用于山茱萸品种鉴定的dna片段及其制备方法

专利名称：：用于山茱萸品种鉴定的dna片段及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及物质，特别是一种用于山茱萸品种鉴定的DNA片段及其制备方法。二
背景技术：
：中药山茱萸，又名山萸肉、萸肉、药枣、枣皮等，是山茱萸科植物山茱萸Cowwo^7c/"flfoSieb.etZucc，除去果核的干燥成熟果肉，为常用中药材，具有补益肝肾，涩精固脱的功效，主治眩晕耳鸣，腰膝酸痛，阳痿遗精，遗尿尿频，崩漏带下，大汗虚脱，内热消渴等症。山茱萸主产于我国的河南、浙江、陕西等省，四川、安徽、山东亦有栽培，但山茱萸在长期应用和栽培的过程中，种内产生很大变异，出现较多栽培品种，主要表现在这些品种的果实从形状、大小、颜色、重量到产量、干果肉(药材)得率，以及熊果酸、水溶性浸出物、脂溶性浸出物的含量等具有较大的差异，即它们的经济价值和药材质量是明显不同的，由于其药用和商业价值，为确保真品，对其进行鉴定是必要的。目前，应用较为广泛的遗传标记有形态标记(morphologicalmarkers)，细胞t示i己(cytologicalmarkers)、生f七禾示i己(biochemicalmarkers)禾口分子标记(molecularmarkers)。形态标记指植物的外部特征，细胞标记主要是染色体的核型和带型，生化标记主要包括同功酶和贮藏蛋白。这3种标记都是基因表达的结果，是对基因的间接反映，标记数目有限，多态性较差，易受环境条件的影响。而DNA分子标记是直接在DNA分子上检测生物间的差异，是DNA水平遗传变异的直接反映，DNA分子标记能对各个发育时期的个体、各个组织器官甚至细胞作检测，不受环境与基因表达与否的限制，数量极多，遍及整个基因组，多态性高，遗传稳定。所以，DNA分子标记从它诞生之日起，就引起了生物科学家极大的兴趣。在短暂的几十年中，经历了迅猛的发展，分子标记日趋成熟。目前，DNA分子标记技术已广泛用于生物多样性的分析、种质资源的分类演化、遗传图谱的构建、基因的分离测序、作物品种及纯度的鉴定、杂交育种等许多方面，并显示了独到的优势，那么能否利用基因DNA对山茱萸进行真假鉴定呢？三
发明内容针对上述情况，本发明之目的就是提供一种用于山茱萸品种鉴定的DNA片段及其制备方法，可有效解决山茱萸种质资源分析、药材鉴别、杂交育种，防止山茱萸假品出现的问题，其解决的技术方案是，根据分子生物学研究发现，生物类药材所依赖的资源-"物种"的多样性是由于其基因多态性的结果，而基因多态性最直接，最好是在DNA分子水平上进行检测，据此，本发明用于山茱萸品种鉴定的DNA片段为10条(5对)DNA片段，它们是-P1/P2:5'CTTGTCTGTGGATGGT3'/5'GTGTGGAmTAITGG3';P3/P4:5'TAGCCCGAGGTGTTCT3'/5'TCTTGTrCCCGTTGTr3';P5/P6:5'TCGGTGTGTTGAGTATTGGC3'/5'TCGTTGilTl'lWGCTGGT3';P7/P8:5'TGTGGCAGGGACTTCA3'/5'GCATCAGCAAAAACGG3';P9/P10:5'CGACAAGTGGTGGTTGAGACG3'/5'CACGCACGACAGGACGCT3'，其制备方法是取山茱萸植物叶片研碎成细粉，将细粉置于提取缓冲液中，离心，弃去上清液，再加入用Vc+2xCTAB制成的抽提液以及e-巯基乙醇，混匀，加入由等体积的饱和酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)制成的溶液处理2次，除去杂质，离心，取上清液，加入异丙醇，沉淀，收集沉淀物，抽干乙醇，得DNA物质，再利用DNA物质制备RAPD片段，并对其进行克隆，对克隆后RAPD片段的DNA序列进行测定，根据测定的DNA序列设计出了5对(IO条)DNA片段，本发明可用于中药山茱萸品种的鉴定及与其混伪品的鉴别，并可有效用于中药山茱萸的品种改良及新品种选育，利用设计的5对(IO条)DNA片段可分别对山茱萸幼苗进行鉴定，可以大大縮短山茱萸品种改良及新品种选育的周期，节省成本。四具体实施例方式以下结合实际情况对本发明的具体实施方式作详细说明，由上述技术方案给出，本发明的DNA片段是由10条(5对)序列构成的物质，具体是:Pl/P2:5'CTTGTCTGTGGArGGT3'/5'GTGTGGATnTATTGG3';P3/P4:5'TAGCCCGAGGTGTTCT3'/5'TCTTGTrCCCGTrGTT3';P5/P6:5'TCGGTGTGTTGAGTAITGGC3'/5'TCGTTGTTmTATGCTGGT3';P7/P8:5'TGTGGCAGGGACTTCA3'/5'GCATCAGCAAAAACGG3';P9/P10:5'CGACAAGTGGTGGTTGAGACG3'/5'CACGCACGACAGGACGCT3'。其生产方法是由以下步骤实现的-(一)、DNA提取方法(1)取山茱萸植物叶片0.2g放入研钵，加入叶片重量的10%PVP粉末，在液氮中研磨成细粉；(2)将细粉装到1.5ml离心管，加入冷藏的提取缓冲液1200^(该缓冲液为25mMTris-HCl，pH=8.00)，冰上放置10min，8000r/min离心5min，弃去上清液，加入用Vc+2xCTAB制成的抽提液600pl(该抽提液为0.25gVc/mlCTAB，pH=6.06.5;2xCTAB的组成2%CTAB，100mMTris-HCl，20mMEDTA,1.4MNaCl，pH=8.0)，再加入50plP-巯基乙醇，混匀后成混合液，65°C，保温4h，其间不时摇动；G)将上述装有混合液的离心管取出，4°C，12000r/min，离心15min;取上层溶液，加入等体积的饱和酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)混匀，4°C，12000r/min离心10min，取上层溶液，然后加入等体积的氯仿-异戊醇混合制成的液体，其氯仿异戊醇=24:1，在4。C，12000r/min离心10min，重复抽提2次，去其杂质成抽提液；(4)将上述抽提液，加入0.61.0倍体积的异丙醇，放置10到30min，生成含有沉淀物的溶液(可放在-2(TC冰箱30min12h，冷冻条件有利于沉淀物的生成)；(5)将上述含有沉淀物的溶液，于4°C，12000r/min离心15min;收集沉淀物，加入300|1175%乙醇洗涤沉淀，12000r/min离心5min，弃上清液，弃上清液后的沉淀物，再加入300(il75%乙醇洗涤沉淀，12000r/min离心5min，重复洗涤1次，得到沉淀物；(6)将装有沉淀物的试管置于真空干燥器中510min，抽干乙醇(不能太干燥，否则DNA不易水溶)；用50pl去离子水溶解DNA沉淀物，-20"C冰箱保存备用。(二)、RAPD片段的制备用上^XS系列的弓物对山^IC^其ifet咅品种进行RAPD分析。反应体系为10Xbuffer2.5ul，dMP(2.5mmol/L)3.0p1，Mg2+(25mmol/L)3.0ul，引物(该引物为S37或S43或S92，j被为2励l/L)2.5ul，模板DNA3.0yl(模板DNA为上述(6)步骤中的DNA沉淀物制成)，Taq酶(5U/Pl)1.0ul，去离子水10.0iU补足25yl。扩增^Z循环^fC为94。C予跤性8min，变性94。C，1min;退火38°C，1min;延伸72。C，1.5min，如此反复35个循环，72。C體10min，得，。94°C降驢U38"的时间以^/人38-C升繊lj72。C的时间^S^为'Kil升降温。对±^行1.2%琼月離繊电泳，0.5ug/ml溴化乙锭溶&在紫外^:丁下樹则。其中在S37、S43、S92扩增的图谱中分别各有1条特征带ST37、ST43、ST92。用消毒刀片切下目的DNA条带，用UNIQ"10柱式DNA胶回收i凝lJ盒(SK1132，上^X公司),目标M，得到RAPD片段ST37、ST43、ST92。(三)、对RAPD片段进行克隆，方法是1、驗用上^I公司的PCR/^tJ克lti錄lJ盒将RAPD片段ST37、ST43、ST92分另lJ雜到pUCnrT质举4^体中(戶刑兑的PCR/^克斷叙lJ餘市售产品，由上WlX生产，编号SK2214)，1623。C连接1小时S1夜(g卩12-14小时)得3i^产物，通常雜1小时即可超ihi!S:研究的要求。保存-20°0#|备用。2、帝恪感免态细胞方線1)将￡^i杆m^株以线鄉式凃械LBJt^S^肚，37。Ci^^过繊f^g的克隆。2)挑单克輕2mlSOBJ3g^基中，37°C，160r/min，摇菌过夜(12-14小时)成歸基的菌液。3)在250ml瓶中装50mlS0BJ^^基，随后将过夜i歸的菌液接种于i^^基中，其接种比例每100gif^基中接i錄的菌液lml(100:1)，37°C摇菌至Aaonm约0.35，在冰JJ爐10餘4)将菌^t移到5ml的离L、管中，3500rpm离心10-15^H中后，弃上清液，让沉淀物尽可能真空千燥，加4mlSolutionB(高效制备感受态细胞i叙U盒中的。C保存。其中i^^fi兑的LBi^^ffl^板是由LB(Luria-Bertani)ig^基制成，LBi歸基为配制每升Ji^基，驗950ml去离子水中力口入月對七蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCllOg，摇动容器:tM溶质溶解，用5mol/LNaOH(约0.2ml)调pH〈輊7.0，用去离子水定容至1L，在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸n^菌20min，将液体i^^基倒A^^皿中放凉，凝固形成平板状；附兑的SOBig^基为配伟晦升i^^基，在950ml去离子水中力口入，腐七蛋白胨20g，酵母提取物5g，NaClO.5g,摇动容器使溶质魅溶解，力口編250mmo1/LKC1溶液(将1.86gKC1用100ml去离子水溶解即酉诚250ramol/LKC1溶衝用5mol/LNaOH调pH值至7.0，用去离子7jC定容至1L。在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸^^菌20min，该溶鹏4顿前，力口入5ml灭菌的2mol/LMgCl2[2mol/LMga溶液的配制方法如下:用90ml去离子水溶解19gMgCL，用去离子水调辦积为100ml，在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸顿菌20min];臓的SOC線基为SOC歸基除含有20ramo1/L鰣糖外，期tM分与SOB土^#對目同，S0Bi^^基经高压灭菌后冷至60。C或60。C以下，力口20ml除菌的lmol/L葡萄糖溶液(lmo1/1葡萄糖溶液的配制方法是用90ml去离子水溶解18g■糖，完全溶解后，用去离子水定容至100ml，用0.22um滤器过滤除菌)；戶/H兑的X~€al的储存M:将X"Gal溶于二甲基甲醐安中，酉诚20mg/ml、鹏的溶液，装于^^瓶中^^丙烯管中，装溶液的管应以锡箔爐以防止见光使X"Gal穀鹏，-20。C保存，该溶液不必过滤除衝所说的IPTG溶液的配法将2g的IPTG溶于8ml水中，用7jC调节^^只到10ml，用0.22um的一次性滤^i滤除菌，^^ilmM喻，-2(TC保存。3、对J^i魏细鹏行转化1)200p1感受态细胞，置于冰上，完^冻后轻轻将细胞均匀悬浮。力口入10y1雜，，轻轻混匀。冰±30併中。2)42。C;K^m60秒，冰J^嬗2^H中。加400ulS0Ci^^基，37°C，200250r/min振荡i^1小时。3)室温下4000rpm离心5力H中，用枪头卩鹏400y1上清夜，用乘除的:t歸割鄉胞悬浮。4)将细菌涂^S!5feffl20ullOOmmol/LIPTC和100u120mg/mlX-gal涂布的含有氨精霉素的LB職舒社。5)平板在37。C下正向方爐1小时以吸鹏多的液体，然后倒影§#^夜。6)选^SIPTG/X-gal平fei^长的白色，，用3^侄^M^t霉素的LB液体:feg^基，37。Ci^:夜，得到含有目的DNA片^M粒载体的菌液。(四)、RAPD片段的DNA序列测定t鹏实验要求我们,了直^S行测序法,将含有目的DNA片^M粒载体的茅賴羊菌液M送出观U序，测^^司为上^E公司。ST37錄589bp，ST43錄825bp，ST92錄837bp。ST37的全序列一589bp1CTTGTCTMGGJITGGTGCTCGGUCCGTAiTACGACTCACTAU&GKGACAUTGATCGAT以TATCCCATGWC(JMC81GCCT隨CCKTTGTCT&丽隠KM脂&ACTTT脇GTTTT簡CA161MGCTTCAM丽画GCJL画JITTTTCC顧CACTAA纖GCCGTGTTCT丽CT服腿d241TTKTTTT&AGMATTCAAT以CCACMCATGGTCGTTTGTCTTACACACMTAGCTTCGATCCACTTAGATAC&TMTC321薩隨腿T麵MTTA,A固鹏画TCCTA麵,GCCCC蔵ATTG画TT401薩A冊MTTC,GGT讀tt讓画GG應HTC腿A&TTM匿&GGAA函CTTA481CMT腿CTTK丽n廳T鹏K謹MA廳C皿C鹿TTTTT薩丽CT腿謹SS1薦薦CT画G磁TTTT皿G;ST43的全序列一825bp1TAACCC隠GTT匿TTCCCGTM懇AC認簡TATCCCATO81G眼謀GTCTGGT匿TTGATTCCTTC匿MGTCACCT&CTGGCAT&ATGTCTT丄S1TGATGTTT(JTCGTTGUTTGC露腹CTTGTTATCCCCTGACTCCTCTAMCM隠n觸謡241T歸GCTGGGCCTGC潔匿UMCTT願TT皿GCT(JTGTTGTUTCGCTGCCCTCTT職C321C园T證TC跳認服GCCKCC證G羅GG認服匿TGGCTCTTCCTCCKTTCCTTA401C認T薦TGC脇CTTCGTTCT認CG謂匿TUG應ATG匿AMGTTATT薦AC481A謂C層MTMCGCMG威MCTTAT匿AGATCGTCAT雄ACCCCA隠GCGTCKTGCSS1TGCTTTTATTCCA薦CTCACCAGC腿TCCTAAACCACG認GCCCC匿CTGGCS41TCTT腦TG羅TTCTCTGTTTCTCCTG:TAGM雷TCCG認GTGTTCT隱CTCTATC應A721M匿TCTCCTTCT而CCCTTCA謀TT簡窗TT蔵CTCT301GAC薦CTGCCTTTT隱TTGTT;ST92的全序列一837bp1QMAMCGGC扁腿TTCAAGCTCWT腦T纖CCACTA,GC隱TAT匿GATG丽隠T81&,&認CT腦腿曙TCAGCTC舰C腦C&證WOTT,薦ATC曙T(JGTC腦GGGG1S1C腹C腿隐CT匿TC脇認AGTGGTG加,GGCTAG鹏TT腦C認A隠G隱隱C241CGGGACGCAGGCAGATTTCAGACCTCCTCTTCCTTCTCAGACAGAGGCTTATGCTCAGAGATTCCAGTCTGGtJMGGGTG321獄薦ACT認G認CAG認GTCC陽GGGTTC認AGA匿隱GCGC簡CC謀T懇G401CTGTTCTTGC腦CTTGCG(JMG認AGAGGCT磁C謀CCTTCA鐘雄GGGT纖TTGCCTTTGTCACC481GTHTOCTG皿G匿TTGCATT證證CC匿C皿腦C匿G而T隐CAGCTTTG脇T&CTSS1G腿T歸AT曙匿CCCCCTCTTGTG腿TTCCT脇GCGTGCA認吸C懇C腿GG皿隠TS"ACTGTGGMA謀CATTCT隨T腿(JCTGATA認廳(!叫&薩G舰GKG腐CTG丽函TT721TCGTG認A窗TTGGCC廳T露GGCTCTCTTGAT認TCTGGGTG跳GTCAG認腿AC腿観801T認舰TGTTTGT,腿CACCCCG歸TC。(五)、能够用于山茱萸品种鉴定DNA片段的设计根据RAPD片段ST37、ST43、ST92的DNA序列，设计10条(5对)DNA片段，可用于山茱萸品种鉴定。本发明(1)、可用于中药山茱萸品种的鉴定及与其混伪品的鉴别，可根据设计的5对(10条)DNA片段，选用适当的分子鉴定技术，并摸索出有效的方法，进行中药材的真伪鉴定甚至品质上的评价。目前植物总DNA的提取方法已比较完善，可从长期贮存的标本中进行提取、扩增与测序，使中药材的分子鉴别在方法学上得到保证。山茱萸药材的混伪品有山茱萸科植物川鄂山茱萸Coe/7"c^'/7e/7s^Wanger.的干燥成熟果肉、鼠李科植物酸枣Ziz7P力ws力j'i/6eMill.、滇朿lj麥Z2Xfp力〃5"Lam.的干燥成熟果皮、小檗科植物小檗^e2^e/^aM/re/7S"Rupr.的干燥成熟果实、葡萄科植物葡萄W/LZ'/eraL.的干燥成熟果皮、蔷薇科植物山荆子船^s6accata(L.)Barkh.的干燥成熟果实、蔷薇科植物山里红Crs"e^/s/^./朋tj'/!z.a^Bge.7ar,鹏乂。rN.E.Br.、山楂Cratge卵51/w./朋d/!z'c/aBge.、野山楂Crstee^Ac朋eaz^Sieb.etZucc.的干燥成熟果皮。(2)可用于中药山茱萸的品种改良及新品种选育，山茱萸栽培品种的划分主要指标是果实的形状和果形指数(果实直径/果实长度)，但是山茱萸是木本植物，从幼苗到开始挂果需要6-8年的时间，故以果实的性状对山茱萸的品种进行鉴别、筛选与纯化是非常困难的。而利用设计的5对(10条)DNA片段可对山茱萸幼苗进行鉴定，可以大大縮短山茱萸品种改良及新品种选育的周期，节省成本。用现有DNA技术，对市场山茱萸产品170例进行测定，准确率为99.89%，效果非常之好，是未曾预料到的，而且方法简单，节省成本，是药品鉴定，品种培育、改良上的一大创造，经济和社会效益巨大。序列表<110>河南中医学院<120>用于山茱萸品种鉴定的DNA片段及其制备方法<130>用于山茱萸品种鉴定的DNA片段及其制备方法<140〉200810049408.2<141>2008-03-25<腸3<170>Patentlnversion3.2<210>1〈211〉589<212>DNA<213>山茱萸禾斗的山茱萸(CornusofficinalisSieb.etZucc)<400>1cttgtctgtggatggtgctcggtaccgtaatacgactcact￡lt^gggCg￡lcatatgatcg60atgatatcccstgggcggccgcctgcagaccaggtctgaccgcttgtctgtggatggt肌120gca鄉gtgactttatgggtcacaccgtactttttcatcaaagcttcaaatgatctattg180cagaaatattttcctccatcgcccgaggtgttctaaatctaggtaagaca240ttggttttgag3CC8C幼CEltggtcgtttgtcttacacacaatagcttcg300atccacttagatacgtaatctacagcgacaagaatatacaaattaccg犯卿gttgggg360aaaggtcctatgaaatcaatgCCCC￡l8￡LC￡lttg卿attttgatgetttagaattcgatta420ggtggcatcatatttcatttggaaatgtttcataatagttaacaacgggaacaagactta480caataaagcttggtatccttaaatatggggatccetcactgc犯犯ttttt540gcagcaattctatgatcactaaagtggcctctsigtgtggattttattgg589<210>2<211>825<212>DNA〈213〉山茱萸科的山茱萸(CornusofficinalisSieb.etZucc)<400>2taacccggcagttgtaattcgagctcggt3ccgtaatacgactcactatagggcgacata60tgatcgatgatatcccatgggcggccgcctgcagacc3ggtctggtgatcUgattcctt120cctgcaagtcacctgctggcatgatgtcttgttgcagtgatgatgtttgtcgttggttgc180tgtgagatcttgttatcccctgactcctctaaacatcgtaccaggaagcattaagtggtg240tgggggctgggcctgcttacg肌tg肌cttaactttatttgctgtgttgttatcgctgcc300ctctttgcactcagaaaagccgtgttggcatctgtattgaU卿ccgccccgacacgag360aatcggtgtgttgagt3ttggctcttcctccgcttccttactcgcttacctgctgcgctt420cgttctgctgctgcgeigcagcgtcatcatcttag犯agatgcagt幼tgttattatccac480aataacgcaagaaacaactt3tgeigc鄉tcgtC3t3鄉3CCCC3gCC3540ccgaaacgaggcgtcgctgctgcttttattccatagcctccgccccgctg3CC3gCElt犯600tcctaaaccacgtggcgcccccaccctggctcttactatgatgcttctct660gtttctcctgtag幼tagctccgtcgtgtgttctgaagctacgacgctgactatca肌ga720aatacctctccttctttctcccttcsggaggcgcggttctttttcatactgactgtggat780ttaaacctctgcatctgcaggacacccctgccttttgggcUgtt825〈210〉3<211>837<212>腿〈213〉山茱萸科的山茱萸(CornusofficinalisSieb.etZucc)〈400〉3caaaaaacggcaagttgaattcaagctcggtaccgtaatacgactcactatagggcgaca60tatgatcgatgatatccc3tgggcggccgcctgcagaccaggtctcagctcacgacagag120cggggag織ttg柳tgccatcggtgtggtcagccggggC3CEttC￡L￡L￡l￡lggaactgtcc180tcatggtggcagtggtgcaggagtggctaggggttttcagcacggacccaggccagccac240cgggacgcaggcagatttcagacctcctcttccttctcagacagaggcttatgctc8gag300attccagtctgggaagggtgtggcagggacttcaggtcagc卿cgggtcccaggggggg360ggttcccggagagatccgccgcgcacatccgcgcttacagctgttcttgctgcgcttgcg420g￡iagaggg￡igaggcttccaccgacccttcaatggitcgggggtaggattgcctttgtcacc480gtttttgctgatgcggtagttgC3ttggg3gccaccgtgccatacattgcgaacgatttt540ggaacagctttgacggtgctgattatgccgatcgatgtgcccccctcttgtgagcattcc600t3tgggCgtgC3tgtgggCCtggscagaaggatgccacatactgtggaaatgaccattct660catstgc肌gctgstatgtgattacgtggggEltCg3C肪ggcgagtcctgatatggaatt720tcgtgscgcattggttggccgctctcttgattcgatctgggtgaagggtc780agtaag幼gaacaagat￡Lgatacggaaaatgtttgtgggggg3C￡ltC83权利要求1、一种用于山茱萸品种鉴定的DNA片段，其特征在于，该片段为10条5对DNA片段，它们是P1/P25′CTTGTCTGTGGATGGT3′/5′GTGTGGATTTTATTGG3′；P3/P45′TAGCCCGAGGTGTTCT3′/5′TCTTGTTCCCGTTGTT3′；P5/P65′TCGGTGTGTTGAGTATTGGC3′/5′TCGTTGTTTTTTATGCTGGT3′；P7/P85′TGTGGCAGGGACTTCA3′/5′GCATCAGCAAAAACGG3′；P9/P105′CGACAAGTGGTGGTTGAGACG3′/5′CACGCACGACAGGACGCT3′。2、权禾腰求1所^J用于山茱萸品种鉴定的DNA片段的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现A、提取DNA，方法是(1)将山茱萸植物叶片0.2g放入研钵，加入叶片重量的10%PVP粉末，在液氮中研磨成细粉；(2)将细粉装到1.5ml离心管，加入冷藏的提取缓冲液1200ixl，冰上放置10min，8000r/min离心5min，弃去上清液，加入用Vc+2xCTAB制成的抽提液600W，再加入50ialP-巯基乙醇，混匀后成混合液，65°C，保温4h，其间不时摇动；(3)将上述装有混合液的离心管取出，4°C，12000r/min，离心15min;取上层溶液，加入等体积的由饱和酚、氯仿和异戊醇组成的液体混匀，4'C，12000r/min离心10min，取上层溶液，然后加入等体积的由氯仿、异戊醇混合制成的液体，其氯仿异戊醇=24:1，在4。C，12000r/min离心10min，重复抽提2次，去其杂质成抽提液，所说的饱和酚氯仿异戊醇=25:24:1;(4)将上述抽提液，加入0.61.0倍体积的异丙醇，放置10到30min，生成含有沉淀物的溶液；(5)将上述含有沉淀物的溶液，于4°C，12000r/min离心15min;收集沉淀物，加入300pl75。/。乙醇洗涤沉淀，12000r/min离心5min，弃上清液，再加入300^175%乙醇洗涤沉淀，12000r/min离心5min，重复洗涤l次，得到沉淀物；(6)将装有沉淀物的离心管置于真空干燥器中510min，抽干乙醇；用50|il去离子水溶解DNA沉淀物，-20C冰箱保存备用；B、制备RAPD片段，方法是将上述用去离子水溶解的DNA沉淀物，置于反应体系中进行反应，方法是用10Xbuffer2.5ul，dNTP3.0"1，Mg2+3.0ul，引物2.5ul，DNA沉淀物3.0ul，Taq酶1.0ul，去离子7jC10,0u1补足25u1j^g^体系，94。C予疲性8min，变性94。C，1min;退火38。C，1min;延伸72°C，1.5min，如此反复35个循环，72。C方燈10min，得，，对J^tffi行1.2%琼月^^繊电泳，0.5ug/ml溴化乙锭溶^fe，禾佣S37、S43、S92扩增的图谱，切掉目的DNA的絲，得RAPD片段ST37、ST43、ST92;C、对RAPD片段进行克隆，方法是首先用PCR，克^i翁lJ^将将RAPD片段ST37、ST43、ST92分别j^妾到pUCnrT载体中，1623。C雜1小时S31夜，得至隨接，；将i^^^f拉伏肠杆菌DH5ci感受态细胞中，S^含有IPTG、X~Gal、Amp的LB琼月默^^^p^h隔夜i歸，形成白色单，然后将单M^含有氨^t霉素的LB液体i^^基中^M夜，得到含有目的DNA片^M粒载体的菌液；取菌^S行RAPD片段的D織序列进行测定，得ST37錄589bp，ST43錄825bp,ST92錄837bp三^h^列片段，它们是ST37的全序列一589bp:1CTTGTC膨GAT薩TCGGT應MT羅酉T願證■■A腿TCCC腿曙81KCT謹CC薩認CGCT認TG蘭,GCMG陽CTT謹GTmTTC皿1S1認T腿腿墜C讓丽TTCCT,腿腿(JCC,TGTTCT應TAG隱ACA241nUGTHTGAGAMTTCMTTGGTCGTTTGTCTTACACACMTAGCTTCGATCCACTTAGATACGTMTC321腦隨廳廳纖觀腐T鹏画TCCTAT画匿GCCC匿AT認ATTT401TGATGATTAGMTTCGATTAGGTGGCATCATATTTCATTTG&MATGTTTCATMUGTTAACMCKGAACMGACTTA481CMT應TT薩CCTT丽A醒K眼TAAAA謹薦C廳TTTTKA曙TCT腿画SSI薩謹画G磁TT画K;;ST43的全序列一825bp:<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>3、根据权利要求2所述的用于山茱萸品种鉴定的DNA片段的制备方法，其特征在于，所说的审lj^ii^^态细胞是1)将f.coh^f杆^ffi株以线鄉式凃ttLBJt^^p社，37。Cig^过繊f^S的克隆；2)挑单克隆至2mlS0Bi^^基中，37°C，160r/min，摇菌过夜(12-14小时)成聯基的菌瓶3)在250ml瓶中装50mlSOBi^^基，,将过夜i歸的菌^^f中于i^^基中，其接种比例每100gi^^基中^t歸的菌液lml(100:1),37°C摇菌至—约0.35，在冰i^爐10她4)将菌^t移到5ml的离心管中，3500rpm离心10-15^H中后，弃上清液，让沉淀物尽可能真空千燥，加4mlSolutionB悬浮菌体，得到感^^细胞，按100"1/支^m存管中，方JtA—7(TC保存。4、根据权利要求2所述的用于山茱萸品种鉴定的DNA片段的制备方法，其特征在于，所说的对感^^细胞的转化是1)200Pl感^^细胞，置于冰上，完儘冻后轻轻将细胞均匀悬浮，力口入IO"雜她雜混匀，冰JJ嫘30併中；2)42。C水^^60秒，冰J^ffl2么H中，加400ylS0CJ^^基，37°C，200250r/min1小时；3)室温下4000rpm离心5^!中，用枪头鹏400ii1上清夜，用乘除的土^#基将细,孚；4)将细菌涂^S予!5feffl20"1100mmol/LIPTC和100u120mg/mlX-gal涂布的含有氨精霉素的LB歸舒社；5)平板在37"C下正向方嫘1小时以吸鹏多的液体，然后倒置i^l夜；6)选IPTG/X-gal平W:生长的白色M，用牙^^侄^M^ffi霉素的LB液体if^基，37。Ct^l夜，得到含有目的DNA片^^粒载体的菌液。5、根据权利要求2所述的用于山茱萸品种鉴定的DNA片段的制备方法，其特征在于，所说的IPTG溶液的配法将2g的IPTG溶于8ml水中，用水调节体积J(J10ml，用0.22um的一次性滤微滤除菌，^j^lml小份，-20。C條臓的X"Gal的储存離将X"Gal溶于二甲基甲醐安中，酉诚20mg/ml、鹏的溶液，装于l^i中職丙烯管中，装溶液的管应以锡箔條以防ihJE光使X"Gal穀帔坏，-20。C保存，该溶液不必过滤除衝附兑的1^^^2板是由16;1^#基制成，LB培养基为配帝晦升i^^基，鹏950ml去离子水中加入腐七蛋白胨10g，酵母(物5g，NaCllOg，摇动容器1^溶质溶解，用5mol/LNaOH约0.2ml调pH值至7.0，用去离子水定容至1L，在15psi高压下蒸n^菌20min，将液体i^^超到Ai^g^皿中放凉，凝固形成平板状。6、根据权利要求3所述的用于山茱萸品种鉴定的DNA片段的制备方法，其特征在于，附兑的SOBi^^基为配制每升:tg^基，在950ml去离子水中加入，胰化蛋白胨20g，酵母提取物5g，NaClO.5g，摇动容器使溶质完全溶解，加10ml250mmo1/LKC1溶液，KCL溶液的配制方》战，将1.86gKC1用100ml去离子水溶解即酉诚250ranol/LKC1溶液，用5mol/LNa0H调pH值至7.0，用去离子水定容至1L，在15psi高压下蒸n^菌20min，该溶^j^顿前，力口入5ml灭菌的2mol/LMgCL,2mol/LMga溶液的配制;^接，用90ml去离子7jC溶解19gMgCl2，用去离子7jC调^^只为100ml，在15psi高压T^^:菌20min。7、根据权利要求4所述的用于山茱萸品种鉴定的DNA片段的制备方法，其特征在于，所说的SOCi3g^基为SOCi^^基除含有20mmol/L葡萄糖外，期1M分与S0Bi^^對目同，S0Bit^基经高压灭菌后冷至60。C或60。C以下，力口20ml除菌的lmol/L葡萄糖溶液，lmo1/1葡萄糖溶液的配制方》提:用90ml去离子水溶解18g完全溶解后，用去离子水定容至100ml，用0.22um滤^1滤除菌。全文摘要本发明涉及用于山茱萸品种鉴定的DNA片段及其制备方法，有效解决山茱萸种质资源分析、药材鉴别、杂交育种的问题，解决的技术方案是，该DNA片段为10条5对，即P1/P2-P9/P10，其制备方法是取山茱萸植物叶片研碎，加入PVP粉末研成细粉，将细粉置于提取缓冲液中，离心，弃去上清液，加入用Vc+2×CTAB制成的抽提液以及β-巯基乙醇，混匀，加入由等体积的饱和酚-氯仿-异戊醇制成的溶液处理2次，除去杂质，离心，取上清液，加入异丙醇，收集沉淀物，抽干乙醇，得DNA物质，制备RAPD片段，进行克隆，序列测定，利用设计的5对DNA片段对山茱萸幼苗进行鉴定，方法简单，节省成本，经济和社会效益巨大。文档编号C12Q1/68GK101285099SQ200810049408公开日2008年10月15日申请日期2008年3月25日优先权日2008年3月25日发明者卢小蕾,陈随清申请人:河南中医学院