫;隋军