一种编码具有高水解活性的猪肝羧酸酯酶亚型基因的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物基因工程领域，具体设及一种编码具有高水解活性的猪肝簇酸醋 酶亚型基因及应用。
【背景技术】
[0002] 猪肝簇酸醋酶（piglivercarbo巧lesterase,PLE)又称为猪肝醋酶，是存在于猪 肝中的一种丝氨酸水解酶，是一个由多种同工酶组成的酶家族，与其它动物种类的簇酸醋 酶相比，PLE家族显得尤其复杂，从猪体内直接提取的PLE是多种同工酶的混合物，且不同 批次的提取物活性差异较大。到目前为止，文献报道的PLE有7种亚型，分别为PLE1，PLE2， PLE3,PLE4,PLE5,PLE6W及APLE。单一组分的PLE在催化水解对映体化合物时具有高度 的立体选择性，在反应中能选择性地水解对映异构体中的某一种，获得单一纯度的对映体 产物，在单一对映体功能化合物和药物中间体工业生产中起到重要的作用，从而成为有机 化学合成领域水解酶的主角。同时PLE也可W水解多种含有醋键、硫醋键和酷胺键的内、外 源性物质，PLE可能通过其强大的水解作用控制药物的疗效及毒副作用，其催化水解活性的 数据成为猪临床合理用药的理论依据。
[0003] 由于猪体内提取的天然PLE是多种同工酶的混合物，而不同的同工酶对底物的专 一性和立体选择性存在差异，使得提取物的应用受到很大的限制。因此，采用基因工程手段 表达单一组分高活性的PLE是行之有效的方案。
[0004] 通过克隆表达获得催化水解活性强的单一组分的PLE同工酶，将大大降低生产成 本，对有机化学合成工业和制药业具有巨大的实用价值。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术缺陷，寻找一种对通用底物对硝基苯基乙酸醋 (P-NPA)的水解活性比所有已经报道的PLE亚型都明显高的新亚型基因。
[0006] 本发明的另一目的是提供一种新的编码高水解活性PLE蛋白的核巧酸序列，并对 其进行原核功能性表达，制备单一组分高纯度的酶。
[0007] 本发明通过克隆技术在猪体内分离得到一种高水解活性的猪肝簇酸醋酶亚型基 因，其核巧酸序列是SEQIDN0:1中第l-17(Ubp所示的序列。
[0008] 申请人同时得到该分离的高水解活性的猪肝簇酸醋酶蛋白，该蛋白编码的蛋白质 序列如沈QIDNO:2所示。
[0009] 实现本发明目的的具体技术方案如下：
[0010] 1、新亚型基因的获得
[0011] 从猪肝组织中提取总RNA，通过反转录合成cDNA，由于PLE各亚型0RF的5'和3' 末端高度保守，因而根据PLElcDNA的5'和3'端序列设计PLE0RF的通用PCR引物如下：
[0012] PLE-up: 5'-ATGTGGCTTCTCCCGCTGGTCCTGA-3'
[0013]PLE-down:5'-CCTCAAGGTCAGCCGAGCCTCCCCT-3'
[0014]WcDNA为模板，用上述引物进行PCR扩增，扩增产物回收后连接到pMDlST载体 (购自宝生物工程大连有限公司），用所得的连接产物转化D册α感受态细胞（购自北京全 式金生物技术有限公司），通过菌液PCR进行阳性克隆筛选，将阳性克隆送样测序。
[0015] 对测序数据结果进行分析，在大量的克隆测序基础上，除了克隆得到已见报道的7 种PLE亚型基因片段外，还克隆到大量的新亚型基因片段。
[0016] 2、PLE蛋白的表达及纯化过程如下：
[0017] (1)用于原核表达的PLE目的基因的制备：
[0018] 用于原核表达PCR扩增引物由武汉擎科创新生物公司合成，引物对的具体序列如 下：
[0019]上游引物：5 ' -GGAATTCCATATGGGGCAGCCAGCCTCGCC-3'
[0020] 下游引物：5 '-CCGCTCGAG巧:述CTTTATCTTGGGTGGCT-3 '
[0021] 上游引物5 '端加上了保护性碱基（GGAATTC)和Ndel酶切位点（如下划线所示的 序列），下游引物5 '端加上了保护性碱基（CCG)、化〇1酶切位点（如下划线所示的序列） 和终止密码子（如斜体所示的序列）。
[0022] 去除PLE亚型的起始密码子（ATG)和信号肤序列灯GGCTTCTCCCGCTGGTCCTGACCTC CCTCGCCTCTTCTGCAACTTGGGCA)W及内质网滞留信号（CATGCTGAGCTG)。
[0023] 用上述插入PLE基因的PMD18-T为模板，使用上述引物对扩增PLE的0RF，PCR产 物经琼脂糖凝胶电泳鉴定大小正确后，将目标片段切下，用凝胶回收试剂盒（购自北京全 式金生物技术有限公司）回收。
[0024] (2)原核表达载体（质粒）pETl加-PLE的构建：
[0025] 将上述获得的PLE基因片段和表达载体祀T1化（购自MerckMillipore公司，质 粒图谱见图6)分别进行双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，将目标片段切下，用凝 胶回收试剂盒回收，16°C条件下连接。用连接产物转化D册a感受态细胞，经双酶切和测序 鉴定正确后，申请人将所得的原核表达载体命名为表达质粒祀T巧b-PLE(图谱见图7)。
[0026] (3)PLE功能性表达及纯化：
[0027] 首先将分子伴侣质粒pGro7(购自宝生物工程大连有限公司）转化 0rigami?2 (DE3)感受态细胞（购自MerckMillipore公司），在LB(ΟιΓ)琼脂平板 上筛选出阳性菌落，经酶切鉴定正确后命名为化igami-pGro7,然后扩大培养用来制备 Origami-pGro?感受态细胞。取上述表达质粒祀Tlf5b-PLE转化Origami-pGro?感受态细 胞，将转化产物涂布LB(Amp+和化1+)琼脂平板。37°C培养1化后挑取平板上的单个菌落进 行培养，化后用菌液PCR进行鉴定。将所得的阳性克隆命名为化igarni-pGro7-pET1加-PLE。 [002引将阳性菌接种于LB(Amp+和化1+)培养基中，首先加入k阿拉伯糖化-Ar油inose) 至终浓度为Img·血1，30°C摇床20化/min条件下培养2-化，诱导分子伴侣pGro7表达，当 浓度达到ODe。。值为0. 6-0. 8时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖巧（IPTG)至终浓度为40uM 诱导目的基因PLE的表达，同样条件下振荡培养6小时后离屯、收集菌体，进行破碎处理，高 速离屯、后取上清用0. 45um滤膜进行过滤，用带有化S标签的儀离子亲和层析柱对上清液过 柱纯化，所得到的纯化蛋白进行SDS-PAGE电泳分析鉴定，正确后超滤浓缩，置-80°C保存备 用。
[0029] (4)PLE蛋白酶催化水解活性的鉴定：
[0030] 具有催化水解活性的PLE能够把通用底物p-NPA(181mgP-NPA，置于10血栋 色容量瓶中，采用乙腊溶解后定容为标准胆备液）水解为P-NP，溶液颜色由原来的无 色的P-NPA变为黄色的P-NP。用P-NPA检测PLE蛋白酶活性试验的结果显示，表达菌 化igami-pGro7-pETl加-PLE破碎分离获得的上清具有水解活性，可水解P-NPA产生P-NP， 使溶液颜色由无色变为黄色。
[0031] W P-NPA为底物，使用安捷伦8453型紫外-可见分光光度仪，对纯化的PLE蛋白 进行酶活力检测，发现一种新出现的亚型PLE-F4基因片段对通用底物P-NPA显示出很高的 催化水解活性。
[0032] 本发明的积极效果如下：
[0033] (1)对通用底物P-NPA显示出很高的酶活力。
[0034] (2)在单一对映体功能化合物生产中和药物中间体工业生产中起到重要的作用。
[0035] (3)在药物代谢中起到重要作用。
[0036] 更详细的技术方案见《具体实施方案》的内容。
【附图说明】
[0037]序列表SEQIDNO:1是猪肝簇酸醋酶PLE-F4亚型基因的核巧酸序列（1-170化口）， 序列全长为17(Ubp，其中第l-17(Ubp也是该基因的编码区（CD巧，显示对应的氨基酸序 列。
[003引序列表SEQIDNO:2是猪肝簇酸醋酶PLE-F4亚型基因编码的蛋白质序列。
[0039] 图1 :为原核表达PLE0RF的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测图。
[0040] 附图标记说明：泳道Μ为：DL2000marker;泳道1为：原核表达PLE0RF(1635)PCR 扩增片段。
[0041] 图2:为原核表达载体祀T巧b-PLE双酶切产物琼脂糖凝胶电泳检测图。
[0042] 附图标记说明：泳道Ml为：DL2000marker;泳道M2为：DL15000marker;泳道3为： NdeI和化0I酶切祀T巧b-PLE产物。
[0043] 图3:为PLE原核表达产物SDS-PAGE电泳鉴定图。
[0044] 附图标记说明：泳道Μ为：蛋白Marker;泳道1为：0;rigamiWT;泳道2 为：0rigami-pGro7-pET15b;泳道 3 为：0rigami-pGro7-pETl加-PLE;泳道 4 为： His-tag-purifiedOrigami-pGroT-pETlSb-PLE; 泳道 5 为：His-tag-purified Origami-pGroTo
[0045] 图4:为PLE原核表达产物的纯化结果SDS-PAGE电泳鉴定图。
[0046] 附图标记说明：泳道Μ为：蛋白Marker;泳道1为：200-222mM咪挫洗脱蛋白样品；
[0047] 泳道2为：223-245mM咪挫洗脱蛋白样品；泳道3为：246-267mM咪挫洗脱蛋白样 品；
[0048] 泳道4为：268-290mM咪挫洗脱蛋白样品；泳道5为：290-312. 5mM咪挫洗脱蛋白 样品；
[0049] 泳道6为：312. 5-335mM咪挫洗脱蛋白样品。
[0050] 图5:为原核表达PLE蛋白水解P-NPA的活性检测图。
[005d附图标记说明：1-为：0;rigamiWT;2-为：0;rigami-pG;ro7 ;3-为： 0;rigami-pG;ro7-pET15b-PLE;4-为：0;rigami-pG;ro7-pET15b;5-为：PBS巧OmM，pH