专利名称：能够用于山茱萸品种鉴定的dna片段及其制备方法
技术领域：
本发明涉及物质，特别是一种能够用于山茱萸品种鉴定的DNA片段及其制备方法。
背景技术：
中药山茱萸，又名山萸肉、萸肉、药枣、枣皮等，是山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.除去果核的干燥成熟果肉，为常用中药材，具有补益肝肾，涩精固脱的功效，主治眩晕耳鸣，腰膝酸痛，阳痿遗精，遗尿尿频，崩漏带下，大汗虚脱，内热消渴等症。山茱萸主产于我国的河南、浙江、陕西等省，四川、安徽、山东亦有栽培，但山茱萸在长期应用和栽培的过程中，种内产生很大变异，出现较多栽培品种，主要表现在这些品种的果实从形状、大小、颜色、重量到产量、干果肉(药材)得率，以及熊果酸、水溶性浸出物、脂溶性浸出物的含量等具有较大的差异，即它们的经济价值和药材质量是明显不同的，由于其药用和商业价值，为确保真品，对其进行鉴定是必要的，随着科技的快速发展，目前基因鉴定已广为应用。
现应用较为广泛的基因遗传标记有形态标记(morphological markers)，细胞标记(cytological markers)、生化标记(biochemical markers)和分子标记(molecμlar markers)。形态标记指植物的外部特征，细胞标记主要是染色体的核型和带型.生化标记主要包括同功酶和贮藏蛋白。这3种标记都是基因表达的结果，是对基因的间接反映，标记数目有限，多态性较差，易受环境条件的影响。而DNA分子标记是直接在DNA分子上检测生物间的差异，是DNA水平遗传变异的直接反映。DNA分子标记能对各个发育时期的个体、各个组织器官甚至细胞作检测，不受环境与基因表达与否的限制，数量极多，遍及整个基因组，多态性高，遗传稳定。所以，DNA分子标记从它诞生之日起，就引起了生物科学家极大的兴趣。在短暂的几十年中，经历了迅猛的发展，分子标记日趋成熟。目前，DNA分子标记技术已广泛用于生物多样性的分析、种质资源的分类演化、遗传图谱的构建、基因的分离测序、作物品种及纯度的鉴定、杂交育种等许多方面，并显示了独到的优势，那么能否利用基因制备用于山茱萸品种鉴定的DNA片段呢？
发明内容
针对上述情况，本发明之目的就是提供一种能够用于山茱萸品种鉴定的DNA片段及其制备方法，可有效解决山茱萸种质资源分析、药材鉴别、杂交育种，防止山茱萸假品出现的问题，其解决的技术方案是，根据分子生物学研究发现，生物类药材所依赖的资源-“物种”的多样性是由于其基因多态性的结果，而基因多态性最直接，最好是在DNA分子水平上进行检测，根据山茱萸遗传基因特征，ST37全长589bp，ST43全长825bp，ST92全长837bp。
其制备方法是取山茱萸植物叶片研碎成细粉，将细粉置于提取缓冲液中，离心，弃去上清夜，再加入用Vc+2×CTAB制成的抽提液以及β-巯基乙醇，混匀，加入由等体积的饱和酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)制成的溶液处理2次，除去杂质，离心，取上清液，加入异丙醇，沉淀，收集沉淀物，抽干乙醇，得DNA物质，再利用DNA物质制备RAPD片段，并对其进行克隆，对克隆后RAPD片段的DNA序列进行测定。本发明利用基因制备用于山茱萸品种鉴定的DNA片段，并可有效用于中药山茱萸的品种改良及新品种选育，可以大大缩短山茱萸品种改良及新品种选育的周期，节省成本。
具体实施例方式 以下结合实际情况对本发明的具体实施方式
作详细说明，由上述技术方案给出，本发明用于山茱萸品种鉴定的DNA片段为ST37全长589bp，ST43全长825bp，ST92全长837bp，其中 ST37全长589bp为ST37的全序列-589bp，具体是 1 CTTGTCTGTG GATGGTGCTC GGTACCGTAA TACGACTCAC TATAGGGCGA CATATGATCG ATGATATCCC ATGGGCGGCC81 GCCTGCAGAC CAGGTCTGAC CGCTTGTCTG TGGATGGTAA GCAAGGGTGA CTTTATGGGT CACACCGTAC TTTTTCATCA 161 AAGCTTCAAA TGATCTATTG CAGAAATATT TTCCTCCATC ACTAATGATA GCCCGAGGTG TTCTAAATCT AGGTAAGACA 241 TTGGTTTTGA GAAATTCAAT GACCACAACA TGGTCGTTTG TCTTACACAC AATAGCTTCG ATCCACTTAG ATACGTAATC 321 TACAGCGACA AGAATATACA AATTACCGAA AGAGTTGGGG AAAGGTCCTA TGAAATCAAT GCCCCAAACA TTGAAGATTT 401 TGATGATTAG AATTCGATTA GGTGGCATCA TATTTCATTT GGAAATGTTT CATAATAGTT AACAACGGGA ACAAGACTTA 481 CAATAAAGCT TGGTATCCTT AAATATGGGG GGCCAATAAA ATCCACACTG CAAAATTTTT GCAGCAATTC TATGATCACT 561 AAAGTGGCCT CTAGTGTGGA TTTTATTGG； ST43全长825bp为ST43的全序列-825bp，具体是 1 TAACCCGGCA GTTGTAATTC GAGCTCGGTA CCGTAATACG ACTCACTATA GGGCGACATA TGATCGATGA TATCCCATGG81 GCGGCCGCCT GCAGACCAGG TCTGGTGATC TTGATTCCTT CCTGCAAGTC ACCTGCTGGC ATGATGTCTT GTTGCAGTGA 161 TGATGTTTGT CGTTGGTTGC TGTGAGATCT TGTTATCCCC TGACTCCTCT AAACATCGTA CCAGGAAGCA TTAAGTGGTG 241 TGGGGGCTGG GCCTGCTTAC GAATGAACTT AACTTTATTT GCTGTGTTGT TATCGCTGCC CTCTTTGCAC TCAGAAAAGC 321 CGTGTTGGCA TCTGTATTGA TTAAGCCGCC CCGACACGAG AATCGGTGTG TTGAGTATTG GCTCTTCCTC CGCTTCCTTA 401 CTCGCTTACC TGCTGCGCTT CGTTCTGCTG CTGCGAGCAG CGTCATCATC TTAGAAAGAT GCAGTAATGT TATTATCCAC 481 ATCATCAAAT AATAACGCAA GAAACAACTT ATGAGCAGAT CGTCATAAGG ACCCCAGCCA CCGAAACGAG GCGTCGCTGC 561 TGCTTTTATT CCATAGCCTC CGCCCCGCTG ACCAGCATAA AAAACAACGA TCCTAAACCA CGTGGCGCCC CCACCCTGGC 641 TCTTACTATG ATGCTTCTCT GTTTCTCCTG TAGAATAGCT CCGTCGTGTG TTCTGAAGCT ACGACGCTGA CTATCAAAGA 721 AATACCTCTC CTTCTTTCTC CCTTCAGGAG GCGCGGTTCT TTTTCATACT GACTGTGGAT TTAAACCTCT GCATCTGCAG 801 GACACCCCTG CCTTTTGGGC TTGTT； ST92全长837bp为ST92的全序列-837bp，具体是 1 CAAAAAACGG CAAGTTGAAT TCAAGCTCGG TACCGTAATA CGACTCACTA TAGGGCGACA TATGATCGAT GATATCCCAT81 GGGCGGCCGC CTGCAGACCA GGTCTCAGCT CACGACAGAG CGGGGAGACA TTGAGATGCC ATCGGTGTGG TCAGCCGGGG 161 CACATCAAAA GGAACTGTCC TCATGGTGGC AGTGGTGCAG GAGTGGCTAG GGGTTTTCAG CACGGACCCA GGCCAGCCAC 241 CGGGACGCAG GCAGATTTCA GACCTCCTCT TCCTTCTCAG ACAGAGGCTT ATGCTCAGAG ATTCCAGTCT GGGAAGGGTG 321 TGGCAGGGAC TTCAGGTCAG CAGACGGGTC CCAGGGGGGG GGTTCCCGGA GAGATCCGCC GCGCACATCC GCGCTTACAG 401 CTGTTCTTGC TGCGCTTGCG GAAGAGGGAG AGGCTTCCAC CGACCCTTCA ATGATCGGGG GTAGGATTGC CTTTGTCACC 481 GTTTTTGCTG ATGCGGTAGT TGCATTGGGA GCCACCGTGC CATACATTGC GAACGATTTT GGAACAGCTT TGACGGTGCT 561 GATTATGCCG ATCGATGTGC CCCCCTCTTG TGAGCATTCC TATGGGCGTG CATGTGGGCC TGGACAGAAG GATGCCACAT 641 ACTGTGGAAA TGACCATTCT CATATGCAAG CTGATATGTG ATTACGTGGG GATCGACAAG GCGAGTCCTG ATATGGAATT 721 TCGTGACGCA TTGGTTGGCC ACATTTGAGG GCTCTCTTGA TTCGATCTGG GTGAAGGGTC AGTAAGAAGA ACAAGATAGA 801 TACGGAAAAT GTTTGTGGGG AGAACACCCC GGACATC。
其生产方法是由以下步骤实现的 (一)、DNA提取方法 (1)取山茱萸植物叶片0.2g放入研钵，加入叶片重量的10％PVP粉末，在液氮中研磨成细粉； (2)将细粉装到1.5ml离心管，加入冷藏的提取缓冲液1200μl(该缓冲液为25mM Tris-HCl，pH＝8.00)，冰上放置10min，8000r/min离心5min，弃去上清液，加入用Vc+2×CTAB制成的抽提液600μl(该抽提液为0.25gVc/ml CTAB，pH＝6.0～6.5；2×CTAB 的组成2％CTAB，100mMTris-HCl，20mMEDTA，1.4MNaCl，pH＝8.0)，再加入50μl β-巯基乙醇，混匀后成混合液，65℃，保温4h，其间不时摇动； (3)将上述装有混合液的离心管取出，4℃，12000r/min，离心15min；取上层溶液，加入等体积的饱和酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1)混匀，4℃，12000r/min离心10min，取上层溶液，然后加入等体积的氯仿-异戊醇混合制成的液体，其氯仿∶异戊醇＝24∶1，在4℃，12000r/min离心10min，重复抽提2次，去其杂质成抽提液； (4)将上述抽提液，加入0.6～1.0倍体积的异丙醇，放置10到30min，生成含有沉淀物的溶液(可放在-20℃冰箱30min～12h，冷冻条件有利于沉淀物的生成)； (5)将上述含有沉淀物的溶液，于4℃，12000r/min离心15min；收集沉淀物，加入300μl 75％乙醇洗涤沉淀，12000r/min离心5min，弃上清液，弃上清液后的沉淀物，再加入300μl 75％乙醇洗涤沉淀，12000r/min离心5min，重复洗涤1次，得到沉淀物； (6)将装有沉淀物的试管置于真空干燥器中5～10min，抽干乙醇(不能太干燥，否则DNA不易水溶)；用50μl去离子水溶解DNA沉淀物，-20℃冰箱保存备用。
(二)、RAPD片段的制备 用上海生工S系列的引物对山茱萸及其栽培品种进行RAPD分析； 反应体系为10×buffer2.5μl，dNTP(2.5mmol/L)3.0μl，Mg2+ (25mmol/L)3.0μl，引物(该引物为S37或S43或S92，浓度为2mmol/L)2.5μl，模板DNA3.0μl(模板DNA为上述(6)步骤中的DNA沉淀物制成)，Taq酶(5U/μl)1.0μl，去离子水10.0μl补足25μl； 扩增反应循环参数为94℃预变性8min，变性94℃，1min；退火38℃，1min；延伸72℃，1.5min，如此反复35个循环，72℃放置10min，得产物。94℃降温到38℃的时间以及从38℃升温到72℃的时间设置均为快速升降温； 对上述产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，0.5μg/ml溴化乙锭溶液染色，在紫外光灯下检测。其中在S37、S43、S92扩增的图谱中分别各有1条特征带ST37、ST43、ST92。用消毒刀片切下目的DNA条带，用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(SK1132，上海生工公司)提取目标条带，得到RAPD片段ST37、ST43、ST92。
(三)、对RAPD片段进行克隆，方法是 1、连接 用上海生工公司的PCR产物克隆试剂盒将RAPD片段ST37、ST43、ST92分别连接到pUCm-T质粒载体中(所说的PCR产物克隆试剂盒为市售产品，由上海生工生产，编号SK2214)，16～23℃连接1小时至过夜(即12-14小时)得连接产物，通常连接1小时即可达到一般研究的要求，保存-20℃冰箱备用，所说的试剂盒反应体系如下表 10μl连接反应体系
2、制备感受态细胞方法是 1)将E.coli大肠杆菌菌株以线状形式涂布在LB培养基平板上，37℃培养过夜获得合适的克隆； 2)挑单克隆至2mlSOB培养基中，37℃，160r/min，摇菌过夜(12-14小时)成培养基的菌液； 3)在250ml瓶中装50mlSOB培养基，随后将过夜培养的菌液接种于培养基中，其接种比例每100g培养基中接培养的菌液1ml(100∶1)，37℃摇菌至A600nm约0.35，在冰上放置10分钟； 4)将菌液转移到5ml的离心管中，3500rpm离心10-15分钟后，弃上清液，让沉淀物尽可能真空干燥，加4mlSolution B(高效制备感受态细胞试剂盒中的试剂，上海生工公司)悬浮菌体，得到感受态细胞。按100μl/支分装冻存管中，放入-70℃保存； 其中上述所说的LB培养基平板是由LB(Luria-Bertani)培养基制成，LB培养基为配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L NaOH(约0.2ml)调pH值至7.0，用去离子水定容至1L，在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20min，将液体培养基倒入培养皿中放凉，凝固形成平板状； 所说的SOB培养基为配制每升培养基，在950ml去离子水中加入，胰化蛋白胨20g，酵提取物5g，NaCl0.5g，摇动容器使溶质完全溶解，加10ml 250mmol/L KCl溶液(将1.86g KCl用100ml去离子水溶解即配成25mml/L KCl溶液)用5mol/L NaOH调pH值至7.0，用去离子水定容至1L。在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌20min，该溶液在使用前，加入5ml灭菌的2mol/L MgCl2[2mol/L MgCl2溶液的配制方法如下用90ml去离子水溶解19g MgCl2，用去离子水调整体积为100ml，在15psi(1.05kg/cm2)高压下蒸汽灭菌2min]； 所说的SOC培养基为SOC培养基除含有20mmol/L葡萄糖外，其他成分与SOB培养基相同，SOB培养基经高压灭菌后冷至60℃或60℃以下，加20ml除菌的1mol/L葡萄糖溶液(1mol/l葡萄糖溶液的配制方法是用90ml去离子水溶解18g葡萄糖，完全溶解后，用去离子水定容至100ml，用0.22um滤器过滤除菌)； 所说的X-Gal的储存浓度将X-Gal溶于二甲基甲酰胺中，配成20mg/ml浓度的溶液，装于玻璃瓶中或聚丙烯管中，装溶液的管应以锡箔包裹以防止见光使X-Gal受到破坏，-20℃保存，该溶液不必过滤除菌； 所说的IPTG溶液的配法将2g的IPTG溶于8ml水中，用水调节体积到10ml，用0.22μm的一次性滤器过滤除菌，分装成1ml小份，-20℃保存。
3、转化 1)200μl感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮。加入10μl连接产物，轻轻混匀。冰上放置30分钟； 2)42℃水浴热激60秒，冰上放置2分钟。加400μlSOC培养基，37℃，200～250r/min振荡培养1小时； 3)室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400μl上清夜，用剩余的培养基将细胞悬浮； 4)将细菌涂布在预先用20μl 100mmol/L IPTC和100μl20mg/mlX-gal涂布的含有氨苄青霉素的LB培养基平板上； 5)平板在37℃下正向放置1小时以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜； 6)选择在IPTG/X-gal平板上生长的白色菌落，用牙签挑至含氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养过夜，得到含有目的DNA片段质粒载体的菌液。
(四)、RAPD片段的DNA序列测定 根据实验要求我们选择了直接进行测序法，将含有目的DNA片段质粒载体的新鲜菌液1ml送出测序，测序公司为上海生工公司，ST37全长589bp，ST43全长825bp，ST92全长837bp； ST37的全序列-589bp 1 CTTGTCTGTG GATGGTGCTC GGTACCGTAA TACGACTCAC TATAGGGCGA CATATGATCG ATGATATCCC ATGGGCGGCC81 GCCTGCAGAC CAGGTCTGAC CGCTTGTCTG TGGATGGTAA GCAAGGGTGA CTTTATGGGT CACACCGTAC TTTTTCATCA 161 AAGCTTCAAA TGATCTATTG CAGAAATATT TTCCTCCATC ACTAATGATA GCCCGAGGTG TTCTAAATCT AGGTAAGACA 241 TTGGTTTTGA GAAATTCAAT CACCACAACA TGGTCGTTTG TCTTACACAC AATAGCTTCG ATCCACTTAG ATACGTAATC 321 TACAGCGACA AGAATATACA AATTACCGAA AGAGTTGGGG AAAGGTCCTA TGAAATCAAT GCCCCAAACA TTGAAGATTT 401 TGATGATTAG AATTCGATTA GGTGGCATCA TATTTCATTT GGAAATGTTT CATAATAGTT AACAACGGGA ACAAGACTTA 481 CAATAAAGCT TGGTATCCTT AAATATGGGG GGCCAATAAA ATCCACACTG CAAAATTTTT GCAGCAATTC TATGATCACT 561 AAAGTGGCCT CTAGTGTGGA TTTTATTGG； ST43的全序列-825bp 1 TAACCCGGCA GTTGTAATTC GAGCTCGGTA CCGTAATACG ACTCACTATA GGGCGACATA TGATCGATGA TATCCCATGG81 GCGGCCGCCT GCAGACCAGG TCTGGTGATC TTGATTCCTT CCTGCAAGTC ACCTGCTGGC ATGATGTCTT GTTGCAGTGA 161 TGATGTTTGT CGTTGGTTGC TGTGAGATCT TGTTATCCCC TGACTCCTCT AAACATCGTA CCAGGAAGCA TTAAGTGGTG 241 TGGGGGCTGG GCCTGCTTAC GAATGAACTT AACTTTATTT GCTGTGTTGT TATCGCTGCC CTCTTTGCAC TCAGAAAAGC 321 CGTGTTGGCA TCTGTATTGA TTAAGCCGCC CCGACACGAG AATCGGTGTG TTGAGTATTG GCTCTTCCTC CGCTTCCTTA 401 CTCGCTTACC TGCTGCGCTT CGTTCTGCTG CTGCGAGCAG CGTCATCATC TTAGAAAGAT GCAGTAATGT TATTATCCAC 481 ATCATCAAAT AATAACGCAA GAAACAACTT ATGAGCAGAT CGTCATAAGG ACCCCAGCCA CCGAAACGAG GCGTCGCTGC 561 TGCTTTTATT CCATAGCCTC CGCCCCGCTG ACCAGCATAA AAAACAACGA TCCTAAACCA CGTGGCGCCC CCACCCTGGC 641 TCTTACTATG ATGCTTCTCT GTTTCTCCTG TAGAATAGCT CCGTCGTGTG TTCTGAAGCT ACGACGCTGA CTATCAAAGA 721 AATACCTCTC CTTCTTTCTC CCTTCAGGAG GCGCGGTTCT TTTTCATACT GACTGTGGAT TTAAACCTCT GCATCTGCAG 801 GACACCCCTG CCTTTTGGGC TTGTT； ST92的全序列-837bp 1 CAAAAAACGG CAAGTTGAAT TCAAGCTCGG TACCGTAATA CGACTCACTA TAGGGCGACA TATGATCGAT GATATCCCAT81 GGGCGGCCGC CTGCAGACCA GGTCTCAGCT CACGACAGAG CGGGGACACA TTGAGATGCC ATCGGTGTGG TCAGCCGGGG 161 CACATCAAAA GGAACTGTCC TCATGGTGGC AGTGGTGCAG GAGTGGCTAG GGGTTTTCAG CACGGACCCA GGCCAGCCAC 241 CGGGACGCAG GCAGATTTCA GACCTCCTCT TCCTTCTCAG ACAGAGGCTT ATGCTCAGAG ATTCCAGTCT GGGAAGGGTG 321 TGGCAGGGAC TTCAGGTCAG CAGACGGGTC CCAGGGGGGG GGTTCCCGGA GAGATCCGCC GCGCACATCC GCGCTTACAG 401 CTGTTCTTGC TGCGCTTGCG GAAGAGGGAG AGGCTTCCAC CGACCCTTCA ATGATCGGGG GTAGGATTGC CTTTGTCACC 481 GTTTTTGCTG ATGCGGTAGT TGCATTGGGA GCCACCGTGC CATACATTGC GAACGATTTT GGAACAGCTT TGACGGTGCT 561 GATTATGCCG ATCGATGTGC CCCCCTCTTG TGAGCATTCC TATGGGCGTG CATGTGGGCC TGGACAGAAG GATGCCACAT 641 ACTGTGGAAA TGACCATTCT CATATGCAAG CTGATATGTG ATTACGTGGG GATCGACAAG GCGAGTCCTG ATATGGAATT 721 TCGTGACGCA TTGGTTGGCC ACATTTGAGG GCTCTCTTGA TTCGATCTGG GTGAAGGGTC AGTAAGAAGA ACAAGATAGA 801 TACGGAAAAT GTTTGTGGGG AGAACACCCC GGACATC 。
本发明利用分子鉴定技术，并摸索出有效的方法，进行中药材的真伪鉴定甚至品质上的评价，目前植物总DNA的提取方法已比较完善，可从长期贮存的标本中进行提取、扩增与测序，使中药材的分子鉴别在方法学上得到保证，可以大大缩短山茱萸品种改良及新品种选育的周期，节省成本，对市场产品170例进行测定，准确率为99.89％，故本发明方法简单，节省成本，是山茱萸药材鉴定、品种培育、改良上的一大创造。
序列表
<110>河南中医学院
<120>能够用于山茱萸品种鉴定的DNA片段及其制备方法
<130>能够用于山茱萸品种鉴定的DNA片段及其制备方法
<140>200810049406.3
<141>2008-03-25
<160>3
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>589
<212>DNA
<213>山茱萸科的山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc)
<400>1
cttgtctgtg gatggtgctc ggtaccgtaa tacgactcac tatagggcga catatgatcg60
atgatatccc atgggcggcc gcctgcagac caggtctgac cgcttgtctg tggatggtaa120
gcaagggtga ctttatgggt cacaccgtac tttttcatca aagcttcaaa tgatctattg180
cagaaatatt ttcctccatc actaatgata gcccgaggtg ttctaaatct aggtaagaca240
ttggttttga gaaattcaat gaccacaaca tggtcgtttg tcttacacac aatagcttcg300
atccacttag atacgtaatc tacagcgaca agaatataca aattaccgaa agagttgggg360
aaaggtccta tgaaatcaat gccccaaaca ttgaagattt tgatgattag aattcgatta420
ggtggcatca tatttcattt ggaaatgttt cataatagtt aacaacggga acaagactta480
caataaagct tggtatcctt aaatatgggg ggccaataaa atccacactg caaaattttt540
gcagcaattc tatgatcact aaagtggcct ctagtgtgga ttttattgg589
<210>2
<211>825
<212>DNA
<213>山茱萸科的山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc)
<400>2
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tgggggctgg gcctgcttac gaatgaactt aactttattt gctgtgttgt tatcgctgcc 300
ctctttgcac tcagaaaagc cgtgttggca tctgtattga ttaagccgcc ccgacacgag 360
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aaaacaacga tcctaaacca cgtggcgccc ccaccctggc tcttactatg atgcttctct 660
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<212>DNA
<213>山茱萸科的山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc)
<400>3
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tatgatcgat gatatcccat gggcggccgc ctgcagacca ggtctcagct cacgacagag120
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cgggacgcag gcagatttca gacctcctct tccttctcag acagaggctt atgctcagag300
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ggttcccgga gagatccgcc gcgcacatcc gcgcttacag ctgttcttgc tgcgcttgcg420
gaagagggag aggcttccac cgacccttca atgatcgggg gtaggattgc ctttgtcacc480
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tcgtgacgca ttggttggcc acatttgagg gctctcttga ttcgatctgg gtgaagggtc780
agtaagaaga acaagataga tacggaaaat gtttgtgggg agaacacccc ggacatc 83权利要求
1、一种能够用于山茱萸品种鉴定的DNA片段，其特征在于，该片段为三部分ST37，全长589bp，ST43，全长825bp，ST92，全长837bp，其中ST37，全长589bp为ST37的全序列-589bp
1 CTTGTCTGTG GATGGTGCTC GGTACCGTAA TACGACTCAC TATAGGGCGA CATATGATCG ATGATATCCC ATGGGCGGCC
81 GCCTGCAGAC CAGGTCTGAC CGCTTGTCTG TGGATGGTAA GCAAGGGTGA CTTTATGGGT CACACCGTAC TTTTTCATCA
161 AAGCTTCAAA TGATCTATTG CAGAAATATT TTCCTCCATC ACTAATGATA GCCCGAGGTG TTCTAAATCT AGGTAAGACA
241 TTGGTTTTGA GAAATTCAAT GACCACAACA TGGTCGTTTG TCTTACACAC AATAGCTTCG ATCCACTTAG ATACGTAATC
321 TACAGCGACA AGAATATACA AATTACCGAA AGAGTTGGGG AAAGGTCCTA TGAAATCAAT GCCCCAAACA TTGAAGATTT
401 TGATGATTAG AATTCGATTA GGTGGCATCA TATTTCATTT GGAAATGTTT CATAATAGTT AACAACGGGA ACAAGACTTA
481 CAATAAAGCT TGGTATCCTT AAATATGGGG GGCCAATAAA ATCCACACTG CAAAATTTTT GCAGCAATTC TATGATCACT
561 AAAGTGGCCT CTAGTGTGGA TTTTATTGG；
ST43，全长825bp为ST43的全序列-825bp
1 TAACCCGGCA GTTGTAATTC GAGCTCGGTA CCGTAATACG ACTCACTATA GGGCGACATA TGATCGATGA TATCCCATGG
81 GCGGCCGCCT GCAGACCAGG TCTGGTGATC TTGATTCCTT CCTGCAAGTC ACCTGCTGGC ATGATGTCTT GTTGCAGTGA
161 TGATGTTTGT CGTTGGTTGC TGTGAGATCT TGTTATCCCC TGACTCCTCT AAACATCGTA CCAGGAAGCA TTAAGTGGTG
241 TGGGGGCTGG GCCTGCTTAC GAATGAACTT AACTTTATTT GCTGTGTTGT TATCGCTGCC CTCTTTGCAC TCAGAAAAGC
321 CGTGTTGGCA TCTGTATTGA TTAAGCCGCC CCGACACGAG AATCGGTGTG TTGAGTATTG GCTCTTCCTC CGCTTCCTTA
401 CTCGCTTACC TGCTGCGCTT CGTTCTGCTG CTGCGAGCAG CGTCATCATC TTAGAAAGAT GCAGTAATGT TATTATCCAC
481 ATCATCAAAT AATAACGCAA GAAACAACTT ATGAGCAGAT CGTCATAAGG ACCCCAGCCA CCGAAACGAG GCGTCGCTGC
561 TGCTTTTATT CCATAGCCTC CGCCCCGCTG ACCAGCATAA AAAACAACGA TCCTAAACCA CGTGGCGCCC CCACCCTGGC
641 TCTTACTATG ATGCTTCTCT GTTTCTCCTG TAGAATAGCT CCGTCGTGTG TTCTGAAGCT ACGACGCTGA CTATCAAAGA
721 AATACCTCTC CTTCTTTCTC CCTTCAGGAG GCGCGGTTCT TTTTCATACT GACTGTGGAT TTAAACCTCT GCATCTGCAG
801 GACACCCCTG CCTTTTGGGC TTGTT；
ST92，全长837bp为ST92的全序列-837bp
1 CAAAAAACGG CAAGTTGAAT TCAAGCTCGG TACCGTAATA CGACTCACTA TAGGGCGACA TATGATCGAT GATATCCCAT
81 GGGCGGCCGC CTGCAGACCA GGTCTCAGCT CACGACAGAG CGGGGAGACA TTGAGATGCC ATCGGTGTGG TCAGCCGGGG
161 CACATCAAAA GGAACTGTCC TCATGGTGGC AGTGGTGCAG GAGTGGCTAG GGGTTTTCAG CACGGACCCA GGCCAGCCAC
241 CGGGACGCAG GCAGATTTCA GACCTCCTCT TCCTTCTCAG ACAGAGGCTT ATGCTCAGAG ATTCCAGTCT GGGAAGGGTG
321 TGGCAGGGAC TTCAGGTCAG CAGACGGGTC CCAGGGGGGG GGTTCCCGGA GAGATCCGCC GCGCACATCC GCGCTTACAG
401 CTGTTCTTGC TGCGCTTGCG GAAGAGGGAG AGGCTTCCAC CGACCCTTCA ATGATCGGGG GTAGGATTGC CTTTGTCACC
481 GTTTTTGCTG ATGCGGTAGT TGCATTGGGA GCCACCGTGC CATACATTGC GAACGAGGTT GGAACAGCTT TGACGGTGCT
561 GATTATGCCG ATCGATGTGC CCCCCTCTTG TGAGCATTCC TATGGGCGTG CATGTGGGCC TGGACAGAAG GATGCCACAT
641 ACTGTGGAAA TGACCATTCT CATATGCAAG CTGATATGTG ATTACGTGGG GATCGACAAG GCGAGTCCTG ATATGGAATT
721 TCGTGACGCA TTGGTTGGCC ACATTTGAGG GCTCTCTTGA TTCGATCTGG GTGAAGGGTC AGTAAGAAGA ACAAGATAGA
801 TACGGAAAAT GTTTGTGGGG AGAACACCCC GGACATC。
2、权利要求1所述的能够用于山茱萸品种鉴定的DNA片段的制备方法，其特征在于，由以下步骤实现
A、提取DNA，方法是
(1)取山茱萸植物叶片0.2g放入研钵，加入叶片重量的10％PVP粉末，在液氮中研磨成细粉；
(2)将细粉装到1.5ml离心管，加入冷藏的提取缓冲液1200μl，该缓冲液为25mM Tris-HCl，pH＝8.00，冰上放置10min，8000r/min离心5min，弃去上清液，加入用Vc+2×CTAB制成的抽提液600μl，该抽提液为0.25gVc/ml CTAB，pH＝6.0～6.5；2×CTAB的组成2％CTAB，100mMTris-HCl，20mMEDTA，1.4MNaCl，pH＝8.0，再加入50μl β-巯基乙醇，混匀后成混合液，65℃，保温4h，其间不时摇动；
(3)将上述装有混合液的离心管取出，4℃，12000r/min，离心15min；取上层溶液，加入等体积的饱和酚-氯仿-异戊醇混匀，饱和酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1，4℃，12000r/min离心10min，取上层溶液，然后加入等体积的氯仿-异戊醇混合制成的液体，其氯仿∶异戊醇＝24∶1，在4℃，12000r/min离心10min，重复抽提2次，去其杂质成抽提液；
(4)将上述抽提液，加入0.6～1.0倍体积的异丙醇，放置10到30min，生成含有沉淀物的溶液，放在-20℃冰箱内冷冻30min～12h；
(5)将上述含有沉淀物的溶液，于4℃，12000r/min离心15min；收集沉淀物，加入300μl 75％乙醇洗涤沉淀，12000r/min离心5min，弃上清液，弃上清液后的沉淀物，再加入300μl 75％乙醇洗涤沉淀，12000r/min离心5min，重复洗涤1次，得到沉淀物；
(6)将装有沉淀物的试管置于真空干燥器中5～10min，不能太干燥，否则DNA不易水溶；用50μl去离子水溶解DNA沉淀物，-20℃冰箱保存备用；
B、制备RAPD片段，方法是
将上述用去离子水溶解的DNA沉淀物，置于反应体系中进行反应，方法是用10×buffer 2.5μl，dNTP 3.0μl，Mg2+ 3.0μl，引物2.5μl，DNA沉淀物3.0μl，Taq酶1.0μl，去离子水10.0μl补足25μl成反应体系，94℃预变性8min，变性94℃，1min；退火38℃，1min；延伸72℃，1.5min，如此反复35个循环，72℃放置10min，得产物，对产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，0.5μg/ml溴化乙锭溶液染色，利用S37、S43、S92扩增的图谱，切下目的DNA的条带，得RAPD片段ST37、ST43、ST92；
C、对RAPD片段进行克隆，方法是
首先用PCR产物克隆试剂盒将将RAPD片段ST37、ST43、ST92分别连接到pUCm-T载体中，16～23℃连接1小时至过夜，得到连接产物；将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，再在含有IPTG、X-Gal、Amp的LB琼脂培养基平板上隔夜培养，形成白色单菌落，然后将单菌落在含有氨苄青霉素的LB液体培养基中培养过夜，得到含有目的DNA片段质粒载体的菌液；取菌液进行RAPD片段的DNA序列进行测定，得ST37全长589bp，ST43全长825bp，ST92全长837bp三个全序列片段。
3、根据权利要求2所述的能够用于山茱萸品种鉴定的DNA片段的制备方法，其特征在于，所说的制备感受态细胞是
1)将E。coli大肠杆菌菌株以线状形式涂布在LB培养基平板上，37℃培养过夜获得合适的克隆；
2)挑单克隆至2mlSOB培养基中，37℃，160r/min，摇菌过夜成培养基的菌液；
3)在250ml瓶中装50mlSOB培养基，随后将过夜培养的菌液接种于培养基中，其接种比例每100g培养基中接培养的菌液1ml，37℃摇菌至A600nm约0.35，在冰上放置10分钟；
4)将菌液转移到5ml的离心管中，3500rpm离心10-15分钟后，弃上清液，真空干燥，加4mlSolution B悬浮菌体，得到感受态细胞，按100μl/支分装冻存管中，放入-70℃保存。
4、根据权利要求2所述的能够用于山茱萸品种鉴定的DNA片段的制备方法，其特征在于，所说的对感受态细胞的转化是
1)200μl感受态细胞，置于冰上，完全解冻后轻轻将细胞均匀悬浮，加入10μl连接产物，轻轻混匀，冰上放置30分钟；
2)42℃水浴热激60秒，冰上放置2分钟，加400μl SOC培养基，37℃，200～250r/min振荡培养1小时；
3)室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400μl上清夜，用剩余的培养基将细胞悬浮；
4)将细菌涂布在预先用20μl 100mmol/L IPTC和100μl20mg/mlX-gal涂布的含有氨苄青霉素的LB培养基平板上；
5)平板在37℃下正向放置1小时以吸收过多的液体，然后倒置培养过夜；
6)选择在IPTG/X-gal平板上生长的白色菌落，用牙签挑至含氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃培养过夜，得到含有目的DNA片段质粒载体的菌液。
5、根据权利要求2所述的能够用于山茱萸品种鉴定的DNA片段的制备方法，其特征在于，所说的X-Gal的储存浓度将X-Gal溶于二甲基甲酰胺中，配成20mg/ml浓度的溶液，装于玻璃瓶中或聚丙烯管中，装溶液的管应以锡箔包裹以防止见光使X-Gal受到破坏，-20℃保存，该溶液不必过滤除菌；所说的IPTG溶液的配法将2g的IPTG溶于8ml水中，用水调节体积到10ml，用0.22μm的一次性滤器过滤除菌，分装成1ml小份，-20℃保存；所说的LB培养基平板是由LB培养基制成，LB培养基为配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g，摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L NaOH约0.2ml调pH值至7.0，用去离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌20min，将液体培养基倒入培养皿中放凉，凝固形成平板状。
6、根据权利要求3所述的能够用于山茱萸品种鉴定的DNA片段的制备方法，其特征在于，所说的SOB培养基为配制每升培养基，在950ml去离子水中加入，胰化蛋白胨20g，酵母提取物5g，NaCl0.5g，摇动容器使溶质完全溶解，加10ml 250mmol/L KCl溶液用5mol/L NaOH调pH值至7.0，用去离子水定容至1L，在15psi高压下蒸汽灭菌20min，该溶液在使用前，加入5ml灭菌的2mol/L MgCl2，2mol/L MgCl2溶液的配制方法是，用90ml去离子水溶解19g MgCl2，用去离子水调整体积为100ml，在15psi高压下蒸汽灭菌20min。
7、根据权利要求4所述的能够用于山茱萸品种鉴定的DNA片段的制备方法，其特征在于，所说的SOC培养基为SOC培养基除含有20mmol/L葡萄糖外，其他成分与SOB培养基相同，SOB培养基经高压灭菌后冷至60℃或60℃以下，加20ml除菌的1mol/L葡萄糖溶液该1mol/l葡萄糖溶液的配制方法是，用90ml去离子水溶解18g葡萄糖，完全溶解后，用去离子水定容至100ml，用0.22um滤器过滤除菌。
全文摘要
本发明涉及能够用于山茱萸品种鉴定的DNA片段及其制备方法，可有效解决山茱萸种质资源分析、药材鉴别、杂交育种的问题，解决的技术方案是，该DNA片段为ST37全长589bp，ST43全长825bp，ST92全长837bp，其制备方法是，取山茱萸植物叶片研碎，加入PVP粉末研成细粉，将细粉置于提取缓冲液中，离心，弃去上清夜，加入用Vc+2×CTAB制成的抽提液以及β-巯基乙醇，混匀，加入由等体积的饱和酚-氯仿-异戊醇制成的溶液处理2次，除去杂质，离心，取上清液，加入异丙醇，收集沉淀物，抽干乙醇，得DNA物质，制备RAPD片段，进行克隆，对克隆后DNA序列测定，方法简单、科学，经济和社会效益巨大。
文档编号C12Q1/68GK101285098SQ20081004940
公开日2008年10月15日 申请日期2008年3月25日 优先权日2008年3月25日
发明者陈随清, 卢小蕾 申请人:河南中医学院