专利名称：耐热酯水解酶TClipA3及其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及耐热酯水解酶TClipA3及其编码基因和应用。
背景技术：
酯水解酶是自然界最广泛存在的水解酶之一，它们广泛的分布于动物，植物以及微生物中。此类酶主要是起分解疏水性脂肪和酯类物质作用，在生物体碳源利用，致病和细胞解毒等方面都发挥着重要的生理学机能。酯水解酶的种类繁多，氨基酸序列差别明显，但从酶分子的三级结构上看它们都具有典型的α/β水解酶折叠结构，在催化反应上都遵循丝氨酸水解酶的反应机制，既催化结构域包含丝氨酸-组氨酸-谷氨酸(或天冬氨酸)三联体活性中心结构并在丝氨酸活性位点附近存在丝氨酸水解酶的特征保守序列G-X-S-X-G。细菌来源的酯水解酶是自然界来源最为丰富，目前研究最多的水解酶群体。截止目前细菌来源的酯水解酶根据其蛋白序列的特征已经可以划分成十三个大的家族，其中包括一个真脂肪酶家族和十二个酯酶家族，随着更多的酯水解酶基因从微生物中发掘出来， 新的家族也将不断的涌现。细菌来源的酯水解酶具有较高的催化活性，立体选择性，稳定性等特点，一直以来就是生物催化工业的宠儿，被广泛的应用于食品加工、去垢剂生产、造纸业、医药和化妆品、手性化合物合成等行业。由于在工业加工过程中需要用到较高的反应温度和高有机溶剂的浓度等恶劣条件，使得常温微生物来源的酯水解酶快速失活从而制约了此类酶的应用，因此能够耐高温和耐有机溶剂等的酯水解酶在工业应用上急待发掘。嗜热微生物是一类生活在高温环境中的极端微生物，各个细胞组分都进化出在高温条件下发挥正常生理学功能的同时也能保持极高的热稳定性。嗜热微生物体内各种酶也都往往表现了较好热稳定性和有机溶剂耐受性，因此嗜热微生物为工业应用高稳定性酯水解酶资源的挖掘提供了有利条件。已经有多种来源于嗜热微生物的耐热酯水解酶已经被纯化表征，其中包括来自发光古球菌，炽热球菌，嗜热杆菌嗜酸热硫化叶菌酯水解酶。
发明内容
本发明的目的是提供耐热酯水解酶TClipA3及其编码基因和应用。本发明提供的酯酶TClipA3，来自腾冲嗜热杆菌(Thermoanaerobactertengconge nsis)MB4，是如下(a)或(b)(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有酯水解酶活性的由序列1衍生的蛋白质。序列1所示的蛋白由414个氨基酸残基组成。为了使(a)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。表1 标签的序列
权利要求
1.一种蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有酯水解酶活性的由序列1衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)或3)的DNA分子1)序列表中序列2所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码具有酯水解酶活性的蛋白的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码具有酯水解酶活性的蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为将权利要求2或3所述基因插入pET28a质粒的多克隆位点得到的重组质粒。
6.如权利要求4所述的重组菌，其特征在于所述重组菌是将权利要求5所述重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)得到的。
7.一种制备酯水解酶的方法，是培养权利要求4或6所述的重组菌，得到酯水解酶。
8.扩增权利要求2或3所述基因的全长或其任意片段的引物对。
9.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述基因、权利要求4、5或6所述重组表达载体、所述表达盒、所述转基因细胞系或所述重组菌中的任意一种在降解酯类中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于应用权利要求1所述蛋白降解所述脂类时，温度为60-90°C，pH为8. 5-11 ；所述脂类为如下任意一种对硝基苯酚乙酸酯、对硝基苯酚丁酸酯、对硝基苯酚己酸酯、对硝基苯酚辛酸酯、对硝基苯酚癸酸酯、对硝基苯酚月桂酸酯、三乙酸甘油酯、三丁酸甘油酯、三己酸甘油酯或三辛酸甘油酯。
全文摘要
本发明公开了一种耐热酯水解酶TClipA3及其编码基因和应用。本发明提供的蛋白质，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有酯水解酶活性的由序列1衍生的蛋白质。所述蛋白的编码基因、以及含有所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。所述蛋白、所述基因、所述重组表达载体、所述表达盒、转基因细胞系或重组菌均可应用于降解脂类。本发明的蛋白可应用于食品加工、洗涤剂，医药化妆品、化合物制备等行业。
文档编号C12N5/10GK102399761SQ20101028243
公开日2012年4月4日 申请日期2010年9月14日 优先权日2010年9月14日
发明者薛艳芬, 饶朗, 马延和 申请人:中国科学院微生物研究所