专利名称：重组cecA-mil杂合基因抗菌肽的制作方法
技术领域：
本发明重组cecA-mil杂合基因抗菌肽用于生物技术制药工业中的基因工程 生产疫苗药物的技术领域。
背景技术：
在青霉素发现以来，抗生素在预防细菌感染、治疗畜禽疾病等方面发挥了 重要作用。特别是p-内酰胺类抗生素的发现，对病原菌感染性疾病的治疗产生 了革命性飞跃，抗生素成为临床治疗的强有力武器。我国畜牧养殖业发展迅速，
抗生素发挥了不可低估的作用，但抗生素的长期广泛滥用，不仅导致了严重的 病原菌耐药性问题，而且也造成了药物存留等公共卫生隐疾。许多耐药性突变 菌株出现，大大增加了疾病治疗的困难，我们面临重新回到无抗生素时代的危 险。 '
其实，就临床来说，抗生素耐药性问题不是近年才发现的新问题，早在1947 年，抗生素耐药性的传播就已受到美国疾控中心(CDC)、英国疾病救治中心 (CDCS)的关注。据资料显示，甲氧西林、万古霉素、氨苄/羧苄青霉素、庆大 霉素、红霉素、ciprofloxacin等抗生素耐药性比例逐年增加。微生物的耐药性 问题成为困扰医学界及养殖业的头号问题之一。
资料显示，抗生素添加剂的大量使用，不仅造成了畜禽肠道微生物平衡失 调，并且容易导致抗生素残留，降低畜产品品质，严重影响了畜(禽)产品的 出口及人类的身体健康。就我国而言，由于药物残留监控体系失控，动物源性 食品的出口一直是险象环生。欧盟多次农药、药物残留等问题对我国闭关或退 货赔偿，日本、美国等分别对我国动物源性食品提出了 ll种药物残留检测要求， 瑞士对我国禽肉的禁令和解禁更是反复无常。随着我国加入WTO，传统的抗生素伺料添加剂必将严重影响我国的家畜产品在国际市场的竞争力。
为了消除抗生素应用带来的负面影响，减少和杜绝耐药株的出现和传播， 世界卫生组织呼吁各国采取紧急措施。美国、英国等许多国家都制定了相应的
措施。根据欧盟第70/524号令的精神，传统抗生素将在很多时间内被逐一取消， 阿伏霉素、螺旋霉素、杆菌肽锌、磷酸泰乐菌素等抗生素涉及到抗药性传递问 题，禁作饲料添加剂用，并逐步取消在饲料中添加抗生素。我国农业部也出台 了一系列关于"兽药使用监督和兽药残留监控"、"出口动物及动物产品防疫检 疫"、"食品动物禁用的兽药及其他化合物清单"等多项整改措施。
面对问题的严峻性，研制和应用无毒无公害的新型抗菌剂，代替抗生素在 饲料添加剂及畜禽疾病预防中的应用，已成为当前兽医工作者的一项重要内容。 近期的研究发现，抗菌肽不但广潜抗菌，能抑杀耐药性菌株，而且它的杀菌机 制使病原菌不易产生耐药性突变，从而成为最具有开发前景的抗生素替代品之 一，为解决细菌耐药性这一棘手难题提供了新途径。
抗菌肽是生物体产生的一种阳离子小肽，多数具有广潜抗菌活性，是生物 先天性免疫的重要组成成分。抗菌肽的本质是一种肽，和其他蛋白质药物一样， 主要通过降解、排泄、以及受体介导的内吞等作用方式在体内被清除。由于其 分子量小于20kDa，代谢过程中易于由肾小球滤过，并在通过肾小管时被蛋白酶 部分降解而从尿中排出。至今，已有许多生物包括昆虫、鸟类、动物、植物及 原核生物中发现1000多种抗菌活性肽。抗菌肽的来源有3种天然资源提取、 人工固相合成及基因工程表达。从天然资源中提取的抗菌肽成本高、得率低、 工序繁琐；人工固相合成肽又价格相当昂贵，都难以应用于实际临床。由于抗 菌肽基因一般都较小，故采用人工合成的方法来获得目的基因，再通过基因工 程方法进行微生物发酵生产抗菌肽则更具有实际意义。
发明内容
技术问题
本研究的目的就是应用基因工程和蛋白质工程技术研制出具有良好抑杀各
种致病性细菌的重组cecA-mil杂合基因抗菌肽，为抗生素研制出合适的替代品， 也可以成为无公害的饲料添加剂，为重组抗菌肽的工程化生产及其为养殖业的 保驾护航奠定基础。
技术方案
重组cecA-mil杂合基因抗菌肽，包括
l)重组杂合抗菌肽cecA-mil的基因设计与合成
选取天蚕素A (cecropin)成熟肽段1 7个氨基酸和蜂毒素milittin 成熟肽段N端的5 12个氨基酸，设计两个引物片断F1和F2、 F3和F4，以 Fl序列和F2序列片断互为模板和互为引物进行S0E法PCR出改造的 cecA-mil杂合肽基因序列(45个碱基)。
EcoRIkex2 KWKLFKKVLKVLTTG--Fl -
5， JAATTCl GAGAAMGA AAG TGG AM CTG TTC AAA AAG GTG CTG MG GTG CTG ACC ACC GGC TAA @3'
3' § CTCTTTTCT TTC ACC TTT GAC AAG TTT TTC CAC GAC TTC CAC GAC TGG TGG CCG ATT |AGATCJ5'
-F2 -
Xbal
设计的CecA-mil基因全长60bp，包括15个氨基酸的编码序列和终止密码 子，基因N端、C端分别设有EcoRI、 Xbal粘性末端，并在基因的N端引入毕 赤酵母Kex2蛋白酶裂解位点。
引物基F3和F4用于重组载体及重组酵母菌的鉴定，其中F3位于载体序列 上，F4则位于插入外源基因(cecA-mil)区。
F3: 5 ，-tactttcataattgcgactg-3'
F4: 5 ，画ccttcttgaacaacttcc-3 ，2) 重组表达载体的构建
cecA-mil杂合肽基因经PCR产物纯化试剂盒纯化后，直接进行WoI、 X6al 双酶切，定向插入酵母表达载体pPICZa-A中，构建cecA-mil重组酵母表达质 粒。经Zeocin筛选、特异PCR鉴别和缺失酶切位点鉴定阳性的质粒命名为 pPICZa-A-CM。经TaKaRa测序，所合成基因序列与设计序列完全一致。
3) 重组菌株的转化
将测序正确的重组质粒转化酵母菌X-33， X-33感受态的制备、重组酵母的 电击转化按invitrogen公司酵母表达手册Easy Select Pichia Expression Kit进
行操作。
将S"cl线性化的重组质粒pPICZa-A-CM电转化导入X-33感受态细胞，涂 布于含Zeocin 的YPDS/Z+固体选择培养基上，3(TC培养2 4天，转化子出现。 将具有Zeocin抗性的最初转化子菌落，通过影印法克隆到MM平板和MD平板 上培养，选择在两种培养基上都生长良好的Mut+菌落，进一步依次转移到含 Zeocin不同浓度的YPDS平板上，逐级筛选目的基因高拷贝重组菌株。将筛选 到的高拷贝重组菌株取单菌落的一半放到Eppendof管中，加入50(aLTE(pH8.0)， 采用煮-冻-煮法制备毕赤酵母基因组DNA，利用鉴定引物F3、 F4进行PCR鉴 定。
4)重组抗菌肽蛋白的表达及其抑菌活性的鉴定
将筛选到的阳性酵母菌在接种于含一定浓度甲醇的BMMY培养基中进行诱 导表达。28°C， 250r/min培养72h，期间每24小时补加终浓度为0.5% (v/v)的 甲醇。离心收集培养上清，进行抑菌活性测定和Tricine-SDS-PAGE鉴定。采用 标准琼脂孔穴扩散法，以标准菌株和耐药菌株为实验菌株，进行抑菌活性测定， 同时设立空载体酵母浓縮上清作阴性对照，Amp为阳性对照。有益效果1. 表达体系可行抗菌肽本身对原核宿主菌的杀伤作用，不适合在原核系统中直接表达，一般选用融合表达或真核表达。在此，我们选用Pichiapastoris系统，巴斯德毕赤 酵母表达体系兼具有原核表达系统的高表达量和真核表达系统可进行蛋白翻译后修饰、加工及折叠的优点；又不存在原核表达系统中内毒素难以去除和哺乳 动物细胞表达系统中病毒和支原体污染等问题，在表达外源活性蛋白中倍受青 睐。影响外源基因表达水平的因素很多，而密码子的选择是左右表达量的参数 之一。我们选用毕赤酵母偏好密码子，兼顾大肠杆菌偏好性，消除潜在的糖基 化位点，设计并合成了新型杂合抗菌肽cecA-mil基因。对抗菌肽基因修饰和密 码子优化，不仅可提高抗菌肽在毕赤酵母中的表达效率，还可以避免部分专利 的限制，这是建立具有自主知识产权的新产品所必须考虑的因素。2. 本发明可大量生产关于抗菌肽的表达研究，目前存在一个问题:不论是在微生物中表达，还是 在植物、昆虫中表达,表达量都偏低，固相合成肽又价格相当昂贵，不适合我国 国情，都难以应用于实际临床。这成了抗菌肽走向产业化的限制因素。抗菌肽 若要走向产业化,必须建立其高效表达体系和快速纯化系统。本发明抗菌肽较小，故采用人工合成的方法来获得目的基因，再通过基因 工程方法进行微生物发酵生产抗菌肽更切实可行，具有实际意义，大量生产发 酵具有很好的应用前景。初步的抗菌活性测定结果显示，该重组抗菌肽对标准 菌株和耐药菌株均具有明显的杀菌活性。对抗菌肽基因进行修饰和密码子优化， 除了可以提高重组抗菌肽的表达量、确保抗菌活性外，还可以避免部分专利限制，这是建立具有自主知识产权的新产品所必需考虑的因素。3. 生产成本低，易推广本研究研制的基因工程抗菌肽生产成本低廉，所用的表达载体pPICZa-A， 其表达盒的N端带有引导分泌的cc-交配因子(a-MF)信号肽序列，表达产物可 以分泌到细胞外的培养基中。由于酵母本身分泌到培养基中的蛋白很少，因此 表达上清中的杂蛋白含量很低，为进一步纯化重组蛋白提供了极大的方便。所 需要的培养基和发酵用的实验设备均具有价格低廉和易于操作的优点，十分适 于推广。4. 安全有效酵母不会分泌像大肠杆菌表达的外源蛋白那样附带一些对机体细胞有毒害 的物质，而且，许多资料显示，抗菌肽也不会像抗生素一样产生耐药性，因为 抗菌肽是蛋白质药物，而抗生素是化学药物。由该重组抗菌肽对标准菌株和耐 药菌株的抑菌活性结果可知，虽然和工作浓度的氨苄青霉素相比，该重组杂合 抗菌肽对标准菌株的抑菌直径相对较小，但对耐药菌株的抑菌效果明显比氨苄 青霉素好，除了对大肠杆菌显示有抗菌活性外，对其它革兰氏阳性菌以及革兰 氏阴性菌也具有明显的杀菌活性，再加上无残留、不会诱导耐药性产生的特点， 使其在食品防腐、和动物饲料添加剂等方面具有很好的应用前景。
图1:重组cecA-mil杂合抗菌肽的Tricine-SDS-PAGELaneh X-33/pPICZa-A空载体所表达上清，Lane 2: X-33/pPICZa-A-CM所表达 上清，Lane 3:低分子量蛋白质Marker, (Marker,从上到下依次为97.4， 66.2， 43.0， 31.0， 20.1， 14.4KD，购于sigma公司。 图2:重组抗菌肽对标准菌株E.coli抑菌活性测定1、 2、 3均为青霉素阳性对照，剂量分别为100ng/ml、 50pg/ml、 10昭/ml， 4、 5均为重组抗菌肽cecA-mill所表达的上清，6 X-33/pPICZa-A空载体所表达的 上清对照，7X-33宿主菌表达上清对照。 图3:重组抗菌肽对耐药菌株E.coli抑菌活性测定1、 2均为青霉素阳性对照，剂量均为100ng/ml， 3、 4均为重组抗菌肽cecA-mi11 所表达的上清，5X-33/pPICZoc-A空载体所表达的上清对照，6X-33宿主菌表达上清对照。图4:重组cecA-mil杂合基因抗菌肽发明的实施过程图1重组抗菌肽基因的设计、SOE法PCR扩增、纯化，2重组抗菌肽表达质 粒的构建、酶切鉴定和PCR鉴定，3重组抗菌肽菌株的转化、鉴定和髙拷贝基 因重组菌株筛选，4重组抗菌肽的表达、抑菌活性鉴定。重组cecA-mi I杂合基因抗菌肽的核酸和氨基酸序列表〈110>瑞普(保定)生物药业有限公司 <120〉重组cecA-mil杂合基因抗菌肽 <140> 200810054665.5 〈141〉 2008-03-21 〈160〉 5〈170〉 Patentln version 3.3〈210> SEQ. ID. NO. 1〈211〉 63〈212> DNA〈213〉人工序列〈220〉<221> gene 〈222> (1)…(63) 〈400〉 1aattcg卿a a卿aagtgg ,ctgttca aaaaggtgct gaaggtgctg accaccggct 60 aat 63〈210〉 SEQ. ID. NO. 2 〈211> 63 〈212〉腿 <213>人工序列 〈220>〈221〉 gene 〈222〉 (1)…(63) 〈400> 2gctcttttct ttcacctttg acaagttttt atcccacgacttc cacgactggt ggccgattag 6063〈210〉 SEQ. ID. NO. 3〈211> 20 〈212〉 DNA <213>人工序列 〈220〉〈221〉 gene <222> (1)…咖 〈400〉 3tactttcata attgcgactg〈210〉 SEQ. ID. NO. 4 〈211> 18 <212>腿 〈213>人工序列 〈220〉〈221> gene 〈222〉 (1)…(18) 〈400〉 4ccttcttgaa caacttcc〈210> SEQ. ID. NO. 5 <211> 15 〈212〉 PRT 〈213〉人工序列 <220>〈221> aminoacids 〈222〉 (1)…(15) 〈400〉 5<formula>formula see original document page 12</formula>
权利要求
1、重组cecA-mil杂合基因抗菌肽，其特征在于重组cecA-mil杂合抗菌肽的基因设计与合成。根据cecropinA和milittin的氨基酸序列，选用毕赤酵母偏好密码子，利用DNASTAR、primer premier软件设计了引物基因片断F1和F2、F3和F4，引物F1和F2经SOE-PCR扩增出改造的cecA-mil杂合肽基因序列(45个碱基)。设计的CecA-mil基因全长60bp，包括15个氨基酸的编码序列和终止密码子，基因N端、C端分别设有EcoRI、XbaI粘性末端，并在基因的N端引入毕赤酵母Kex2蛋白酶裂解位点。F35’-tactttcataattgcgactg-3’F45’-ccttcttgaacaacttcc-3’引物基F3和F4用于重组载体及重组酵母菌的鉴定，其中F3位于载体序列上，F4则位于插入外源基因(cecA-mil)区。
2、 重组cecA-mil杂合基因抗菌肽，其特征在于重组表达载体的构建。cecA-mil 杂合肽基因纯化后，直接进行^7 o1、 ^al双酶切，定向插入酵母表达载体 pPICZa-A中，构建cecA-mil重组酵母表达质粒。经Zeocin筛选、特异PCR鉴 别和缺失酶切位点鉴定阳性的质粒命名为pPICZa-A-CM。经TaKaRa测序，所合成基因序列与设计序列完全一致。
3、 重组cecA-mil杂合基因抗菌肽，其特征在于重组菌株的转化。将S"cl线性 化的重组质粒pPICZa-A-CM电转化导入X-33感受态细胞，涂布于含Zeocin 的YPDS/Z+固体选择培养基上培养，将具有Zeocin抗性的最初转化子菌落，通 过影印法克隆到MM平板和MD平板上培养，选择在两种培养基上都生长良好 的Mut+菌落，进一步依次转移到含Zeocin不同浓度的YPDS平板上，逐级筛选 目的基因高拷贝重组菌株。制备筛选到的高拷贝重组菌株基因组DNA，利用鉴 定引物F3、 F4进行PCR鉴定。
4、重组cecA-mil杂合基因抗菌肽，其特征在于重组抗菌肽蛋白抑菌活性的鉴定。 将筛选到的阳性酵母菌在含一定浓度甲醇的BMMY培养基中进行诱导表达。72h 后，离心收集培养上清，进行抑菌活性测定和Tricine-SDS-PAGE鉴定。采用标 准琼脂孔穴扩散法，以￡."//0115(1为实验菌株，进行抑菌活性测定，同时设立 空载体酵母浓縮上清作阴性对照，Amp为阳性对照。分子量为1.8kDa的重组 cecA-mil杂合基因抗菌肽获得表达，且具有明显的抑菌活性。
全文摘要
本发明重组cecA-mil杂合基因抗菌肽，用于生物技术制药工业中的基因工程生产疫苗药物的技术领域。根据天蚕素A和蜂毒素，以毕赤酵母偏爱的密码子设计合成引物，进行SOE法PCR出改造的cecA-mil杂合肽基因序列，同载体pPICZα-A连接后，构建重组酵母表达质粒。经Zeocin筛选、特异PCR鉴别和缺失酶切位点鉴定阳性的质粒命名为pPICZα-A-CM。将重组质粒转化到酵母菌X-33中，筛选目的基因高拷贝重组菌株，在醇氧化酶启动子调控下，1.8kD的重组蛋白获得表达，且具有较为明显的抑菌活性。以此来开发研究该重组抗菌肽的基因工程产品研究。
文档编号C12N15/81GK101323644SQ20081005466
公开日2008年12月17日 申请日期2008年3月21日 优先权日2008年3月21日
发明者冯秀丽, 曹瑞兵, 杨保收, 陈溥言, 鲍恩东 申请人:瑞普(保定)生物药业有限公司